Name: قياسات جمود العاطفة من البوليمرات الحيوية باستخدام فحوصات الانزلاق (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: تعلم قياس جمود العاطفة للأنابيب الدقيقة باستخدام فحص الانزلاق المحرك بالكينيسين. تُحدد هذه الطريقة طول الثبات لكل أنبوب دقيق على حدة وتُسهم في فهم ميكانيكا الهيكل الخلوي.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

نشكر ميليسا Klocke للحصول على المساعدة وإعداد الشكل 1 راتليف آنا لبيان البروتوكول. وأيد هذا العمل من قبل هيئة البحوث للتقدم العلوم.

1. أنيبيب الانزلاق الفحص حلول للسهم إعداد مقايسة قبل مزلق. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتبلمر ميكروتثبول 0.5 مغ المسمى قليلة مع fluorophore العضوية مشرق 22. تركيز التسمية الهدف هو 1 ميكرون من fluorophore في أنيبيب، أو وضع العلامات من الكثافة ما يقرب من 1 في fluorophore dimers تويولين 1،500. متجر في ضوء الغرفة، ودرجة الحرارة حماية بورق الألمنيوم لمدة تصل إلى أسبوعين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنقية البيوتين-21 في كينيسين حوالي 1 ميكرومتر. المحل في -80 درجة مئوية في 5 ميكرولتر مأخوذة لاستخدامها في التجارب الفردية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد مقايسة المخزن المؤقت (AB) من imidiazole 50 مم، 50 مم كلوريد البوتاسيوم (بوكل)، و 4 ملي كلوريد المغنيسيوم (MgCl 2)، 2 مم جلايكول الإثيلين tetraacetic حمض (EGTA)، ودرجة الحموضة 6.7. تصفية العقيمة وتخزينها في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل الأبقار مصل الزلال المعقدة البيروكسيديز (البيوتين-BSA) إلى 2 ملغ / مل في AB. تصفية مع 0.2 ميكرون تصفية حقنة.المحل في -80 درجة مئوية في 100 ميكرولتر مأخوذة لفترات طويلة، في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل streptavidin (SA) إلى 10 ملغ / مل في AB. تصفية مع 0.2 ميكرون تصفية حقنة. المحل في -80 درجة مئوية في 20 ميكرولتر مأخوذة لفترات طويلة، في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل α-الكازين إلى 5 ملغ / مل في AB. تصفية مع 0.2 ميكرون تصفية حقنة. المحل في -80 درجة مئوية في 100 ميكرولتر مأخوذة لفترات طويلة، في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل dithiothreitol (DTT) في الماء منزوع الأيونات في 200 ملم. المحل في -20 درجة مئوية في 100 ميكرولتر مأخوذة، استخدم ساعة في غضون 8 من الذوبان. يمكن أن يكون أعيد تجميدها مرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل باكليتاكسيل (PT) في الصف HPLC سلفوكسيد ثنائي ميثيل (DMSO) في 4 مم. متجر في 10 ميكرولتر مأخوذة في -80 ° C المدى الطويل، -20 ° C على المدى القصير. استخدام في غضون 8 ساعات من الذوبان. يمكن أن يكون أعيد تجميدها مرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل الجلوكوز في الماء منزوع الأيونات في 120 ملغ / مل. مخزن في 100 ميكرولتر مأخوذة في -20 ° C. يمكن أن يكون أعيد تجميدها مرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ديسحل الأدينوساين ثلاثي (ATP) في الماء منزوع الأيونات في 150 مم، 7.0 درجة الحموضة. متجر في 5 ميكرولتر مأخوذة في -80 ° C، استخدم ساعة في غضون 8 من الذوبان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الأسهم 100X الأكسجين الكسح 25 بحلول حل 10000 أوكسيديز الجلوكوز وحدات وحدات و156،000 الكاتلاز إلى 600 ميكرولتر العازلة الفحص الإجمالي. أجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة في ميكروسنتريفوج إلى المواد الصلبة بيليه؛ طاف مرشح مع 0.2 ميكرون تصفية حقنة. المحل في -80 درجة مئوية في 10 ميكرولتر مأخوذة لفترات طويلة، في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد. </li></ol> 2. أنيبيب الانزلاق الفحص، ونفس إعداد الحل اليوم إعداد الحلول في 2،1-2،6 في يوم التجربة. مع الممارسة، يمكن إعداد حلول 2،2-2،6 خلال تدفق خلايا الغسيل. ما لم يذكر خلاف ذلك، والحفاظ على حلول الأسهم على الجليد. