Name: الجينات الاصطياد عن طريق GAL4 في الزرد (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 34 s
Description: تعلم تقنية مصيدة الجينات باستخدام GAL4-VP16 في أجنة سمك الزرد لإنتاج طفرات وظيفية. تُمكّن هذه الطريقة الباحثين من تحليل الجينات وتتبع التعبير الجيني بدقة عالية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

نشكر الدكتورة جنيفر Emtage لقراءة نقدية للمخطوطة، ريان جيل للحصول على المساعدة الفنية والمساعدة في رعاية الزرد والدكتور ستيفن C. Ekker (مايو كلينيك، Rochster، مينيسوتا) للمواد. وقد تم دعم عملنا معبد كلية جامعة العلوم والتكنولوجيا والمعاهد الوطنية للصحة (R01-HD061749).

1. إنتاج الجيل F0 من قبل Microinjection من فخ الجينات. لقد وجدنا أن الأجنة من خلفيات وراثية مختلفة التحمل عرض مختلفة لهذا الإجراء، مع مقرها الحيوانات الأليفة متجر من النوع البري وتوبنجن - طويل القوائم المالية (TLF) كونها الأكثر تسامحا في حين AB وتوبنغن سلالات لها البقاء على قيد الحياة أكثر فقرا. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحمض النووي ينقول. إعداد GBT-B1 (pDB783، Balciuniene آخرون قيد الإعداد) DNA البلازميد باستخدام معيار عدة QIAprep miniprep (في Qiagen 27106). فمن الضروري أن تشمل الخطوة غسل PB (وهو اختياري في الإجراء QIAprep)، وإلا سوف تكون ملوثة عن طريق الحمض النووي miniprep ريبونوكلياز A، مما أدى إلى تدهور مرنا transposase. قبل الحقن، ويخفف من الحمض النووي في ريبونوكلياز خالية من المياه (AMBION AM9937) إلى 10 نانوغرام / ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد transposase مرنا. خطي pT3TS/Tol2 (pDB600) 13 باستخدام XbaI وتدوين الحمض النووي خطي باستخدام آلة mMessage T3(AMBION AM1348) في المختبر عدة النسخ. قمنا بتعديل رد فعل النسخ في المختبر عن طريق إضافة 0.5 ميكرولتر من RiboLock ريبونوكلياز المانع (ThermoFisher Fermentas EO0381). بعد خطوة الدناز العلاج، وتنقية مرنا باستخدام عدة RNeasy MinElute (في Qiagen 74204). تقييم نوعية في المختبر مرنا كتب بواسطة الاغاروز الكهربائي للهلام. تمييع مرنا في ريبونوكلياز خالية من المياه إلى 40 نانوغرام / ميكرولتر، والمخزن كما مأخوذة 2 ميكرولتر في -80 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد مزيج حقن مكروي. قبل الحقن، إضافة 8 ميكرولتر من الحمض النووي ينقول المخفف للقسامة 2 ميكرولتر من transposase مرنا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن مكروي. ضخ 3 NL من خليط الحمض النووي / الحمض النووي الريبي في صفار البيض من 1 الأجنة الزرد الخلية باستخدام تقنيات Microinjection القياسية، وتهدف للواجهة صفار / قسيم أرومي. جمع الأجنة كل 20 دقيقة لضمان حقن في 1 مرحلة الخلية. في تجربتنا، يمكن للشخص ماهرا حقن بسهولة 1،000 الأجنة في 1-1.5 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الحقن، وتشغيل 5 ميكرولتر من اليسارأكثر من حل الحقن على 1٪ هلام الاغاروز لمراقبة الجودة، لضمان أن تكون مرنا transposase لم تتحلل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن الرعاية الجنين. في وقت متأخر بعد الظهر، وإزالة الأجنة غير مخصبة وغير طبيعي وتوزيع الأجنة إلى 60-80 لكل 100 ملم طبق بيتري. تتم إزالة الأجنة غير الطبيعية والميتة في 1 يوم آخر الإخصاب (DPF)، 2 و 3 DPF DPF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الكشف عن GFP التعبير. الأجنة الشاشة من دون عيوب العلني لمضان GFP في 3 DPF (الشكل 3). ويمكن أن يتم الفرز إما على stereomicroscope مجهزة مضان (نستخدم نيكون SMZ1500) أو على مجهر تستقيم (نستخدم زايس AxioImager مع الهدف 5X Fluar). انخفاض التعبير GFP يدل إما حقن فاشلة أو تدهور transposase RNA بسبب التلوث ريبونوكلياز (الشكل 3A). حدد حوالي 30٪ من ألمع الأجنة التي إما GFP التعبير في أنسجة متعددة أو في نسبة عالية من الخلايا من الأنسجة محددة (قارن Figures 3B و 3C). من حقنة من 1،000 الأجنة، لدينا عادة ما يصل الى 100 تنمويا المعتاد،،، معربا عن GFP عالية الأجنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رفع الأجنة F0 المحدد باستخدام إجراءات الزرد تربية القياسية. فمن المعقول أن نتوقع أن 20-30٪ من الأجنة حقن المختارة للتربية والبقاء على قيد الحياة إلى سن البلوغ. </li></ol> 2. صيانة UAS: mRFP تستر الخط. ونحن قد ولدت 14xUAS: خط mRFP تميزت γCry عدسة محددة: GFP. منذ UAS يخضع لإسكات من خلال الحامض النووي، فمن المهم لتحديد السمك مع مستويات منخفضة من إسكات لنشر سهم. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد UAS الفردية: أصحاب الزيجوت المتماثلة الألائل mRFP عن التزاوج مع واحدة من الأكثر موثوقية GAL4 خطوط فخ الجينات لدينا، tpl6 جبهة الخلاص الوطني (Balciuniene آخرون في إعداد). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في اليوم التالي، ونقل UAS: الأسماك mRFP الذي أعطى الأجنة إلى خزانات ثابتة الفردية، في حين يتم جمع الأجنةوتنظيفها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأجنة الشاشة لGFP ومضان RFP في 1 و 3 DPF DPF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأسماك تزاوج الأقارب الذي أعطى الأجنة مع ارتفاع التعبير mRFP لإنشاء الجيل القادم من UAS: خط mRFP. </li></ol> 3. فحص الأسماك F0. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عبور F0 الفردية مع UAS متماثل: الأسماك mRFP (الشكل 4). نحن عادة حقن GBTs لدينا في خطوط مع البرية من نوع ليوبارد أو تصبغ أنماط، وUAS متماثل لدينا: خط mRFP في الخلفية النحاس. وبالتالي يمكن GBT حقن الأسماك F0 تمييزها بسهولة من UAS: الأسماك mRFP، مما يلغي الحاجة لتسجيل ما إذا كان يجري فحص F0 كان ذكرا أم أنثى، وكذلك الأخطاء المحتملة الناتجة عن أخطاء في تسجيل و / أو تحديد جنس كل الأسماك. لذا أفراد لديهم خبرة محدودة جدا، مثل لنا طلاب المرحلة الجامعية، قادرين على إعداد وكسر التزاوج الأسماك. هذا النهج لديه عيب أن اثنين من خلفيات وراثية مختلفةتستخدم، ويحتمل أن تعقيد تفسير الظواهر فقدان الوظيفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في اليوم التالي، وعودة UAS النحاس: الأسماك mRFP لدبابتهم. وضع الأسماك F0 الذي أعطى الأجنة في خزانات ثابتة الفردية (نستخدم هاغن إكسو تيرا Faunarium الصغيرة، ولكن أي دبابة صغيرة يمكن استخدامها لهذا الغرض)، في حين يتم جمع الأجنة وفرزهم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ونقل الأجنة نظيفة جمعها في أطباق بتري جديدة (&lt;100 في الطبق) في فترة ما بعد الظهر من اليوم 0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأجنة الشاشة لGFP ومضان RFP في 1 DPF، 2 و 3 DPF DPF. سحب الأجنة إيجابية لكلا GFP وطلب تقديم العروض بها، فرزها حسب GFP / نمط التعبير طلب تقديم العروض (إذا لوحظ نمط أكثر من واحد في مخلب) ورفعها إلى إنشاء جيل F1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء الأسماك F0 التي أنتجت أجنة السلبية فقط (من أصل العدد الإجمالي للأجنة 50-100). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عبور الأسماك F0 التي أنتجت GFP / RFP-الإيجابية ذرية مرة أخرى للحصول على الدفعة الثانية من ايجابيات. </li></ol> 4.فحص الأسماك F1. يتم فحص الأسماك F1 F2 لإقامة العائلات، لتوثيق نمط التعبير الجيني وفخ تجميد دفعات من الأجنة لتحديد الجينات الجزيئية من فخ مواضع بنسبة 5 &#39;RACE والعكسية PCR. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عبور الأسماك F1 الفردية مع UAS متماثل: الأسماك mRFP (الشكل 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اليوم التالي، ضع السمك F1 التي أعطت أجنة في خزانات ثابتة الفردية في حين يتم جمع الأجنة وفرزهم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأجنة الشاشة لGFP ومضان RFP في 1 DPF، 2 و 3 DPF DPF. الأجنة منفصلة وصورة إيجابية لكلا GFP وطلب تقديم العروض 24. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في 5 DPF، وتجميد دفعات من 20 GFP / RFP-الإيجابية و20 GFP / RFP الأجنة السلبية لتحديد الجينات المتحولة insertionally بواسطة العكسية PCR و 5 &#39;RACE 9،10. رفع المتبقية GFP / الأجنة طلب تقديم العروض الايجابية لتأسيس الجيل F2. </li></ol>

