الجينات الاصطياد عن طريق GAL4 في الزرد

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنتاج أسماك طافرة باستخدام ناقلات ترانسبوزون لكسر الجينات مع GAL four و VP 16 كراصد أساسي لمصيدة الجينات. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق الحقن المشترك لناقل مصيدة الجينات مع ترانسبوزون tall two في أجنة أسماك الزيبرا. يتم فحص الأجنة المحقونة للكشف عن فلورة GFP في اليوم الثالث بعد الإخصاب، ويتم اختيار ما يقرب من 30% من الأجنة الأكثر سطوعاً لتأسيس تجمع الجيل F zero.

بعد ذلك، يتم تزاوج أسماك الجيل F zero مع سلالة الفحص U-A-S-M-R-F-P للكشف عن الانتقال الجرثومي لأحداث مصيدة الجينات. وتتمثل الخطوة النهائية في إجراء تزاوج خارجي للجيل F1 لتأسيس الجيل F two وتوليد أجنة للتوصيف الجزيئي لأحداث مصيدة الجينات باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي (inverse PCR) وتقنية 5' RACE. وفي النهاية، من المتوقع أن تنتج سمكة واحدة من كل 10 أسماك F zero مفحوصة ذرية تحمل مصيدة جينات.

تم تصميم ترانسبوزونات كسر الجينات بحيث لا تنتج أي طفرات عند الاندماج في بدايات الجينات المشفرة للبروتين. تستخدم ناقلات GBT الخاصة بنا G four P 16 كـمراسل رئيسي لمصيدة الجينات. يزيد هذا التعديل من الحساسية للجينات التي يتم التعبير عنها بمستويات منخفضة، ويجعل من الممكن لنا استخدام طفرات مصيدة الجينات دون تجنب الأنماط الظاهرية كـمحركات G four للتعبير النوعي للأنسجة لترانسجينات أخرى.

نعتقد أن العائق الرئيسي في طريقتنا يكمن في تحقيق معدلات مرتفعة بما يكفي من دمج مصيدة الجينات في الخط الجرثومي لأسماك الجيل F zero. في هذا العرض التوضيحي، سنغطي عدة خطوات حاسمة، وهي تحضير الـ DNA، والـ MICROINJECTION وفحص الجيل F zero. يستخدم ناقل مصيدة الجينات GBTB one البروتين GAL four VP 16 كمراسل أساسي لمصيدة الجينات.

تُستخدم عناصر النقل Minimal tall two transpose على النهايات من أجل دمج مصيدة الجينات. ويتم الكشف عن أحداث مصيدة الجينات مباشرة بواسطة مراسل EGFP تحت تحكم 14 X GAL four UAS. وتكون كاسيت مصيدة الجينات بأكملها محاطة بمواقع direct locks P.

يجعل هذا أحداث مصيدة الجينات قابلة للعكس من خلال التعبير عن Cree combs لإثبات علاقة السببية بين دمج محدد لمصيدة الجينات والنمط الظاهري الملحوظ. بالإضافة إلى ذلك، تحيط مواقع FRT المباشرة بكاسيت U-A-S-E-G-F-P. وسيؤدي حقن mRNA الخاص بـ flip combs إلى استئصال كاسيت U-A-S-E-G-F-P، مما يترك طفرة مصيدة الجينات غير مميزة بفلورة EGFP، وهذا يتيح استخدامها في الخطوط المعدلة وراثياً التي تميز أنسجة معينة أو أحداثاً نموّية عن طريق فلورة GFP قبل الحقن المجهري.

قم بتحضير الـ transpose على DNA والـ transposes mRNA. ثم قم بتحضير DNA لناقل مصيدة الجينات GBTB one gene trap. باستخدام طقم mini prep قياسي واتباع بروتوكول الشركة المصنعة، من الضروري تضمين خطوة غسيل PB عند تحضير الـ DNA.

وإلا، فإن الـ DNA المستخلص بطريقة الـ mini prep سيكون ملوثاً بـ RNAs، مما يؤدي إلى تحلل الـ mRNA الخاص بالترانسبوزونات. قم بتخفيف الـ DNA في ماء خالٍ من الـ RNAs ليصل التركيز إلى 10 nanograms per microliter. لتحضير الـ mRNA الخاص بالترانسبوزونات الاثنين، قم أولاً بعمل خطية (linearized) لـ PT three TS T two باستخدام xbo one. بعد ذلك، قم بنسخ الـ DNA الخطي باستخدام M message machine T three in vitro transcription kit مع تعديل واحد.