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد AB، 1 مل من العازلة مقايسة مع 10 ميكرولتر من DTT الأسهم (AB مع DTT ملم 2). تبقي في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحيوي BSA العازلة، 40 &amp; مو؛ لتر من خليط 1:1 من المخزون البيوتين-BSA وAB. تبقي في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد BSA العازلة، خلط 645 ميكرولتر من AB مع 5.5 ميكرولتر BSA (1 ملغ / مل BSA في AB). تبقي في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد SA العازلة، والاختلاط 57 ميكرولتر من AB مع 3 streptavidin الأسهم ميكرولتر (0.5 ملغ / مل في streptavidin AB). تبقي في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد α-الكازين العازلة، خلط 200 ميكرولتر من العازلة BSA، و 50 ميكرولتر الأسهم الكازين، و 0.8 ميكرومتر ATP ميكرولتر من 15 (1 ملغ / مل α-الكازين، 0.8 ملغ / مل BSA، و 50 نانومتر في ATP AB). تبقي في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد مضان مكافحة التبييض العازلة، والاختلاط 95 ميكرولتر العازلة الكازين-α، 2.5 ميكرولتر الجلوكوز المخزون، 1 ميكرولتر مزيج الأكسجين 100X الكسح، 1 ميكرولتر الأسهم باكليتاكسيل، 1 ميكرولتر 2-المركابتويثانول (βME). إضافة βME تحت غطاء محرك السيارة الدخان. استخدام مضان مكافحة التبييض عازلة داخل 1 ساعة إعداد تنبيه: βME شديد السمية ورائحة فظيعة. تأكد من فتح فقط تحت غطاء محرك السيارة الدخان. متجر في زجاجةغياب الضوء؛ ضوء يحط βME وقدرتها على خفض photobleaching. </li></ol> 3. أنيبيب الانزلاق الفحص <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بناء الممرات حول تدفق الأربع بين ساترة × 24 مم 60 و 22 × 22 مم باستخدام ساترة الشحوم فراغ، مقذوف من حقنة من خلال تلميح ماصة، كفاصل. يجب أن تكون كل حارة تدفق حوالي 10 ميكرولتر من حيث الحجم (حجم اللاحقة وفقا لذلك النطاق). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل 10 ميكرولتر من العازلة الحيوي BSA في كل حارة. احتضان 5 دقائق للسماح للBSA معطف السطوح الزجاجية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل كل حارة ثلاث مرات مع 15 ميكرولتر العازلة BSA لإزالة مجانا البيوتين-BSA، مع الاستمرار في منع سطح الشريحة. استخدام ورق الترشيح أو Kimwipe لإزالة العازلة من الجانب الآخر من الغرفة تدفق، ويجري التأكد من عدم السماح فقاعات الهواء من خلال الذهاب الى غرفة التدفق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل ميكرولتر 15 SA-العازلة في كل حارة. الانتظار 10 دقيقة، أو ساعة لتصل إلى 2. فإن streptavidin ربط BSA-البيوتين سطح محدد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل كل حارة ثلاث مرات مع 15 ميكرولتر العازلة BSA لإزالة مجانا SA مع الاستمرار في منع سطح الشريحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل كل حارة مع 15-α العازلة ميكرولتر الكازين. α-الكازين يساعد منع مزيد غير محددة ملزمة للكينيسين وميكروتثبول على الزجاج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع كينيسين إلى 10 نانومتر في α-الكازين العازلة ويغسل كل حارة مع 15 ميكرولتر من هذا كينيسين - α-الكازين الحل. الانتظار 15 دقيقة (أو ما يصل إلى ساعة واحدة) لكينيسين المعقدة البيروكسيديز لربط تحديدا إلى streptavidin سطح محدد. والمحرك المجالات كينيسين تظل حرة في ربط الأنابيب الدقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع باكليتاكسيل إلى 40 ميكرومتر في درجة حرارة الغرفة α-الكازين العازلة، ويغسل كل حارة مع 15 ميكرولتر من هذا الحل لتغسل كينيسين الحرة ومسبقا تحميل كل غرفة تدفق بمحلول باكليتاكسيل لمنع ميكروتثبول من depolymerizing. depolymerizes الباردة أيضا ميكروتثبول، لذلك تأكد من هذه الخطوات تحدث في درجة حرارة الغرفة مع غرفة temperatuإعادة الحلول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع fluorescently المسمى ميكروتثبول 1:100-1:1،000 في مكافحة التبييض العازلة مضان مع ATP مم 1. غسل ميكرولتر 15 في مسار واحد ونلاحظ في غضون 30 دقيقة. </li></ol> 4. جمع البيانات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مراقبة مزلق باستخدام المجهر مضان ميكروتثبول؛ مطلوب المجهر قادرة على حل واحد fluorophores مثل الإعداد TIRF تجارية أو بناء منزل-26 (الشكل 2). وينبغي دفع ميكروتثبول من قبل محركات كينيسين على الركيزة في حوالي 0.5 ميكرون / ثانية، اعتمادا على درجة الحرارة. إذا كان الحقل من رأي من المجهر هو 50 ميكرون، وينبغي أن تكون واضحة ميكروتثبول الفردية لحوالي 100 ثانية. تعيين شدة الإضاءة بحيث fluorophores واحد لا photobleach بسرعة أكبر من 100 ثانية. في حالة استخدام الإثارة الليزر، وهو وضع قوة حوالي 3-5 ميغاواط مناسبا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع متواليات من الصور للتحليل. 