<ol><li>Balciunas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancer+trapping+in+zebrafish+using+the+Sleeping+Beauty+transposon%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Enhancer trapping in zebrafish using the Sleeping Beauty transposon.</a> BMC Genomics. 5 (1), 62(2004).</li>
<li>Trinh le, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+gene+trap+to+visualize+and+interrogate+the+function+of+the+vertebrate+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A versatile gene trap to visualize and interrogate the function of the vertebrate proteome.</a> Genes Dev. 25 (21), 2306-2320 (2011).</li>
<li>Kawakami, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transposon-mediated+gene+trap+approach+identifies+developmentally+regulated+genes+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish.</a> Dev Cell. 7 (1), 133-144 (2004).</li>
<li>Emelyanov, A., Parinov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mifepristone-inducible+LexPR+system+to+drive+and+control+gene+expression+in+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Mifepristone-inducible LexPR system to drive and control gene expression in transgenic zebrafish.</a> Dev Biol. 320 (1), 113-121 (2008).</li>
<li>Ellingsen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+enhancer+detection+in+the+zebrafish+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Large-scale enhancer detection in the zebrafish genome.</a> Development. 132 (17), 3799-3811 (2005).</li>
<li>Distel, M., Wullimann, M. F., Koster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+Gal4+genetics+for+permanent+gene+expression+mapping+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Optimized Gal4 genetics for permanent gene expression mapping in zebrafish.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (32), 13365-13370 (2009).</li>
<li>Davison, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transactivation+from+Gal4-VP16+transgenic+insertions+for+tissue-specific+cell+labeling+and+ablation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Transactivation from Gal4-VP16 transgenic insertions for tissue-specific cell labeling and ablation in zebrafish.</a> Dev Biol. 304 (2), 811-824 (2007).</li>
<li>Sivasubbu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene-breaking+transposon+mutagenesis+reveals+an+essential+role+for+histone+H2afza+in+zebrafish+larval+development%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Gene-breaking transposon mutagenesis reveals an essential role for histone H2afza in zebrafish larval development.</a> Mech Dev. 123 (7), 513-529 (2006).</li>
<li>Clark, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+protein+trapping+produces+a+functional+expression+codex+of+the+vertebrate+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo protein trapping produces a functional expression codex of the vertebrate proteome.</a> Nat Methods. 8 (6), 506-512 (2011).</li>
<li>Petzold, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotine+response+genetics+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Nicotine response genetics in the zebrafish.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (44), 18662-18667 (2009).</li>
<li>Gaiano, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertional+mutagenesis+and+rapid+cloning+of+essential+genes+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Insertional mutagenesis and rapid cloning of essential genes in zebrafish.</a> Nature. 383 (6603), 829-832 (1996).</li>
<li>Amsterdam, A., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutagenesis+strategies+in+zebrafish+for+identifying+genes+involved+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutagenesis strategies in zebrafish for identifying genes involved in development and disease.</a> Trends Genet. 22 (9), 473-478 (2006).</li>
<li>Balciunas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+a+high+cargo-capacity+transposon+for+genetic+applications+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Harnessing a high cargo-capacity transposon for genetic applications in vertebrates.</a> PLoS Genet. 2 (11), e169(2006).</li>
<li>Urasaki, A., Morvan, G., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+dissection+of+the+Tol2+transposable+element+identified+the+minimal+cis-sequence+and+a+highly+repetitive+sequence+in+the+subterminal+region+essential+for+transposition%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Functional dissection of the Tol2 transposable element identified the minimal cis-sequence and a highly repetitive sequence in the subterminal region essential for transposition.</a> Genetics. 174 (2), 639-649 (2006).</li>
<li>Haffter, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+identification+of+genes+with+unique+and+essential+functions+in+the+development+of+the+zebrafish%2C+Danio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The identification of genes with unique and essential functions in the development of the zebrafish, Danio rerio.</a> Development. 123, 1-36 (1996).</li>
<li>Amsterdam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+315+genes+essential+for+early+zebrafish+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Identification of 315 genes essential for early zebrafish development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (35), 12792-12797 (2004).</li>
<li>Scheer, N., Campos-Ortega, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+Gal4-UAS+technique+for+targeted+gene+expression+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Use of the Gal4-UAS technique for targeted gene expression in the zebrafish.</a> Mech Dev. 80 (2), 153-158 (1999).</li>
<li>Koster, R. W., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracing+transgene+expression+in+living+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Tracing transgene expression in living zebrafish embryos.</a> Dev Biol. 233 (2), 329-346 (2001).</li>
<li>Rouet, P., Smih, F., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+double-strand+breaks+into+the+genome+of+mouse+cells+by+expression+of+a+rare-cutting+endonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Introduction of double-strand breaks into the genome of mouse cells by expression of a rare-cutting endonuclease.</a> Mol Cell Biol. 14 (12), 8096-8106 (1994).</li>
<li>Thermes, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((I-SceI+meganuclease+mediates+highly+efficient+transgenesis+in+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish.</a> Mech Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).</li>
<li>Lisby, M., Mortensen, U. H., Rothstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colocalization+of+multiple+DNA+double-strand+breaks+at+a+single+Rad52+repair+centre%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Colocalization of multiple DNA double-strand breaks at a single Rad52 repair centre.</a> Nat Cell Biol. 5 (6), 572-577 (2003).</li>
<li>Bennardo, N., Cheng, A., Huang, N., Stark, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative-NHEJ+is+a+mechanistically+distinct+pathway+of+mammalian+chromosome+break+repair%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Alternative-NHEJ is a mechanistically distinct pathway of mammalian chromosome break repair.</a> PLoS Genet. 4 (6), e1000110(2008).</li>
<li>Rehn, K., Wong, K. S., Balciunas, D., Sumanas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+enhancer+trap+line+recapitulates+embryonic+aquaporin+1a+expression+pattern+in+vascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Zebrafish enhancer trap line recapitulates embryonic aquaporin 1a expression pattern in vascular endothelial cells.</a> Int J Dev Biol. 55 (6), 613-618 (2011).</li>
<li>Petzold, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCORE+imaging%3A+specimen+in+a+corrected+optical+rotational+enclosure%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">SCORE imaging: specimen in a corrected optical rotational enclosure.</a> Zebrafish. 7 (2), 149-154 (2010).</li>
<li>Akitake, C. M., Macurak, M., Halpern, M. E., Goll, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenerational+analysis+of+transcriptional+silencing+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Transgenerational analysis of transcriptional silencing in zebrafish.</a> Dev Biol. 352 (2), 191-201 (2011).</li>
<li>Boniface, E. J., Lu, J., Victoroff, T., Zhu, M., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FlEx-based+transgenic+reporter+lines+for+visualization+of+Cre+and+Flp+activity+in+live+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">FlEx-based transgenic reporter lines for visualization of Cre and Flp activity in live zebrafish.</a> Genesis. 47 (7), 484-491 (2009).</li>
<li>Skarnes, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+public+gene+trap+resource+for+mouse+functional+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">A public gene trap resource for mouse functional genomics.</a> Nat Genet. 36 (6), 543-544 (2004).</li>
<li>Davidson, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+delivery+and+gene+expression+in+zebrafish+using+the+Sleeping+Beauty+transposon%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Efficient gene delivery and gene expression in zebrafish using the Sleeping Beauty transposon.</a> Dev Biol. 263 (2), 191-202 (2003).</li>
</ol>

