الجينات الاصطياد عن طريق GAL4 في الزرد
سبتمبر 29, 2013
يصف هذا البروتوكول طريقة فخ الجين إقحامي الطفرات باستخدام GAL4-VP16 كما مراسل الابتدائية وGFP / RFP كما صحفيين الثانوية في الزرد. حوالي واحد من كل عشرة عالية، معربا عن F0 محصول الأسماك الجين فخ ذرية المشترك، معربا عن GFP وطلب تقديم العروض. إجراءات الفحص يمكن زيادتها بسهولة للتكيف مع حجم المختبر أداء الشاشة الطفرات إقحامي.
الهدف العام من هذا الإجراء هو إنتاج أسماك متحولة باستخدام تبديل كسر الجينات على النواقل مع GAL four ، VP 16 كمراسل أساسي لمصيدة الجينات. يتم تحقيق ذلك عن طريق الحقن الأول لناقل مصيدة الجينات جنبا إلى جنب مع اثنين من الانتقالات الطويلة في أجنة الزرد. يتم فحص الأجنة المحقونة بحثا عن مضان GFP بعد ثلاثة أيام من الإخصاب ويتم اختيار ما يقرب من 30٪ من ألمع الأجنة لإنشاء تجمع F صفر.
بعد ذلك ، يتم عبور أسماك F zero إلى خط اختبار U-A-S-M-R-F-P للتحقق من انتقال السلالة الجرثومية لأحداث مصيدة الجينات. الخطوة الأخيرة هي تجاوز F1 لإنشاء F اثنين من الجيل وتوليد أجنة للتوصيف الجزيئي لأحداث مصيدة الجينات عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي وخمسة أجناس رئيسية. في النهاية ، يجب أن ينتج حوالي واحد من كل 10 أسماك F صفر تم فحصها ذرية مصيدة جينية.
تم تصميم التحويلات التي تكسير الجينات لإنتاج أي طفرات عند الاندماج في مداخل جينات ترميز البروتين. تستخدم نواقل GBT الخاصة بنا G four P 16 كمراسل أساسي لمصيدة الجينات. يزيد هذا التعديل من حساسية الجينات المعبر عنها بمستويات منخفضة ويجعل من الممكن لنا استخدام طفرات مصيدة الجينات دون تجنب الأنماط الظاهرية مثل G أربعة محركات للتعبير الخاص بالأنسجة عن الجينات المعدلة وراثيا الأخرى.
نعتقد أن عنق الزجاجة الرئيسي لطريقتنا هو تحقيق معدلات عالية بما فيه الكفاية من تكامل الجينات في السلالة الجرثومية لأسماك F صفر. في هذا العرض التوضيحي ، سنغطي العديد من الخطوات الحاسمة ، وإعداد الحمض النووي ، والحقن المجهري ، وفحص F صفر. يستخدم ناقل مصيدة الجينات الواحدة GBTB GAL four VP 16 كمراسل أساسي لمصيدة الجينات.
يتم استخدام الحد الأدنى من الطول اثنين من التبديل على الأطراف لتكامل مصيدة الجينات. يتم الكشف عن أحداث مصيدة الجينات مباشرة بواسطة مراسل EGFP تحت سيطرة 14 X GAL أربعة UAS. يحيط بشريط مصيدة الجينات بالكامل أقفال مباشرة مواقع P.
هذا يجعل أحداث مصيدة الجينات قابلة للعكس عن طريق التعبير عن أمشاط Cree لإثبات وجود علاقة سببية بين تكامل مصيدة جينية معينة ونمط ظاهري ملحوظ. بالإضافة إلى ذلك ، يحيط بشريط U-A-S-E-G-F-P مواقع FRT مباشرة. سيؤدي حقن أمشاط الوجه mRNA إلى استئصال كاسيت U-A-S-E-G-F-P ، مما يترك طفرة المصيدة الجينية غير مميزة بمضان EGFP وتمكين استخدامها في الخطوط المعدلة وراثيا التي تميز أنسجة معينة أو أحداث تنموية بواسطة مضان GFP قبل الحقن الدقيق.