600 الصور في5 هرتز (2 إجمالي دقيقة) يعمل بشكل جيد. استخدام تسلسل طويلة بما فيه الكفاية أن ميكروتثبول اجتياز كامل مجال للرؤية. </li></ol> 5. تحليل البيانات روتين IDL، <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50117/50117IDL_Routines.zip" target="_blank">get_lp.pro</a> يتم إرفاق. هذا الروتين بإرجاع قيمة طول استمرار بناء على كل مزلق ميكروتثبول في تسلسل الصور معين. إما تشغيل هذا الروتين في كل تسلسل الصور، وتعديل المعلمات اعتمادا على شدة الإعداد المجهر معينة، أو القيام بما يلي: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتبع كل fluorophore تعلق على أنيبيب لخلق مسارات fluorophore. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الجمع بين جميع المسارات من fluorophores على أنيبيب نظرا إلى مسار أنيبيب الشاملة؛ تكرار لكل أنيبيب في تسلسل الصور (الشكل 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب الزاوية الظل الى كل نقطة على طول المسار (الشكل 4)، وحساب &lt;cos θ سبت&gt; في المعادلة. 1 من المتوسط ​​جيب تمام الزاوية من الفرق لكل زوج من نقاط مفصولة ق مسار بطول (الشكل 5). العثور على طول استمرار لأنيبيب واحد أو مجموعة من الأنابيب الدقيقة من قبل &lt;cos المناسب θ سبت&gt; لالمعادلة. 1، الترجيح نقاط البيانات الفردية في مجال التجهيزات من قبل عدد من القيم مستقلة عن كوس θ ق التي يتم استخدامها لحساب المتوسط. </li></ol>

<ol><li>Hawkins, T., Mirigian, M., Selcuk Yasar, M., Ross, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanics+of+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomechanics%22%5BJournal%5D)">Mechanics of microtubules.</a> Journal of biomechanics. 43, 23-30 (2010).</li>
<li>Pampaloni, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermal+fluctuations+of+grafted+microtubules+provide+evidence+of+a+length-dependent+persistence+length%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+national+academy+of+sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Thermal fluctuations of grafted microtubules provide evidence of a length-dependent persistence length.</a> Proceedings of the national academy of sciences U S A. 103, 10248-10253 (2006).</li>
<li>Taute, K. M., Pampaloni, F., Frey, E., Florin, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+dynamics+depart+from+the+wormlike+chain+model%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+review+letters%22%5BJournal%5D)">Microtubule dynamics depart from the wormlike chain model.</a> Physical review letters. 100, 028102(2008).</li>
<li>Van den Heuvel, M. G., de Graaff, M. P., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+curvatures+under+perpendicular+electric+forces+reveal+a+low+persistence+length%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+national+academy+of+sciences+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Microtubule curvatures under perpendicular electric forces reveal a low persistence length.</a> Proceedings of the national academy of sciences U.S.A. 105, 7941-7946 (2008).</li>
<li>Gittes, F., Mickey, B., Nettleton, J., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flexural+rigidity+of+microtubules+and+actin+filaments+measured+from+thermal+fluctuations+in+shape%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Flexural rigidity of microtubules and actin filaments measured from thermal fluctuations in shape.</a> Journal of cell biology. 120, 923-934 (1993).</li>
<li>Brangwynne, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bending+dynamics+of+fluctuating+biopolymers+probed+by+automated+high-resolution+filament+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Bending dynamics of fluctuating biopolymers probed by automated high-resolution filament tracking.</a> Biophysical journal. 93, 346-359 (2007).</li>