هؤلاء الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

ويجري بالفعل استخدام ناقلات فخ الجينات والمنهجية الموضحة هنا في عدة مختبرات مستقلة. في تجربتنا، وهناك نوعان من الخطوات الحاسمة في هذه العملية. الخطوة الحاسمة الأولى لتحقيق معدلات عالية من فخ الجينات في الأجنة التكامل F0 حقن. يمكن في كثير من الأحيان أن يعزى الفشل في هذه الخطوة إلى تلوث ريبونوكلياز من الكواشف الحقن، وخاصة الحمض النووي miniprep. بل هو أيضا مهم جدا لحقن الأجنة في مرحلة 1 خلية لفخ الجين التجارب. في تجربتنا، ونقل الجينات Tol2 بوساطة فعالة جدا، مما يجعل من الممكن الحصول على خطوط المعدلة وراثيا حتى عندما حقن في وقت لاحق من المرحلة 1 الخلية أو الحمض النووي مع أقل جودة. الحقن هي دون المستوى المطلوب أكثر تعقيدا من ذلك بكثير عند إجراء فخ الجينات الطفرات، لأن سوى جزء صغير من التكامل ناقلات يؤدي إلى الأحداث فعالة فخ الجينات. الخطوة الحاسمة الثانية هي للتأكد من فخ الأحداث الجين عن طريق عبور لدينا UAS: خط mRFP. غياب mRFP التعبيردائما تقريبا مما يشير إلى حدوث الحدث فخ محسن. ومع ذلك، وأحيانا عدم وجود mRFP التعبير قد يشير إلى إسكات UAS 14X. ولذا فمن المهم للحفاظ على UAS: خط mRFP في حالة غير أسكتهما نشر الجيل المقبل باستخدام الأفراد مع طلب تقديم العروض عالية التعبير عندما عبرت لtpl6 جبهة الخلاص الوطني. يمكننا أن نتوقع اتخاذ العديد من التحسينات لدينا فخ الجين ناقلات والبروتوكول. الأول هو استخدام UAS أقل تكرارا في فخ الجينات بناء. فقد تبين أن 5X UAS كافية لتحقيق التفعيل الكامل في تجارب زراعة الخلايا، والتي متواليات UAS أقل تكرارا هي أقل عرضة للمثيلة وإسكات 6،25. قد يكون من الممكن أيضا لتصميم مصيدة الجين ناقلات للالطفرات مشروطة تماما، تشبيها له النواقل المستخدمة من قبل الماوس الدولي فخ الجين كونسورتيوم مؤخرا وتكييفها لالزرد 2،26،27. سوف تحسن آخر يتمثل في استخدام ر مختلفةنظام ransposon، على سبيل المثال الجمال النائم 28، لتوليد UAS: mRFP خط مراسل. وهذا من شأنه تمكين حقن الجينات الفخاخ مقرها Tol2 مباشرة في خط مراسل والفرز من قبل F0s incrossing. وعلاوة على ذلك، فإن هذا القضاء على استخدام اثنين من خلفيات وراثية مختلفة، مما يجعل تفسير الظواهر فقدان وظيفة أكثر وضوحا. حتى مع هذه التحسينات، فإن العام GAL4 فخ الجين بروتوكول المعروضة هنا لا تزال مطبقة تطبيقا كاملا.