تحضير التبديل على الحمض النووي ونقل mRNA. قم بإعداد GBTB ناقل ناقل مصيدة جينية واحدة. باستخدام مجموعة إعداد صغيرة قياسية واتباع بروتوكول الشركة المصنعة ، من الضروري تضمين خطوة غسيل PB عند تحضير الحمض النووي.
خلاف ذلك ، فإن الحمض النووي الإعدادي المصغر سوف يتلوث بالحمض النووي الريبي ، مما يؤدي إلى تدهور Mr.NA المنقولات ، وتخفيف الحمض النووي في الماء الحر من الحمض النووي الريبي إلى 10 نانوغرام لكل ميكرولتر. لتحضير الاثنين الطويلين ، يتم نقل mRNA أولا PT الخطي ثلاثة TS T اثنين باستخدام xbo واحد. بعد ذلك ، قم بنسخ الحمض النووي الخطي باستخدام آلة رسائل M T ثلاثة في مجموعة النسخ المختبري مع تعديل واحد.
أضف 0.5 ميكرولتر من مثبطات الحمض النووي الريبي لقفل الضلع بعد خطوة علاج الحمض النووي ، قم بتنقية الحمض النووي الريبي المرسال باستخدام مجموعة قياسية وقم بتقييم جودة الرنا المرسال المنسخ في المختبر بواسطة الرحلان الكهربائي لجل agros. قم بتخفيف mRNA في الماء الحر من الحمض النووي الريبي إلى 40 نانوغرام لكل ميكرولتر وتخزينه كحصتين ميكرولترتين عند سالب 80 درجة مئوية قبل الحقن الدقيق مباشرة. قم بإعداد مزيج الحقن عن طريق إضافة ثمانية ميكرولترات من التبديل المخفف على الحمض النووي إلى كمية ميكرولتر من mRNA المنقولة.
حقن ثلاثة نانولترات من خليط D-N-A-R-N-A في صفار أجنة أسماك الحمار الوحشي ذات الخلية الواحدة باستخدام تقنيات الحقن المجهري القياسية التي تهدف إلى واجهة تجديف صفار البيض بعد الحقن ، قم بتشغيل خمسة ميكرولترات من محلول الحقن المتبقي على هلام 1٪ aros لمراقبة الجودة للتأكد من أن mRNA المنقولة لم تتحلل بعد حوالي ست إلى ثماني ساعات من الحقن. قم بإزالة الأجنة غير المخصبة والميتة وتوزيع الأجنة على 60 إلى 80 لكل 100 ملليمتر طبق بتري. تتم إزالة الأجنة غير الطبيعية والميتة بعد يوم واحد من الإخصاب ، وبعد يومين من الإخصاب وثلاثة أيام بعد الإخصاب بعد ثلاثة أيام من الإخصاب تحت مجهر استريو مجهز بمضان أو مجهر عمودي.
فحص الأجنة وإزالة أي أجنة غير طبيعية. فحص الأجنة المتبقية دون عيوب علنية. بالنسبة لمضان GFP ، حدد ألمع أجنة F صفر وقم بتربيتها باستخدام إجراءات تربية أسماك الزرد الحمار الوحشي القياسية في هذا المختبر.
عادة ما يتم حقن GBTs في خطوط ذات أنماط تصبغ من النوع البري أو النمر. من المعقول أن نتوقع أن 20 إلى 30٪ من الأجنة المحقونة المختارة للتربية ستبقى على قيد الحياة حتى مرحلة البلوغ. يمكن أن يؤدي دمج ناقل مصيدة الجينات الواحدة GBTB إلى تعبير EGFP بواسطة آليتين مختلفتين.
الأول هو حدث مصيدة جينية حقيقي. يتكامل المتجه في جين ، يتم تصنيع نسخة اندماج بين الخمسة الأولية من هذا النسخة الجينية الداخلية و GAL four VP 16 وترجمتها إلى بروتين اندماج يحتوي على الطرف النهائي للبروتين ومغطى بالجين المتحور المدرج و GAL أربعة ، VP 16. يرتبط بروتين الاندماج هذا ب 14 XUAS وينشط نسخ EGFP.