<li>Cassimeris, L., Gard, D., Tran, P. T., Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XMAP215+is+a+long+thin+molecule+that+does+not+increase+microtubule+stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cell+science%22%5BJournal%5D)">XMAP215 is a long thin molecule that does not increase microtubule stiffness.</a> Journal of cell science. 114, 3025-3033 (2001).</li>
<li>Valdman, D., Atzberger, P. J., Yu, D., Kuei, S., Valentine, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+analysis+methods+for+the+robust+measurement+of+the+flexural+rigidity+of+biopolymers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical%22%5BJournal%5D)">Spectral analysis methods for the robust measurement of the flexural rigidity of biopolymers.</a> Biophysical. 102, 1144-1153 (2012).</li>
<li>van Mameren, J., Vermeulen, K. C., Gittes, F., Schmidt, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leveraging+single+protein+polymers+to+measure+flexural+rigidity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+physical+chemistry+b%22%5BJournal%5D)">Leveraging single protein polymers to measure flexural rigidity.</a> Journal of physical chemistry b. 113, 3837-3844 (2009).</li>
<li>Hua, W., Chung, J., Gelles, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinguishing+inchworm+and+hand-over-hand+processive+kinesin+movement+by+neck+rotation+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Distinguishing inchworm and hand-over-hand processive kinesin movement by neck rotation measurements.</a> Science. 295, 844-848 (2002).</li>
<li>Duke, T., Holy, T. E., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22Gliding+assays%22+for+motor+proteins%3A+A+theoretical+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+review+letters%22%5BJournal%5D)">"Gliding assays" for motor proteins: A theoretical analysis.</a> Physical review letters. 74, 330-333 (1995).</li>
<li>Mehrbod, M., Mofrad, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+significance+of+microtubule+flexural+behavior+in+cytoskeletal+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+one%22%5BJournal%5D)">On the significance of microtubule flexural behavior in cytoskeletal mechanics.</a> PLoS one. 6, e25627(2011).</li>
<li>Szarama, K. B., Gavara, N., Petralia, R. S., Kelley, M. W., Chadwick, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeletal+changes+in+actin+and+microtubules+underlie+the+developing+surface+mechanical+properties+of+sensory+and+supporting+cells+in+the+mouse+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cytoskeletal changes in actin and microtubules underlie the developing surface mechanical properties of sensory and supporting cells in the mouse cochlea.</a> Development. 139, 2187-2197 (2012).</li>
<li>Gal, N., Weihs, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+Mechanics+and+Activity+of+Breast+Cancer+Cells+Correlate+with+Metastatic+Potential%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+biochemistry+and+biophysics%22%5BJournal%5D)">Intracellular Mechanics and Activity of Breast Cancer Cells Correlate with Metastatic Potential.</a> Cell biochemistry and biophysics. , (2012).</li>
<li>Volokh, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+tensegrity+in+cell+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biomech%22%5BJournal%5D)">On tensegrity in cell mechanics.</a> Mol. Cell Biomech. 8, 195-214 (2011).</li>
<li>Kasas, S., Dietler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+for+measuring+microtubule+stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22Current+nanoscience%22%5BJournal%5D)">Techniques for measuring microtubule stiffness.</a> Current nanoscience. 3, 85-96 (2007).</li>
<li>Kikumoto, M., Kurachi, M., Tosa, V., Tashiro, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flexural+rigidity+of+individual+microtubules+measured+by+a+buckling+force+with+optical+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Flexural rigidity of individual microtubules measured by a buckling force with optical traps.</a> Biophysical journal. 90, 1687-1696 (2006).</li>