وقد ثبت الطفرات إقحامي ليكون نهجا قوية لتشريح وظيفة الجين في نظم نموذج مختلف الكائنات وحيدة الخلية مثل من البكتيريا والخميرة لالكائنات متعددة الخلايا مثل الفئران والنباتات. أي DNA الخارجية (فيروس، أو ينقول البلازميد) قد تكون بمثابة المغير عن طريق قطع عناصر أساسية من الجينات مثل الإكسونات أو المروجين. الهدف الفعال لهذه النهج بسيطة صغيرة جدا في الجينوم مجمع كبير، منذ تشكل الإكسونات 1-3٪ فقط من الفقاريات الجينوم نموذجية. فعالة صغيرة الحجم المستهدف يمكن التغلب عليها بنسب التكامل ناقلات عالية جدا، كما يتضح من النجاح الهائل من الطفرات إقحامي فيروسات في الزرد 11،12. في المقابل، تشكل الإنترونات حوالي 20-30٪ من الجينوم الفقارية. في الزرد، القائم على ناقلات ينقول الطفرات إقحامي الذي يعرض بشكل فعال فارغة أو الطفرات hypomorphic شديدة على الاندماج في الإنترونات وتمت تسمية &quot;الجين كسر transposoنانوثانية &quot;(GBTs) 8-10. للكفاءة التكامل فخ الجين، فإنها تستخدم الحد الأدنى من Tol2 ينقول 13،14. مسبب للطفرات الجينية من GBTs تعتمد على المشتقة من الأسماك لصق متقبل والنسخي تسلسل إنهاء / تذييل بعديد الأدينيلات. ويحيط العناصر المسؤولة عن طفرات GBT من مواقع loxP المباشر لاستئصال من قبل لجنة المساواة العرقية recombinase. وهكذا، حقن مرنا لجنة المساواة العرقية يؤدي إلى الارتداد كفاءة الطفرات المستحثة GBT، على الرغم من بعض متواليات ينقول تبقى في موضع التكامل 9،10. ناقلات GBT نشرت مؤخرا استخدام mRFP كما في فخ الجين مراسل 9،10، مما يؤدي إلى اثنين من أوجه القصور المحتملة. الأولى، فإنه لا يعرف ما جزء من الجينات الزرد يتم التعبير على مستوى عال بما فيه الكفاية ليتم الكشف عن طريق الاتصال المباشر الفلورسنت البروتينات مراسل الانصهار. الثانية، ومن المتوقع أن يكون لها وظائف أساسية فقط مجموعة فرعية صغيرة من الجينات. وتشير التقديرات إلى أن هناك فقط 1،400-2،400 الجينات اللازمة لdevelopme الزردالإقليم الشمالي 15،16. وليس من المتوقع لعرض الظواهر العلني، وبالتالي سيكون لها فائدة محدودة معظم فخ الجين المسوخ. للتغلب على هذه القيود اثنين، ونحن قد عدلت GBT-R15 9،10 للاستخدام مع GAL4-VP16 كما مراسل فخ الجين الأساسي (Balciuniene آخرون قيد الإعداد). كما هو الحال مع AUG-أقل mRFP في GBT-R15، تمت إزالة الموقع بداية الترجمة من GAL4-VP16. للكشف المباشر للأحداث فخ الجينات، ناقلات لدينا تحتوي على مراسل EGFP تحت سيطرة 14X GAL4 UAS 17،18. صممت العديد من الميزات الإضافية لدينا في ثنائية فخ الجين ناقلات. وUAS: ويحيط EGFP الكاسيت من مواقع FRT المباشر (الاقتباس الرمادي في الشكل 1). حقن FLP recombinase مرنا يؤدي إلى استئصال UAS: EGFP الكاسيت، وترك تحور الجين فخ يشبها EGFP مضان. ويمكن عندئذ أن تستخدم في خطوط المعدلة وراثيا والتي بمناسبة أنسجة معينة أو أحداث التنموية التي كتبها GFP مضان. كما هو الحال في غيرهاGBTs، ويحيط كله فخ الجين الكاسيت من مواقع loxP المباشر (خماسي مفتوحة في الشكل 1). وهذا يجعل الأحداث فخ الجين عكسها من خلال التعبير عن لجنة المساواة العرقية recombinase، وإنشاء بسهولة إثبات العلاقة السببية بين فخ الجين التكامل محددة، ولاحظ النمط الظاهري (الشكل 2). أخيرا، ويحيط فخ الجين الكاسيت من مواقع meganuclease I-SCEI مقلوب (مثلثات سوداء في الشكل 1). في ذبابة الفاكهة، وغالبا ما يتم تحويلها إلى التكامل ينقول الحذف (القصور) من خلال الاستئصال غير دقيقة من العنصر P. لا يوجد أي دليل على أن الختان من Tol2 ينقول (أو أي ينقول الأخرى العاملة في الفقاريات مثل الجمال النائم، PiggyBac أو التيار المتردد / التاءات) يمكن أن يؤدي إلى الحذف. لذا أدرجنا مواقع I-SCEI كوسيلة بديلة محتملة للتحريض والحذف، على الرغم من أنه لا يوجد دليل على أن SCEI I-يمكن أن تحدث الحذف في الزرد. تجدر الإشارة إلى أنه في حين أن SCEI I-الضخمةيمكن استخدامها لتسهيل نقل الجينات نوكلياز في الزرد، ويستخدم الانقسام الحمض النووي عن طريق I-SCEI meganuclease لدراسة آليات إصلاح الحمض النووي، بما في ذلك نهاية غير المتجانسة الانضمام عرضة للخطأ، في الخميرة وخلايا الثدييات 19-22. التكامل لدينا فخ الجين ناقلات يمكن أن يؤدي إلى EGFP التعبير من خلال آليتين مختلفتين. الأول هو صحيح فخ الجين الحدث (الشكل 1C): ناقلات يدمج الجين (IMG لتحور الجينات Insertionally)، نسخة الانصهار بين 5 &#39;من محضر IMG الذاتية وGAL4-VP16 يرصد ويترجم إلى انصهار بروتين تحتوي على N-محطة من البروتين المشفرة بواسطة وIMG GAL4-VP16. هذا البروتين الانصهار بربط UAS 14X وينشط النسخ من EGFP. الثانية، الحدث اقل من المرغوب فيه هو فخ محسن (الشكل 1D): المروج الحد الأدنى من أمام EGFP يقع تحت سيطرة محسن بالقرب من موقع التكامل، مما يؤدي إلى إنتاج EGFP في أساسهاالعمالي الإنتاج GAL4-VP16. في تقديرنا، 30-50٪ من الأحداث التعبير EGFP هي نتيجة لاعتراض محسن وترجع إلى فخ الجين 23٪ 50-70 (Balciuniene آخرون قيد الإعداد). للتمييز بين هاتين الفئتين من الأحداث، حققنا 14xUAS: mRFP خط المعدلة وراثيا (الشكل 1B)، للراحة تميزت عدسة محددة γCry: (. Balciuniene آخرون قيد الإعداد) GFP. يتم التحقق من الأحداث فخ الجين عن طريق المشاركة في التعبير عن GFP وطلب تقديم العروض (قارن C و D في الشكل 2). في الشاشة التجريبية لدينا، ونحن تعافى أكثر من 40 فخ الجين الأحداث بعد فحص 270 الأسماك F0 حقن بمزيج من الحمض النووي ينقول وtransposase مرنا. حدثت اثنين من الجينات لدينا فخ التكامل في الجينات مع سبق نشرها المسوخ التي يسببها كيميائيا: جبهة الخلاص الوطني وطنين خط المجال المغنطيسي. الظواهر لدينا المسوخ إقحامي tpl6 جبهة الخلاص الوطني وFLR tpl24 لا يمكن تمييزها بشكل سطحي من النمط الظاهريق من المقابلة المسوخ التي يسببها كيميائيا. لاحظنا أيضا أن أحداث فخ الجينات تظهر منحازة نحو الإنترونات قرب نهاية 5 &#39;من الجينات، وبالتالي زيادة احتمال الأليلات فارغة. نفعل مراقبة درجة معينة من UAS إسكات (تلون) في كل من خطوط فخ الجينات، وبعض مواضع من الواضح أكثر عرضة للتلون من غيرها. نحن لا نعتقد أن UAS إسكات مشكلة كبيرة لانتشار خطوط فخ الجين، كما كنا قادرين على نشر بسهولة كل من خطوط فخ الجينات من خلال خمسة أجيال على الأقل عن طريق اختيار لGFP التعبير وحدها.