الحدث الثاني الأقل جاذبية هو مصيدة المحسن. يقع الحد الأدنى من المروج أمام EGFP تحت سيطرة محسن بالقرب من موقع التكامل مما يؤدي إلى إنتاج EGFP في غياب GAL four ، VP 16. للتمييز بين هاتين الفئتين من الأحداث ، تم عمل خط معدل وراثيا 14 X-U-A-S-M-R-F-P مميز ب GFP بلوري جاما الخاص بالعدسة.
يتم التحقق من أحداث المصيدة الجينية عن طريق تهجين الأسماك المحقونة GBT مع أسماك U-A-S-M-R-F-P متماثلة اللواقح وفحص التعبير المشترك ل GFP و RFP ، وهو أمر ممكن فقط إذا تم صنع GAL four و VP 16 وتنشيط U-A-S-M-R-F-P في العابر لبدء إجراء فحص الأسماك F صفر الفردية مع أسماك U-A-S-M-R-F-P متماثلة اللواقح. نظرا لأن الأسماك المحقونة GBT لها أنماط تصبغ من النوع البري أو النمر وخط U-A-S-M-R-F-P متماثل اللواقح في خلفية نحاسية ، يمكن تمييز الأسماك F zero بسهولة عن أسماك U-A-S-M-R-F-P مما يلغي الحاجة إلى تسجيل ما إذا كان F صفر الذي يتم فحصه ذكرا أم أنثى ، بالإضافة إلى الأخطاء المحتملة الناتجة عن الأخطاء في تسجيل و/أو تحديد جنس كل سمكة. في اليوم التالي.
أعد الأسماك النحاسية U-A-S-M-R-F-P إلى حوضها. ضع سمكة F صفر التي أعطت الأجنة في أحواض ثابتة فردية بينما يتم جمع الأجنة لفحص الأجنة نظيفة ونقلها إلى أطباق بتري جديدة بعد ظهر اليوم الصفر. فحص الأجنة بحثا عن فلورة GFP و RFP بعد يوم واحد من الإخصاب وثلاثة أيام بعد الإخصاب.
اسحب الأجنة الإيجابية لكل من GFP و RFP ، وقم بفرزها حسب نمط تعبير G-F-P-R-F-P. إذا لوحظ أكثر من نمط واحد في القابض ورفعها لإنشاء جيل F1. لاحظ أن أجنة 3D PF الإيجابية ل GFP ولكن ليس لطلب تقديم العروض لا يتم سحبها لأنها تمثل أحداث مصيدة المحسن.
اعبر سمكة F صفر التي أنتجت ذرية إيجابية G-F-P-R-F-P مرة أخرى للحصول على دفعة ثانية من الإيجابيات. يتم فحص أسماك F1 لإنشاء عائلتين F لتوثيق نمط التعبير الجيني trapp وتجميد دفعات من الأجنة للتحديد الجزيئي لمواقع مصيدة الجينات أولا عبر أسماك F1 الفردية مع أسماك U-A-S-M-R-F-P متماثلة اللواقح في اليوم التالي. ضع سمكة F1 التي أعطت الأجنة في أحواض ثابتة فردية بينما يتم جمع الأجنة للفحص في يوم واحد بعد الإخصاب.
ربما لم يتم وضع العلامات على RFP بعد ، لذا قم بفحص الأجنة بحثا عن مضان GFP واسحب الأجنة الإيجابية ل GFP بعد ثلاثة أيام من الإخصاب لكل من تألق GFP و RFP واسحب الإيجابيات المزدوجة. ثم قم بتصوير الأجنة الإيجابية لكل من GFP و RFP بعد خمسة أيام من الإخصاب ، قم بتجميد دفعات من 20 G-F-P-R-F-P إيجابية و 20 G-F-P-R-F-P سلبية لتحديد الجينات المتحولة المدخلة عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي وخمسة أجناس أولي. قم برفع الأجنة الإيجابية المتبقية G-F-P-R-F-P لإنشاء الجيل F الثاني في حقن ناجح.
مالا يقل عن 80٪ من الأجنة التي تم حقنها بمصيدة الجينات ، سيظهر مزيج mRNA طويل القامة بنقل اثنين من mRNA درجة معينة من مضان GFP. يشير تعبير GFP المنخفض إما إلى الحقن غير الناجح أو تدهور الحمض النووي الريبي المنقول بسبب تلوث الحمض النووي الريبي. عندما يتم اختيار ألمع أجنة إيجابية GFP لإنشاء تجمع F صفر ، فإن حوالي واحد من كل 10 أسماك F صفر تم فحصها سينتج ذرية مصيدة جينية بين أسماك F صفر التي يتم استرداد أحداث المصيدة الجينية منها.