أضف 0.5 µL من مثبط rib lock RNAs بعد خطوة معالجة DNA، ثم قم بتنقية mRNA باستخدام طقم قياسي، وقيم جودة mRNA المنسوخ في المختبر عن طريق الفصل الكهربائي لهلام الأغاروز. خفف mRNA في ماء خالٍ من RNAs ليصل التركيز إلى 40 ng/µL، واحفظه في حصص قدرها 2 µL عند درجة حرارة -80 °C قبل عملية الحقن المجهري مباشرة. قم بتحضير خليط الحقن عن طريق إضافة 8 µL من transpose DNA المخفف إلى حصة قدرها 2 µL من transposes mRNA.

احقن ثلاث nanoliters من خليط D-N-A-R-N-A في مح هذه الأجنة لسمكة الزيبرا باستخدام تقنيات الحقن المجهري القياسية، مستهدفاً الواجهة بين المح والسيتوبلازم. بعد الحقن، قم بتشغيل خمس microliters من محلول الحقن المتبقي على هلام agar بنسبة 1% لضبط الجودة وللتأكد من أن mRNA الخاص بالترانسبوزاز لم يتحلل، وذلك بعد حوالي ست إلى ثماني ساعات من الحقن. أزل الأجنة غير المخصبة والميتة ووزع الأجنة بمعدل 60 إلى 80 جنيناً لكل طبق Petri بقطر 100 millimeter. يتم إزالة الأجنة غير الطبيعية والميتة في اليوم الأول بعد الإخصاب، واليوم الثاني بعد الإخصاب، واليوم الثالث بعد الإخصاب؛ وفي اليوم الثالث بعد الإخصاب، يتم ذلك باستخدام مجهر ستيريو مجهز بفلورسنت أو مجهر قائم.

افحص الأجنة وأزل أي أجنة غير طبيعية. افحص الأجنة المتبقية التي لا تظهر عليها عيوب ظاهرة. وبالنسبة لفلورة GFP، اختر أجنة F zero الأكثر سطوعاً وقم بتربيتها باستخدام إجراءات تربية سمك الزيبرا القياسية المتبعة في هذا المختبر.

عادةً ما تُحقن مصائد الجينات (GBTs) في سلالات ذات أنماط تصبغ برية أو منقوشة (leopard). ومن المتوقع منطقياً أن ينجو ما بين 20 إلى 30% من الأجنة المحقونة المختارة للتربية حتى مرحلة البلوغ. يمكن أن يؤدي دمج ناقل مصيدة الجينات GBTB one إلى تعبير EGFP من خلال آليتين مختلفتين.

تتمثل الحالة الأولى في حدث حقيقي لمصيدة الجينات. يندمج الناقل في جين ما، مما يؤدي إلى تكوين نسخة نسخ اندماجية بين الطرف '5 لنسخة ذلك الجين الداخلي و GAL4 VP16، والتي تترجم لاحقاً إلى بروتين اندماجي يحتوي على الطرف النهائي للبروتين وتغلفه الجين الطافر المدرج و GAL4 VP16. يرتبط هذا البروتين الاندماجي بـ 14 XUAS وينشط نسخ EGFP.

الحدث الثاني الأقل رغبة هو مصيدة المعزز (enhancer trap). حيث يخضع المحفز الأدنى الموجود أمام EGFP لسيطرة معزز بالقرب من موقع التكامل، مما يؤدي إلى إنتاج EGFP في غياب GAL four و VP 16. وللتمييز بين هاتين الفئتين من الأحداث، تم إنشاء خط تحولي 14 X-U-A-S-M-R-F-P مميز بـ GFP لبروتين gamma crystalline الخاص بالعدسة.

يتم التحقق من أحداث مصيدة الجينات عن طريق تهجين الأسماك المحقونة بـ GBT مع أسماك متماثلة الزيجوت من سلالة U-A-S-M-R-F-P وفحص التعبير المشترك لـ GFP و RFP، وهو أمر ممكن فقط في حال تكوين GAL four, VP 16 وتنشيط U-A-S-M-R-F-P في وضع trans. لبدء إجراء فحص أسماك F zero، يتم تهجين كل سمكة F zero مع أسماك متماثلة الزيجوت من سلالة U-A-S-M-R-F-P. وبما أن الأسماك المحقونة بـ GBT تمتلك أنماط تصبغ من النوع البري أو نمط Leopard، بينما تكون سلالة U-A-S-M-R-F-P متماثلة الزيجوت في خلفية brass، فيمكن تمييز أسماك F zero بسهولة عن أسماك U-A-S-M-R-F-P، مما يلغي الحاجة إلى تسجيل ما إذا كانت سمكة F zero التي يتم فحصها ذكراً أم أنثى، وكذلك يتجنب الأخطاء المحتملة الناتجة عن أخطاء التسجيل و/أو تحديد جنس كل سمكة. وفي اليوم التالي.