<li>Venier, P., Maggs, A. C., Carlier, M. F., Pantaloni, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+microtubule+rigidity+using+hydrodynamic+flow+and+thermal+fluctuations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Analysis of microtubule rigidity using hydrodynamic flow and thermal fluctuations.</a> Journal of biological chemistry. 269, 13353-13360 (1994).</li>
<li>van den Heuvel, M. G., Bolhuis, S., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence+length+measurements+from+stochastic+single-microtubule+trajectories%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+letters%22%5BJournal%5D)">Persistence length measurements from stochastic single-microtubule trajectories.</a> Nano letters. 7, 3138-3144 (2007).</li>
<li>Phillips, R., Kondev, J., Theriot, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPhillips%2C+R+%22Physical+biology+of+the+cell%22">Physical biology of the cell</a>. , Garland Science. (2008).</li>
<li>Berliner, E., Young, E. C., Anderson, K., Mahtani, H. K., Gelles, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Failure+of+a+single-headed+kinesin+to+track+parallel+to+microtubule+protofilaments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Failure of a single-headed kinesin to track parallel to microtubule protofilaments.</a> Nature. 373, 718-721 (1995).</li>
<li>Anderson, E. K., Martin, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescent+GTP+analog+as+a+specific%2C+high-precision+label+of+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">A fluorescent GTP analog as a specific, high-precision label of microtubules.</a> Biotechniques. 51, 43-48 (2011).</li>
<li>Hyman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+modified+tubulins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Preparation of modified tubulins.</a> Methods in enzymology. 196, 478-485 (1991).</li>
<li>Lee, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curve+reconstruction+from+unorganized+points%5BTitle%5D)+AND+%22Computer+aded+geometric+design%22%5BJournal%5D)">Curve reconstruction from unorganized points.</a> Computer aded geometric design. 17, 161-177 (2000).</li>
<li>Yildiz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+V+walks+hand-over-hand%3A+Single+fluorophore+imaging+with+1.5-nm+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Myosin V walks hand-over-hand: Single fluorophore imaging with 1.5-nm localization.</a> Science. 300, 2061-2065 (2003).</li>
<li>Friedman, L. J., Chung, J., Gelles, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viewing+dynamic+assembly+of+molecular+complexes+by+multi-wavelength+single-molecule+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical%22%5BJournal%5D)">Viewing dynamic assembly of molecular complexes by multi-wavelength single-molecule fluorescence.</a> Biophysical. 91, 1023-1031 (2006).</li>
<li>Smith, C. S., Joseph, N., Rieger, B., Lidke, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast%2C+single-molecule+localization+that+achieves+theoretically+minimum+uncertainty%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast, single-molecule localization that achieves theoretically minimum uncertainty.</a> Nature Methods. 7, 373-375 (2010).</li>
<li>Nitzsche, B., Ruhnow, F., Diez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantum-dot-assisted+characterization+of+microtubule+rotations+during+cargo+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Quantum-dot-assisted characterization of microtubule rotations during cargo transport.</a> Nature. 3, 552-556 (2008).</li>
</ol>

الكتاب تعلن أنه ليس لديهم المصالح المتنافسة المالية.