<table><tbody><tr><td>مجموعة Miniprep</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td>خطوة غسيل PB الاختيارية هي أمر لا بد</td></tr> منه <tr><td>إنزيم تقييد XbaI</td><td>ThermoFisher</td><td>ER0681</td><td></td></tr><tr><td>mMessage Machine T3</td><td>Ambion</td><td>AM1348</td><td></td></tr><tr><td>RiboLock RNase Inhibitor</td><td>ThermoFisher</td><td>EO0381</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy MinElute</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td>يمكن استبداله باستخراج الفينول و ترسب. لا تستخدم LiCl!</td></tr><tr><td>يجب أن تكون المياه الخالية من Nuclease</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td> غير <td>المعالجة DEPC</td></tr><tr><td>من زجاج البورسليكات لإبر الحقن المجهري</td> World <td>Precision</td><td>Instruments 1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Microcapiliaries للمعايرة</td><td>Drummond Scientific</td><td>1-000-0010</td><td></td></tr><tr><td>نصائح Microloader</td><td>Eppendorf</td><td>5242 956.003</td><td></td></tr><tr><td>مجتذب إبرة *</td> <td>Sutter أدوات</td><td>P-87</td><td></td></tr><tr><td>مجهر مجسم للحقن المجهري * </td><td></td><td>نيكون SMZ1500</td><td>نستخدم أيضا Wild 5M و Olympus SZ61 مع حامل الضوء المنقول</td></tr><tr><td>Picoinjector *</td> <td>Harvard Instruments</td><td>Pli-90</td> نستخدم أيضا مجهر الفحص <td>Pli-100</td></tr><tr><td>مع مضان GFP / RFP *</td> هدف <td>Zeiss</td><td>Zeiss AxioImager</td><td>5X Fluar لديه مسافة</td></tr> <tr><td>عمل كافيةمجهر الفحص باستخدام مضان GFP / RFP *</td> <td>Nikon</td><td>SMZ1500</td><td></td></tr><tr><td colspan = "4" > * نقترح هذا الجهاز فقط لأننا نستخدمه بنجاح في مختبرنا. في كل فئة ، تتوفر العديد من الخيارات القابلة للمقارنة من العديد من الشركات المصنعة.</td></tr></tbody></table>

الجينات الاصطياد عن طريق gal4 في الزرد

Gene Trapping Using Gal4 in Zebrafish

كبير حجم مخلب والتنمية الخارجية الأجنة الزرد شفافة بصريا جعل نظام نموذج الفقاريات استثنائية لفي الجسم الحي باستخدام الطفرات إقحامي للصحفيين الفلورسنت لعلامة التعبير عن الجينات المتحولة. وقد شيدت العديد من المختبرات واختبار ناقلات محسن والجينات فخ في الزرد، وذلك باستخدام البروتينات الفلورية، تفعيل النسخي مقرها LEXA-GAL4 وكما صحفيين 1-7. كان لهذه النواقل اثنين من السلبيات المحتملة: التشدد الأمثل (مثل عدم القدرة على التفريق بين الأحداث محسن والجينات فخ) وطفرات منخفضة (مثل التكامل في الجينات نادرا ما تنتج الأليلات فارغة). وقد وضعت الجينات يكسر ينقول (GBTs) لمعالجة هذه العيوب 8-10. قمنا بتعديل واحدة من ناقلات GBT الأولى، GBT-R15، للاستخدام مع GAL4-VP16 كما مراسل الأولية فخ الجينات وUAS وأضاف: كما EGFP مراسل الثانوية للكشف المباشر للأحداث فخ الجينات. Application من GAL4-VP16 كما مراسل فخ الجين الأساسي يوفر ميزتين الرئيسية. أولا، لأنه يزيد الحساسية للجينات التي أعرب عنها في مستويات التعبير المنخفض. الثاني، فإنه تمكن الباحثون لاستخدام خطوط فخ الجين كسائقين GAL4 إلى التعبير المباشر عن الجينات المحورة أخرى في أنسجة محددة للغاية. وهذا هو ذات الصلة وخاصة بالنسبة للجينات مع وظائف غير الضرورية أو الزائدة عن الحاجة، حيث قد لا يؤدي فخ الجين التكامل في الظواهر العلني. وسيئات استخدام GAL4-VP16 كما مراسل فخ الجين الأساسي هو أن الجينات الترميز للبروتينات مع تسلسل إشارة N-محطة ليست قابلة للمحاصرة، وكذلك الناتجة GAL4-VP16 البروتينات الانصهار غير المرجح أن تكون قادرة على الدخول نواة وتفعيل النسخ. الأهم من ذلك، استخدام GAL4-VP16 لا قبل تحديد البروتينات النووية: نحن تعافى الجينات طفرات في الجينات فخ ترميز البروتينات التي تعمل في النواة، السيتوبلازم والغشاء البلازمي.

في حقن ناجحة، لا يقل عن 80٪ من الأجنة حقن فخ الجين DNA / Tol2 transposase المزيج مرنا عرض بعض درجة من GFP مضان (الشكل 3). عندما يتم اختيار ألمع GFP إيجابية الأجنة (الشكل 3C) لإقامة تجمع F0، حوالي واحد في 10 فحص الأسماك F0 سوف تسفر الجين فخ ذرية. بين الأسماك F0 التي يتم استردادها الأحداث فخ الجينات، معظم يحيل فخ الجين حدث واحد، بالإضافة إلى العديد من غير معربا-التكامل ينقول. ومع ذلك، وضعنا ما يصل إلى أربعة خطوط فخ الجينات من فرد واحد F0. GFP / RFP أنماط التعبير في خطوط فخ الجينات تتراوح من غاية محددة الأنسجة (على سبيل المثال في بصيلات الشم) إلى كل مكان إلى حد ما. <img alt="الشكل 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50113/50113fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50113/50113fig1.jpg" /> الشكل 1. Tانه GAL4 التي تحتوي على الجين فخ ثنائية ناقلات GBT B1 وتطبيقاتها. A. مكونات GAL4 التي تحتوي على الجين ناقلات فخ: Tol2 5 &#39;وTol2 3&#39;، والحد الأدنى Tol2 ينقول ينتهي 13؛ كالة الفضاء الكندية، شبوط β-أكتين لصق متقبل 8؛ ^ GAL4-VP16، AUG-أقل GAL4-VP16؛ ZP ( A)، β-أكتين الزرد 3 &#39;UTR وبولي (A) عناصر من GBT-R15 9،10. 14XUAS، EGFP وSV40 ص (A) هي مكونات UAS: EGFP التعبير كاسيت 17،18. السهم يشير تفعيل UAS: EGFP بواسطة GAL4-VP16 التي تنتجها الجينات فخ باء 14XUAS: mRFP التحوير تميزت γCry عدسة محددة: الكاسيت GFP. السهم يشير تفعيل UAS: mRFP بواسطة GAL4-VP16 في فخ الحدث عبر C. الجينات. صناديق الزرقاء هي الإكسونات. يشار إلى الربط عن طريق خط متقطع. فخ الحدث D. محسن. التكامل بين ناقلات قرب محسن (مربع البني) قد وضع الحد الأدنى EGFP المروج تحت سيطرة هذا محسن (السهم البني<html> ). هذا من شأنه أن يؤدي إلى التعبير الأنسجة محددة من EGFP، ولكن لأنه لا يتم GAL4-VP16، لن يتم تفعيلها mRFP التعبير. <img alt="الرقم 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50113/50113fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50113/50113fig2.jpg" /> الشكل 2. الارتداد من الأحداث فخ باستخدام الجينات لجنة المساواة العرقية recombinase. A، B. رسم توضيحي لطفرة الجين فخ (A) وعادت لجنة المساواة العرقية فخ الجين أليل (B). C، D. المشارك التعبير عن GFP (C) وطلب تقديم العروض (D) في الجهاز العصبي من الجين tpl6 جبهة الخلاص الوطني مصيدة الخط. E، F. حقن الحمض النووي الريبي لجنة المساواة العرقية في الأجنة tpl6 جبهة الخلاص الوطني يؤدي إلى فقدان GFP (E) وطلب تقديم العروض (F) التعبير. لاحظ أنه لا يوجد أي تخفيض GFP التعبير في العدسة، كما هو متوقع. r.within صفحة = &quot;دائما&quot;&gt; <img alt="الرقم 3" src="/files/ftp_upload/50113/50113fig3.jpg" /> الرقم 3. حقن الأجنة مع GBT-B1 (pDB783) فخ الجينات. . حقن A. الأجنة مع pGBT-B1 (pDB783) وحدها العرض قليلا مضان GFP في الجسم B، C. حقن الأجنة مع pGBT-B1 وTol2 transposase مرنا: مجموعة عشوائية من الأجنة (B) وexpressors عالية اختيارها لتربية (C). <img alt="الرقم 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50113/50113fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50113/50113fig4.jpg" /> الشكل 4. مخطط تجريبي لإنشاء خطوط GAL4 فخ الجينات. هياكل أحمر / أخضر متداخلة جزئيا تشير شارك التعبير عن GFP من وكراسة الشروط، في حين الخضراء وحدها تشير الاصباغ لفخ الجينات أو فخ محسن الأحداث.