أعد أسماك U-A-S-M-R-F-P النحاسية إلى حوضها. ضع أسماك F zero التي أنتجت أجنة في أحواض استاتيكية فردية أثناء جمع الأجنة للفحص المجهري، وانقل الأجنة التي تم جمعها إلى أطباق بتري جديدة في مساء اليوم صفر. افحص الأجنة للكشف عن الفلورية لـ GFP و RFP في اليوم الأول واليوم الثالث بعد الإخصاب.

قم بسحب الأجنة الإيجابية لكل من GFP و RFP، وصنفها وفقاً لنمط تعبير G-F-P-R-F-P. في حال ملاحظة أكثر من نمط واحد في الحضنة الواحدة، قم بتربيتها لإنشاء جيل F1. لاحظ أن أجنة 3D PF الإيجابية لـ GFP ولكنها سلبية لـ RFP لا يتم سحبها لأنها تمثل أحداث مصيدة المعزز (enhancer trap events).

قم بتزويج أسماك F zero التي أنتجت ذرية إيجابية لـ G-F-P-R-F-P مرة أخرى للحصول على دفعة ثانية من الإيجابيات. يتم فحص أسماك F1 لإنشاء عائلات F two لتوثيق نمط تعبير gene trap وتجميد دفعات من الأجنة للتحديد الجزيئي لمواقع gene trap. أولاً، قم بتزويج أسماك F1 الفردية مع أسماك U-A-S-M-R-F-P متماثلة الزيجوت في اليوم التالي. ضع أسماك F1 التي أنتجت أجنة في خزانات استاتيكية فردية، بينما يتم جمع الأجنة للفحص بعد يوم واحد من الإخصاب.

قد لا يكون وسم RFP قد ظهر بعد، لذا قم بفحص الأجنة للكشف عن فلورة GFP واسحب الأجنة الموجبة لـ GFP في اليوم الثالث بعد الإخصاب، ثم افحص فلورة كل من GFP و RFP واسحب الأجنة الموجبة لكليهما. بعد ذلك، قم بتصوير الأجنة الموجبة لكل من GFP و RFP في اليوم الخامس بعد الإخصاب، وقم بتجميد مجموعات مكونة من 20 جنينًا موجبة لـ GFP-RFP و20 جنينًا سالبة لـ GFP-RFP لتحديد الجينات الطافرة المدرجة عن طريق inverse PCR و 5 prime race. قم بتربية بقية الأجنة الموجبة لـ GFP-RFP لتأسيس الجيل F2 في حالة نجاح عملية الحقن.

ستظهر درجة ما من فلورة GFP في 80% على الأقل من الأجنة التي حُقنت بمزيج من DNA مصيدة الجينات وmRNA لإنزيم transposase. ويشير انخفاض تعبير GFP إما إلى فشل عملية الحقن أو تحلل RNA الخاص بـ transposase بسبب تلوث RNAs. وعند اختيار الأجنة الأكثر سطوعاً في إيجابية GFP لإنشاء مجموعة F zero، فإن سمكة واحدة تقريباً من كل 10 أسماك F zero تم فحصها ستنتج ذرية تحمل مصيدة الجينات من بين أسماك F zero التي استُعيدت منها أحداث مصيدة الجينات.

ينقل معظمها حدثاً واحداً من مصيدة الجينات بالإضافة إلى عدة عمليات دمج لترانسبوزونات غير معبرة. وبما أن كاسيت مصيدة الجينات بالكامل محاط بمواقع LoxP مباشرة، فإن أي طفرات في مصيدة الجينات الموضحة في هذا المخطط (حيث تمثل الصناديق الزرقاء إكسونات الجين المتحور) يمكن عكسها عن طريق التعبير عن Cre recombinase. تُظهر هذه الصور التعبير المشترك لـ GFP و RFP في الجهاز العصوري لسلالة مصيدة الجينات NSF TP six، ويؤدي حقن Cre RNA في أجنة NSF TP six إلى فقدان التعبير عن GFP و RFP.

لاحظ أنه لا يوجد انخفاض في تعبير GFP في العدسة كما هو متوقع. معظم الإجراءات الموضحة هنا قابلة للتطبيق على عمليات فحص مصيدة الجينات الأخرى، وكذلك تجارب نقل الجينات العادية باستخدام TOL two والترانسبوزونات الأخرى. باستخدام إجراء مصيدة الجينات الموضح هنا، فإن إعداد 20 إلى 30 عملية تهجين عكسي لجيل F zero أسبوعياً يجب أن يؤدي إلى استعادة مصيدة جينية واحدة كل أسبوع.

ومع ذلك، يمكن زيادة نطاق هذا الإجراء بسهولة.