قياسات طول استمرار هي توصيف جيد من الخواص الميكانيكية للالبوليمرات الحيوية الفردية. في هذه المقالة، ووصف لنا طريقة لقياس طول استمرار ميكروتثبول. كما لوحظ في المقدمة، ويمتد هذا الأسلوب بسهولة إلى دراسة الخصائص الميكانيكية أنيبيب في مجموعة متنوعة من الظروف ببساطة من خلال تغيير الكواشف، ودرجة الحرارة، أو اللزوجة في الخطوة الأخيرة من الفحص مزلق، 3.9، أو عن طريق بلمرة ميكروتثبول، خطوة 1.1، في ظل ظروف مختلفة. هذه التقن...

الهيكل الخلوي، وهي شبكة من البوليمرات الحيوية موجودة في الخلايا حقيقية النواة الأكثر، يلعب دورا في تنظيم الخلوية، والنقل داخل الخلايا، والميكانيكا الخلية. الخصائص الميكانيكية للالبوليمرات الحيوية من الهيكل الخلوي (أكتين في المقام الأول وميكروتثبول) تلعب دورا هاما في تحديد الخواص الميكانيكية للخلية كما في 12 كله. منذ ميكانيكا خلية كاملة يمكن أن تميز الخلايا السليمة والمريضة 13،14 وتشارك في الحركة الخلوية 15، وكانت الخواص الميكانيكية للهيكل الخلية الأساسية في مكونات منطقة نشطة للدراسة على مدى العقدين الماضيين 1. وتتميز بالمرونة (أو تصلب) من البوليمرات الحيوية من طول استمرار، وطول البوليمر الذي ينحني من راديان واحد تقريبا تحت تقلبات الحرارية عند درجة حرارة الغرفة. وقد تم تطوير عدد من التقنيات لقياس طول استمرار 16، لأمثلتقنيات جنيه بالموقع التي تنطوي على الانحناء البوليمر باستخدام تدفق الهيدروديناميكية، والفخاخ البصرية، أو المجالات الكهربائية 4،17،18، وتقنيات قياس السلبي الذي تقلبات البوليمرات الحرة في حل 5،6. القياسات بالموقع، ومع ذلك، تتطلب الاجهزة المتخصصة لتنفيذ القوات المعروفة على مقياس الميكرومتر، وقياسات الحرة تقلب يمكن أن يكون تحديا بسبب نشرها من الطائرة من تركيز المجهر المستخدمة. في هذه المقالة، ونحن تصف، السلبي التكميلية، تقنية لقياس طول استمرار ميكروتثبول، بوليمر هيكل الخلية. والأسلوب الذي ينطوي المقايسات مزلق، والتي تضمن أن يبقى دائما البوليمر في المستوى البؤري 19. وعلاوة على ذلك، فإنه ينطوي fluorophores واحدة تتبع تثبت بصورة دائمة على البوليمر في المصالح، بحيث تتميز كذلك مواقع محددة على طول البوليمر. ويرد كارتون الأسلوب في الارقام ..ه 1. كينيسين يتحرك على وجه التحديد في أواخر + من الأنابيب الدقيقة، بحيث يتم دفع ميكروتثبول مزلق في مقايسة unidirectionally. نهاية الرائدة في مجال أنيبيب، وراء كينيسين مشاركة المرفقة، حر في أن تتقلب تحت قوات الحرارية من الحل المحيطة بها. كما دفعت أنيبيب إلى الأمام، حتى نهاية يتقلب الربط إلى جزيء جديد كينيسين على امتداد شريحة زجاجية يتجمد في تذبذب معين. لأن تعلق كينيسين ميكروتثبول بقوة، يتم تقييد أنيبيب لمتابعة مسار نهاية الرائدة. ولذلك، فإن التقلبات الإحصائية المجمدة في مسار أنيبيب هي نفس التقلبات الإحصائي للنهاية خالية من الأنابيب الدقيقة 11، وبالتالي يمكن استخدامها لحساب طول استمرار فقا إلى 20 <img alt="المعادلة 1" fo:content-width="1in" fo:src="/files/ftp_upload/50117/50117eq1highres.jpg" srج = &quot;/ files/ftp_upload/50117/50117eq1.jpg&quot; /&gt; حيث L هو طول ع استمرار أنيبيب، θ s هو الزاوية بين الظلال لمسار مفصولة كفاف ق الطول، و&lt;&gt; يدل على متوسط ​​على كل زوج من المواقف مفصولة كفاف ق الطول. الفحص مزلق نفسه يستخدم المعقدة البيروكسيديز كينيسين في ال 21 ملفوف لفائف ملزمة على وجه التحديد إلى شريحة زجاجية عن طريق الربط streptavidin-البيوتين. هذا المرفق يضمن أن محرك المجالات أحرار في ربط