يصف هذا البروتوكول طريقة فخ الجين إقحامي الطفرات باستخدام GAL4-VP16 كما مراسل الابتدائية وGFP / RFP كما صحفيين الثانوية في الزرد. حوالي واحد من كل عشرة عالية، معربا عن F0 محصول الأسماك الجين فخ ذرية المشترك، معربا عن GFP وطلب تقديم العروض. إجراءات الفحص يمكن زيادتها بسهولة للتكيف مع حجم المختبر أداء الشاشة الطفرات إقحامي.

الجينات الاصطياد عن طريق GAL4 في الزرد

Large clutch size and external development of optically transparent embryos make zebrafish an exceptional vertebrate model system for in vivo insertional ...

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنتاج أسماك طافرة باستخدام ناقلات ترانسبوزون لكسر الجينات مع GAL four و VP 16 كراصد أساسي لمصيدة الجينات. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق الحقن المشترك لناقل مصيدة الجينات مع ترانسبوزون tall two في أجنة أسماك الزيبرا. يتم فحص الأجنة المحقونة للكشف عن فلورة GFP في اليوم الثالث بعد الإخصاب، ويتم اختيار ما يقرب من 30% من الأجنة الأكثر سطوعاً لتأسيس تجمع الجيل F zero.بعد ذلك، يتم تزاوج أسماك الجيل F zero مع سلالة الفحص U-A-S-M-R-F-P للكشف عن الانتقال الجرثومي لأحداث مصيدة الجينات. وتتمثل الخطوة النهائية في إجراء تزاوج خارجي للجيل F1 لتأسيس الجيل F two وتوليد أجنة للتوصيف الجزيئي لأحداث مصيدة الجينات باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي (inverse PCR) وتقنية 5' RACE. وفي النهاية، من المتوقع أن تنتج سمكة واحدة من كل 10 أسماك F zero مفحوصة ذرية تحمل مصيدة جينات.تم تصميم ترانسبوزونات كسر الجينات بحيث لا تنتج أي طفرات عند الاندماج في بدايات الجينات المشفرة للبروتين. تستخدم ناقلات GBT الخاصة بنا G four P 16 كـمراسل رئيسي لمصيدة الجينات. يزيد هذا التعديل من الحساسية للجينات التي يتم التعبير عنها بمستويات منخفضة، ويجعل من الممكن لنا استخدام طفرات مصيدة الجينات دون تجنب الأنماط الظاهرية كـمحركات G four للتعبير النوعي للأنسجة لترانسجينات أخرى.نعتقد أن العائق الرئيسي في طريقتنا يكمن في تحقيق معدلات مرتفعة بما يكفي من دمج مصيدة الجينات في الخط الجرثومي لأسماك الجيل F zero. في هذا العرض التوضيحي، سنغطي عدة خطوات حاسمة، وهي تحضير الـ DNA، والـ MICROINJECTION وفحص الجيل F zero. يستخدم ناقل مصيدة الجينات GBTB one البروتين GAL four VP 16 كمراسل أساسي لمصيدة الجينات.تُستخدم عناصر النقل Minimal tall two transpose على النهايات من أجل دمج مصيدة الجينات. ويتم الكشف عن أحداث مصيدة الجينات مباشرة بواسطة مراسل EGFP تحت تحكم 14 X GAL four UAS. وتكون كاسيت مصيدة الجينات بأكملها محاطة بمواقع direct locks P.يجعل هذا أحداث مصيدة الجينات قابلة للعكس من خلال التعبير عن Cree combs لإثبات علاقة السببية بين دمج محدد لمصيدة الجينات والنمط الظاهري الملحوظ. بالإضافة إلى ذلك، تحيط مواقع FRT المباشرة بكاسيت U-A-S-E-G-F-P. وسيؤدي حقن mRNA الخاص بـ flip combs إلى استئصال كاسيت U-A-S-E-G-F-P، مما يترك طفرة مصيدة الجينات غير مميزة بفلورة EGFP، وهذا يتيح استخدامها في الخطوط المعدلة وراثياً التي تميز أنسجة معينة أو أحداثاً نموّية عن طريق فلورة GFP قبل الحقن المجهري.قم بتحضير الـ transpose على DNA والـ transposes mRNA. ثم قم بتحضير DNA لناقل مصيدة الجينات GBTB one gene trap. باستخدام طقم mini prep قياسي واتباع بروتوكول الشركة المصنعة، من الضروري تضمين خطوة غسيل PB عند تحضير الـ DNA.وإلا، فإن الـ DNA المستخلص بطريقة الـ mini prep سيكون ملوثاً بـ RNAs، مما يؤدي إلى تحلل الـ mRNA الخاص بالترانسبوزونات. قم بتخفيف الـ DNA في ماء خالٍ من الـ RNAs ليصل التركيز إلى 10 nanograms per microliter. لتحضير الـ mRNA الخاص بالترانسبوزونات الاثنين، قم أولاً بعمل خطية (linearized) لـ PT three TS T two باستخدام xbo one. بعد ذلك، قم بنسخ الـ DNA الخطي باستخدام M message machine T three in vitro transcription kit مع تعديل واحد.أضف 0.5 µL من مثبط rib lock RNAs بعد خطوة معالجة DNA، ثم قم بتنقية mRNA باستخدام طقم قياسي، وقيم جودة mRNA المنسوخ في المختبر عن طريق الفصل الكهربائي لهلام الأغاروز. خفف mRNA في ماء خالٍ من RNAs ليصل التركيز إلى 40 ng/µL، واحفظه في حصص قدرها 2 µL عند درجة حرارة -80 °C قبل عملية الحقن المجهري مباشرة. قم بتحضير خليط الحقن عن طريق إضافة 8 µL من transpose DNA المخفف إلى حصة قدرها 2 µL من transposes mRNA.احقن ثلاث nanoliters من خليط D-N-A-R-N-A في مح هذه الأجنة لسمكة الزيبرا باستخدام تقنيات الحقن المجهري القياسية، مستهدفاً الواجهة بين المح والسيتوبلازم. بعد الحقن، قم بتشغيل خمس microliters من محلول الحقن المتبقي على هلام agar بنسبة 1% لضبط الجودة وللتأكد من أن mRNA الخاص بالترانسبوزاز لم يتحلل، وذلك بعد حوالي ست إلى ثماني ساعات من الحقن. أزل الأجنة غير المخصبة والميتة ووزع الأجنة بمعدل 60 إلى 80 جنيناً لكل طبق Petri بقطر 100 millimeter. يتم إزالة الأجنة غير الطبيعية والميتة في اليوم الأول بعد الإخصاب، واليوم الثاني بعد الإخصاب، واليوم الثالث بعد الإخصاب؛ وفي اليوم الثالث بعد الإخصاب، يتم ذلك باستخدام مجهر ستيريو مجهز بفلورسنت أو مجهر قائم.