ينقل معظمهم حدث مصيدة جينية واحدة بالإضافة إلى العديد من عمليات التبديل غير التعبيرية عند عمليات التكامل. نظرا لأن كاسيت مصيدة الجينات بالكامل محاط بأقفال مباشرة مواقع P ، فإن أي طفرات في مصيدة الجينات الموضحة في هذا الرسم البياني مع المربعات الزرقاء التي تمثل إكسونات الجين المتحور يمكن عكسها عن طريق التعبير عن أمشاط CRE. تظهر هذه الصور التعبير المشترك ل GFP و RFP في الجهاز العصبي ل NSF TP ستة حقن خط مصيدة الجينات ل Cree RNA في N SF TP ستة أجنة يؤدي إلى فقدان تعبير GFP و RFP.
لاحظ أنه لا يوجد انخفاض في تعبير GFP في العدسة كما هو متوقع. تنطبق معظم الإجراءات الموضحة هنا على شاشات مصيدة الجينات الأخرى بالإضافة إلى تجارب التحول المنتظمة مع TOL two والينقولات الأخرى مع إجراء مصيدة الجينات الموضح هنا. يجب أن يؤدي إعداد 20 إلى 30 درجة فهرنهايت صفر في الأسبوع إلى استعادة مصيدة جينية واحدة في الأسبوع.
ومع ذلك ، يمكن توسيع نطاق الإجراء بسهولة.
نظرة عامة
يصف هذا البروتوكول طريقة لطفرات الإدخال عن طريق مصيدة الجين في أسماك الزرد باستخدام Gal4-VP16 كمبلغ أولي وGFP/RFP كمبلغات ثانوية. تسمح الإجراء بتحديد ذرية مصيدة الجين التي تعبر بشكل مشترك عن GFP وRFP، مع عملية فحص يمكن توسيع نطاقها وفقًا لحجم المختبر.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الوراثة
- علم الأحياء النمائي
- نماذج مهندسة وراثيًا
الخلفية
- طفرات الإدخال عن طريق مصيدة الجين هي تقنية تُستخدم لإنشاء طفرات في جينات محددة.
- يعمل Gal4-VP16 كمبلغ حساس للتعبير الجيني.
- يتم استخدام GFP وRFP لتصور أحداث مصيدة الجين.
- تهدف الطريقة إلى تقليل الطفرات غير المرغوب فيها أثناء التكامل.
هدف الدراسة
- إنتاج أسماك زرد متحولة لتحليل الجينات الوظيفية.
- تعزيز حساسية اكتشاف التعبير الجيني.
- تأسيس طريقة فحص موثوقة لأحداث مصيدة الجين.
الطرق المستخدمة
- حقن مشترك لمتجهات مصيدة الجين وmRNA من النواقل الانتقالية في أجنة أسماك الزرد.
- فحص التألق GFP بعد ثلاثة أيام من الإخصاب.
- تقاطع الأسماك F0 مع خطوط U-A-S-M-R-F-P للتحقق من انتقال الخط الجرثومي.
- تقاطع F1 لتأسيس جيل F2 للتوصيف الجزيئي.
النتائج الرئيسية
- تم اختيار حوالي 30٪ من الأجنة الأكثر سطوعًا لتحليل إضافي.
- أنتجت سمكة واحدة من كل عشرة سمكات F0 ذرية مصيدة الجين.
- تم تأكيد أحداث مصيدة الجين من خلال التعبير المشترك عن GFP وRFP.
- تم تحديد آليات التكامل، بما في ذلك أحداث مصيدة الجين الحقيقية ومصيدة المُعزز.
الاستنتاجات
- تقوم الطريقة بشكل فعال بتوليد أسماك زرد متحولة لدراسات وظيفة الجينات.
- تعتبر المعدلات العالية لتكامل مصيدة الجين حاسمة للنتائج الناجحة.