ودفع ميكروتثبول. من أجل تتبع مسارات أنيبيب، وصفت قليلة ميكروتثبول مع fluorophores العضوية 22،23 - التسميات يجب أن تكون كافية متفرق التي لحل fluorophores واحدة باستخدام جزيء واحد المجهري مضان. يتم تعقب fluorophores واحدة باستخدام إجراءات تحليل الصور مكتوب في IDL. مسارات من كل fluorophore منضم إلى هيئة التصنيع العسكري نظرايتم الجمع بين rotubule في مسار مركب 24 أنيبيب تلقائيا. يتم حساب زوايا الظل θ إلى كل نقطة على طول المسار، ومن هذه الزوايا الظل ويتم احتساب &lt;cosθ سبت&gt; قيمة كل كفاف ق الطول. وأخيرا، وتناسب هذه البيانات إلى المعادلة. (1) بغية انتزاع طول استمرار لأنيبيب معين، أو لميكروتثبول كثيرة في نفس الفحص مزلق. طريقة قوية بما فيه الكفاية للعمل مع ميكروتثبول أعدت في مجموعة متنوعة واسعة من الظروف (مع مختلف وكلاء استقرار أو الجزيئات الصغيرة الأخرى منضمة إلى أنيبيب، مع البروتينات أنيبيب ملزمة المرتبطة (خرائط)، أو مع مجموعة متنوعة من الحلول لزجة). في المختبر، وقد استخدمت هذه التقنية لوصف طول استمرار ميكروتثبول بوصفها وظيفة من طول على طول الأنابيب الدقيقة والأنابيب الدقيقة مع مختلف وكلاء الاستقرار. تقييد الرئيسي هو أن ميكروتثبول يجب أن لا يزال لياليupport كينيسين الحركة. منذ كينيسين هو انزيم محرك قوي، وهذا هو تقييد فضفاضة إلى حد ما. من خلال استبدال الأنابيب الدقيقة مع الأكتين وكينيسين مع انزيم الأسرة الميوسين، يمكن قياس طول استمرار الأكتين باستخدام نفس التقنية.

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;<td<strong&gt; الكواشف</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; إيميدازول</td&gt;<td&gt; سيغما الدريخ</td&gt;<td&gt; I2399</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; كلوريد البوتاسيوم</td&gt;<td&gt; سيغما الدريخ</td&gt;<td&gt; P9541</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; المغنيسيوم الكلوريد</td&gt;<td&gt; سيغما الدريخ</td&gt;<td&gt; M8266</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; EGTA</td&gt;<td&gt; سيغما الدريخ</td&gt;<td&gt; E3889</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; BSA</td&gt;<td&gt; Calbiochem</td&gt;<td&gt; 126615</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; المعقدة البيروكسيديز BSA</td&gt;<td&gt; الحرارية العلمية</td&gt;<td&gt; 29130</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; α-الكازين</td&gt;<td&gt; سيغما الدريخ</td&gt;<td&gt; C6780</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; streptavidin</td&gt;<td&gt; الحرارية العلمية</td&gt;<td&gt; 21125</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; dithiothreitol</td&gt;<td&gt; سيغما الدريخ</td&gt;<td&gt; D0632</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; باكليتاكسيل</td&gt;<td&gt; LC المختبرات</td&gt;<td&gt; P-9600</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; الجلوكوز أوكسيديز</td&gt;<td&gt; سيغما الدريخ</td&gt;<td&gt; G2133</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; الكاتلاز</td&gt;<td&gt; سيغما الدريخ</td&gt;<td&gt; C100</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; الجلوكوز</td&gt;<td&gt; سيغما الدريخ</td&gt;<td&gt; G8270</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; ATP</td&gt;<td&gt; سيغما الدريخ</td&gt;<td&gt; A2383</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 2-المركابتويثانول</td&gt;<td&gt; سيغما الدريخ</td&gt;<td&gt; M3148</td&gt;<td&gt; السامة. شراء كمية صغيرة.