افحص الأجنة وأزل أي أجنة غير طبيعية. افحص الأجنة المتبقية التي لا تظهر عليها عيوب ظاهرة. وبالنسبة لفلورة GFP، اختر أجنة F zero الأكثر سطوعاً وقم بتربيتها باستخدام إجراءات تربية سمك الزيبرا القياسية المتبعة في هذا المختبر.عادةً ما تُحقن مصائد الجينات (GBTs) في سلالات ذات أنماط تصبغ برية أو منقوشة (leopard). ومن المتوقع منطقياً أن ينجو ما بين 20 إلى 30% من الأجنة المحقونة المختارة للتربية حتى مرحلة البلوغ. يمكن أن يؤدي دمج ناقل مصيدة الجينات GBTB one إلى تعبير EGFP من خلال آليتين مختلفتين.تتمثل الحالة الأولى في حدث حقيقي لمصيدة الجينات. يندمج الناقل في جين ما، مما يؤدي إلى تكوين نسخة نسخ اندماجية بين الطرف '5 لنسخة ذلك الجين الداخلي و GAL4 VP16، والتي تترجم لاحقاً إلى بروتين اندماجي يحتوي على الطرف النهائي للبروتين وتغلفه الجين الطافر المدرج و GAL4 VP16. يرتبط هذا البروتين الاندماجي بـ 14 XUAS وينشط نسخ EGFP.الحدث الثاني الأقل رغبة هو مصيدة المعزز (enhancer trap). حيث يخضع المحفز الأدنى الموجود أمام EGFP لسيطرة معزز بالقرب من موقع التكامل، مما يؤدي إلى إنتاج EGFP في غياب GAL four و VP 16. وللتمييز بين هاتين الفئتين من الأحداث، تم إنشاء خط تحولي 14 X-U-A-S-M-R-F-P مميز بـ GFP لبروتين gamma crystalline الخاص بالعدسة.يتم التحقق من أحداث مصيدة الجينات عن طريق تهجين الأسماك المحقونة بـ GBT مع أسماك متماثلة الزيجوت من سلالة U-A-S-M-R-F-P وفحص التعبير المشترك لـ GFP و RFP، وهو أمر ممكن فقط في حال تكوين GAL four, VP 16 وتنشيط U-A-S-M-R-F-P في وضع trans. لبدء إجراء فحص أسماك F zero، يتم تهجين كل سمكة F zero مع أسماك متماثلة الزيجوت من سلالة U-A-S-M-R-F-P. وبما أن الأسماك المحقونة بـ GBT تمتلك أنماط تصبغ من النوع البري أو نمط Leopard، بينما تكون سلالة U-A-S-M-R-F-P متماثلة الزيجوت في خلفية brass، فيمكن تمييز أسماك F zero بسهولة عن أسماك U-A-S-M-R-F-P، مما يلغي الحاجة إلى تسجيل ما إذا كانت سمكة F zero التي يتم فحصها ذكراً أم أنثى، وكذلك يتجنب الأخطاء المحتملة الناتجة عن أخطاء التسجيل و/أو تحديد جنس كل سمكة. وفي اليوم التالي.أعد أسماك U-A-S-M-R-F-P النحاسية إلى حوضها. ضع أسماك F zero التي أنتجت أجنة في أحواض استاتيكية فردية أثناء جمع الأجنة للفحص المجهري، وانقل الأجنة التي تم جمعها إلى أطباق بتري جديدة في مساء اليوم صفر. افحص الأجنة للكشف عن الفلورية لـ GFP و RFP في اليوم الأول واليوم الثالث بعد الإخصاب.قم بسحب الأجنة الإيجابية لكل من GFP و RFP، وصنفها وفقاً لنمط تعبير G-F-P-R-F-P. في حال ملاحظة أكثر من نمط واحد في الحضنة الواحدة، قم بتربيتها لإنشاء جيل F1. لاحظ أن أجنة 3D PF الإيجابية لـ GFP ولكنها سلبية لـ RFP لا يتم سحبها لأنها تمثل أحداث مصيدة المعزز (enhancer trap events).قم بتزويج أسماك F zero التي أنتجت ذرية إيجابية لـ G-F-P-R-F-P مرة أخرى للحصول على دفعة ثانية من الإيجابيات. يتم فحص أسماك F1 لإنشاء عائلات F two لتوثيق نمط تعبير gene trap وتجميد دفعات من الأجنة للتحديد الجزيئي لمواقع gene trap. أولاً، قم بتزويج أسماك F1 الفردية مع أسماك U-A-S-M-R-F-P متماثلة الزيجوت في اليوم التالي. ضع أسماك F1 التي أنتجت أجنة في خزانات استاتيكية فردية، بينما يتم جمع الأجنة للفحص بعد يوم واحد من الإخصاب.قد لا يكون وسم RFP قد ظهر بعد، لذا قم بفحص الأجنة للكشف عن فلورة GFP واسحب الأجنة الموجبة لـ GFP في اليوم الثالث بعد الإخصاب، ثم افحص فلورة كل من GFP و RFP واسحب الأجنة الموجبة لكليهما. بعد ذلك، قم بتصوير الأجنة الموجبة لكل من GFP و RFP في اليوم الخامس بعد الإخصاب، وقم بتجميد مجموعات مكونة من 20 جنينًا موجبة لـ GFP-RFP و20 جنينًا سالبة لـ GFP-RFP لتحديد الجينات الطافرة المدرجة عن طريق inverse PCR و 5 prime race. قم بتربية بقية الأجنة الموجبة لـ GFP-RFP لتأسيس الجيل F2 في حالة نجاح عملية الحقن.ستظهر درجة ما من فلورة GFP في 80% على الأقل من الأجنة التي حُقنت بمزيج من DNA مصيدة الجينات وmRNA لإنزيم transposase. ويشير انخفاض تعبير GFP إما إلى فشل عملية الحقن أو تحلل RNA الخاص بـ transposase بسبب تلوث RNAs. وعند اختيار الأجنة الأكثر سطوعاً في إيجابية GFP لإنشاء مجموعة F zero، فإن سمكة واحدة تقريباً من كل 10 أسماك F zero تم فحصها ستنتج ذرية تحمل مصيدة الجينات من بين أسماك F zero التي استُعيدت منها أحداث مصيدة الجينات.ينقل معظمها حدثاً واحداً من مصيدة الجينات بالإضافة إلى عدة عمليات دمج لترانسبوزونات غير معبرة. وبما أن كاسيت مصيدة الجينات بالكامل محاط بمواقع LoxP مباشرة، فإن أي طفرات في مصيدة الجينات الموضحة في هذا المخطط (حيث تمثل الصناديق الزرقاء إكسونات الجين المتحور) يمكن عكسها عن طريق التعبير عن Cre recombinase. تُظهر هذه الصور التعبير المشترك لـ GFP و RFP في الجهاز العصوري لسلالة مصيدة الجينات NSF TP six، ويؤدي حقن Cre RNA في أجنة NSF TP six إلى فقدان التعبير عن GFP و RFP.لاحظ أنه لا يوجد انخفاض في تعبير GFP في العدسة كما هو متوقع. معظم الإجراءات الموضحة هنا قابلة للتطبيق على عمليات فحص مصيدة الجينات الأخرى، وكذلك تجارب نقل الجينات العادية باستخدام TOL two والترانسبوزونات الأخرى. باستخدام إجراء مصيدة الجينات الموضح هنا، فإن إعداد 20 إلى 30 عملية تهجين عكسي لجيل F zero أسبوعياً يجب أن يؤدي إلى استعادة مصيدة جينية واحدة كل أسبوع.ومع ذلك، يمكن زيادة نطاق هذا الإجراء بسهولة.