- يسمح هذا النهج بتمييز أحداث مصيدة الجين بشكل قابل للعكس لمزيد من البحث.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Gene trap insertional mutagenesis in zebrafish enables high-throughput functional annotation of genes in a vertebrate system, supporting target validation and mechanistic de-risking in early discovery. The use of Gal4-VP16 as a primary reporter enhances sensitivity for low-abundance transcripts and allows converted trap lines to serve as tissue-specific drivers for transgene expression, facilitating pathway interrogation and phenotypic screening. This approach improves predictive confidence by linking genotype to tissue-specific phenotypes without relying on overt developmental defects, particularly valuable for genes with redundant or non-essential functions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through insertional mutagenesis that tags endogenous gene expression with Gal4-VP16 for sensitive detection.
- Operational Value: Generates reversible gene trap mutations via loxP-flanked cassettes, allowing causal validation of phenotype-genotype relationships through Cre-mediated excision.
- Scientific Value: Supports functional target validation by converting trapped loci into Gal4 drivers to direct expression of effector transgenes in specific tissues, clarifying gene function in disease-relevant contexts.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces quantitative dual-reporter readouts (GFP/RFP co-expression) to distinguish true gene trap from enhancer trap events, improving assay specificity.
- Operational Value: Establishes a scalable germline transmission pipeline where ~10% of screened F0 founders yield transmissible gene trap alleles, supporting consistent mutant line generation.
- Scientific Value: Enables preparation of validated biological systems for downstream screening by freezing batches of double-positive embryos for molecular identification of trap loci via inverse PCR and 5' RACE.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Recovers trap mutations in genes encoding nuclear, cytoplasmic, and membrane proteins, ensuring broad target coverage without bias toward nuclear localization.
- Operational Value: Facilitates translational continuity by enabling F2 intercrosses to document expression patterns and freeze embryos for genotyping, supporting preclinical validation workflows.
- Scientific Value: Promotes mechanistic de-risking by allowing reversible marking of mutations, thus distinguishing causal gene trap integrations from positional effects in phenotypic screens.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early mutagenesis through lead identification, where gene trap lines serve as both mutant alleles and Gal4 drivers for pathway-specific transgene expression, supporting iterative target validation and assay refinement.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by tagging endogenous loci with Gal4-VP16 to monitor expression dynamics in vivo during chemical or genetic perturbation.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible quantitative outputs via GFP/RFP co-expression scoring, enabling standardized comparison of mutant and wild-type conditions across screening campaigns.
- Analytics: Generates molecular readouts (inverse PCR, 5' RACE) that enable precise identification of trapped genes, supporting data-driven target prioritization.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical continuity by preserving embryos for genotyping and expression analysis, ensuring phenotypic observations are linked to validated genetic lesions.
- Enterprise Reuse: Establishes a reversible, scalable platform where founder fish can be repeatedly outcrossed to generate F2 families, supporting longitudinal studies and cross-project reagent sharing.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by enhancing detection of low-expression genes and enabling tissue-specific transgene expression without requiring phenotypic penetrance.
- Operational Value: Standardizes mutant generation through defined injection ratios, fluorescence-based sorting, and germline transmission screening, improving reproducibility across labs.
- Strategic Value: Reduces biological risk in lead identification by providing reversible, allele-specific models for target validation, minimizing false positives from insertional artifacts.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization through allelic series generation and phenotypic deconvolution, supporting go/no-go decisions based on mechanistic evidence rather than phenotypic severity alone.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish microinjection, fluorescence screening, and transgenic line maintenance.
- Dependent on functional transposase mRNA and high-purity DNA preparation, including PB wash steps to prevent RNA contamination.
- Necessitates standardized crossing schemes with UAS-mRFP reporter lines to distinguish gene trap from enhancer trap events via co-expression scoring.
- Involves adaptation considerations for genes encoding secreted or membrane proteins, as N-terminal fusions may impair Gal4-VP16 nuclear localization and transcriptional activity.
- Subject to practical limitations in germline transmission efficiency, where optimizing F0 screening and outcrossing frequency impacts mutant recovery rates.
![Microinjection من مرنا والعقاقير [أليغنوكليوتيد] Morpholino اسماك الزرد في الأجنة.](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F1113.jpg%3Fv%3D2026-07-07T10%253A56%253A25.171Z&w=384&q=75)