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

Microinjection طريقة راسخة وفعالة لإدخال المؤثرات الأجنبية في الأجنة المخصبة الزرد. هنا ، علينا أن نظهر تقنية microinjection قوية لأداء overexpression مرنا ، والدراسات morpholino ضربة قاضية قليل النوكليوتيد الجينات في الزرد.

Microinjection من مرنا والعقاقير [أليغنوكليوتيد] Morpholino اسماك الزرد في الأجنة.

خلايا الموت تنبثق من الأنسجة الطلائية التي تقلص متضافرة من الخلايا المجاورة دون تعطيل وظيفة الحاجز. الوضوح البصري الزرد النامية يوفر نظاما ممتازا لتصور البثق في العيش ظهائر. نحن هنا وصف أساليب للحث على صورة وقذف في البشرة الزرد اليرقات في القرار الخلوية.

يعيش التصوير من النتوء خلية من البشرة من اسماك الزرد النامية

القرار الزماني والمكاني من التلاعب الجيني الذي يحدد طائفة من الظواهر البيولوجية التي يمكن أن التشويش. هنا نستخدم زمنيا ومكانيا...

استهداف الخلايا العصبية عن طريق الجمع بين البصلة الشمية في فيفو Electroporation وGal4 محسن المستندة إلى خطوط مصيدة اسماك الزرد

دراسة أقرب أحداث تطور الخلية سابق للورم والفطري تفاعل الخلايا المناعية غير محورية لفهم وعلاج السرطان. نحن هنا تصف طريقة للحث مشروط التحولات الخلايا الظهارية والتصوير الحي لاحق من الفطري تفاعل الخلايا المناعية مع HRAS G12V معربا عن خلايا الجلد في يرقات الزرد.

تصوير لايف الفطرية المناعي والتفاعلات سابق للورم الخلية باستخدام نظام التعبير / UAS محرض GAL4 في اليرقات الزرد الجلد

يمكن أن يلقي تصوير السلوك الديناميكي للعضيات والهياكل الخلوية الأخرى في الجسم الحي الضوء على وظيفتها في الظروف الفسيولوجية والمرضية. هنا ، نقدم طرقا لوضع علامات وراثية على عضيتين ، الجسيمات المركزية والميتوكوندريا ، وتصوير ديناميكياتها في أجنة الزرد الحية باستخدام الفحص المجهري واسع المجال ومتحد البؤر.

التصوير الهياكل التحت خلوية في الأجنة الحية اسماك الزرد

هنا، نحن إظهار عملية إنشاء خط جهد كهربائي خلوية الزرد مراسل لتصور التنمية الجنينية، والحركة، والأسماك ورم الخلايا في الجسم الحي.

التصور للنشاط الكهربائي الخلوية في الزرد الأجنة في وقت مبكر، والأورام

وقد استخدمت الزرد كالكائنات نموذج الوراثية الموثوقة في البحوث الطبية الحيوية، لا سيما مع ظهور تكنولوجيات تحرير الجينات. عندما تعمل اليرقات المتوقع، تحديد النمط الوراثي واستخراج الحمض النووي يمكن أن يكون تحديا. هنا، نحن تصف إجراء التنميط تتسم بكفاءة لليرقات الزرد، بقطع الذيل، أقرب وقت الإخصاب بعد 72-ح.

استخراج الحمض النووي الفائق والتنميط 3dpf الزرد يرقات بالقطع Fin

يمكننا وصف النهج للتلاعب بالجينات في النظام النموذجي التطوري مكسيكي أستياناكس. ويرد وصف ثلاث تقنيات مختلفة: ترانسجينيسيس Tol2 بوساطة، وتستهدف التلاعب جينوم استخدام كريسبر/Cas9، وضربه قاضية للتعبير باستخدام مورفولينوس. وينبغي تيسير هذه الأدوات التحقيق المباشر للجينات الكامنة وراء الاختلاف بين أشكال السطح والكهوف السكنية.

التلاعب بالجينات الدالة في كافيفيش المكسيكي

يصف هذا العمل بروتوكولا لنظام التحوير المعياري Tol2 ، وهو طريقة استنساخ قائمة على البوابة لإنشاء وحقن تركيبات معدلة وراثيا في أجنة الزرد.

نظام الزرد Tol2: نهج وراثي معياري ومرن قائم على البوابة

هنا ، نقدم بروتوكولا لتسمية البروتينات بعلامة بروتين مضان في يرقات سمك الزرد ، وهو نظام تم تطويره وتعديله حديثا في الجسم الحي مفيد بشكل خاص لتصور البروتينات منخفضة الوفرة في أسماك الزرد.

وضع العلامات الفلورية لتصور البروتينات منخفضة التعبير في أسماك الزرد

هنا ، نصف بروتوكولا لتوليد طفرة الأم التي تجمع بين zpc: cas9 مستقرة مع التسليم بوساطة Tol2 لأشرطة تعبير sgRNA.

توليد طفرات الأمهات باستخدام zpc: cas9 Knock-in Zebrafish

تعلم تقنية مصيدة الجينات باستخدام GAL4-VP16 في أجنة سمك الزرد لإنتاج طفرات وظيفية. تُمكّن هذه الطريقة الباحثين من تحليل الجينات وتتبع التعبير الجيني بدقة عالية.

الجينات الاصطياد عن طريق GAL4 في الزرد

استكشف المزيد من الفيديوهات