</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 24X60 مم رقم 1 1/2 كوب غطاء</td&gt;<td&gt; VWR</td&gt;<td&gt; 48393-252</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 22X22 مم رقم 1 كوب غطاء</td&gt;<td&gt; الذهب خاتم</td&gt;<td&gt; 3306</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; الشحوم عالية الفراغ</td&gt;<td&gt; داو كورنينج-</td&gt;<td&gt; NA</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;<td<strong&gt; معدات</strong&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; TIRF المجهر</td&gt;<tdالعديد&gt;</td&gt;<td&gt; NA</td&gt;<td&gt; وكان المجهر TIRF المستخدمة في هذه الطريقة محلية الصنع.</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; IDL (البرمجيات)</td&gt;<td&gt; Exelis</td&gt;<td&gt; NA</td&gt;<tdهل يمكن&gt; استبدال MATLAB، يماغيج، أو غيرها من البرامج تحليل الصور.</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

قياسات جمود العاطفة من البوليمرات الحيوية باستخدام فحوصات الانزلاق

Flexural Rigidity Measurements of Biopolymers Using Gliding Assays

ميكروتثبول هي البوليمرات هيكل الخلية التي تلعب دورا في انقسام الخلايا، والميكانيكا الخلية، والنقل داخل الخلايا. كل من هذه المهام يتطلب ميكروتثبول التي هي قاسية بما فيه الكفاية وتمتد مباشرة إلى جزء كبير من الإطارات الخلية. ونتيجة لذلك، تم طول استمرار أنيبيب، وهو مقياس لصلابة، ودرس بنشاط على مدى العقدين الماضيين 1. ومع ذلك، تبقى الأسئلة مفتوحة: ميكروتثبول قصيرة هي 10-50 مرات أقل من ميكروتثبول طويلة قاسية 2-4، وميكروتثبول حتى قياس أطوال طويلة والتي تختلف استمرار بأمر من حجم 5-9. هنا، نقدم طريقة لقياس طول أنيبيب المثابرة. وتستند هذه الطريقة على فحص أنيبيب مزلق كينيسين يحركها 10. من خلال الجمع بين العلامات الفلورية متفرق من ميكروتثبول الفردية مع تتبع جسيم واحد من fluorophores الفردية التي تعلق على أنيبيب، وglidinيتم تعقب مسارات غرام من ميكروتثبول نانومتر واحد مع المستوى من الدقة. طول مسارات استمرار هو نفس طول استمرار أنيبيب وفقا للشروط استخدامها 11. يستخدم روتين تتبع الآلي لخلق مسارات أنيبيب من fluorophores تعلق على ميكروتثبول الفردية، ويتم حساب طول استمرار هذا المسار باستخدام إجراءات مكتوبة في IDL. هذه التقنية قابلة للتطبيق بسرعة، وقادرة على قياس طول استمرار ميكروتثبول من 100 في يوم واحد من التجريب. ويمكن تمديد طريقة لقياس طول ظل استمرار مجموعة متنوعة من الظروف، بما في ذلك استمرار طول بوصفها وظيفة من طول الأنابيب الدقيقة جنبا إلى جنب. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تمتد إجراءات التحليل المستخدمة لالميوسين القائم على المقايسات مزلق التمثيل، لقياس طول خيوط الأكتين استمرار كذلك.

ويرد لقطة من الفحص مزلق في الشكل 2. A الكثافة أنيبيب الجيد هو ميكروتثبول 1-10 في مجال الرؤية؛ حد كبير سوف يؤدي إلى مزيد من mistracking كما ميكروتثبول عبر بعضها البعض. ويرد مؤامرة من مسارات أنيبيب 11 من مقايسة مزلق في الشكل 2 في الشكل 3. مسارات نموذجية من 10 إلى 30 ميكرون طويلة، وبعض المسارات لديها ثغرات واحد حيث يعبر أنيبيب آخر. قد يتم تجاهل هذه المسارات من التحليل. <p class="jove_content" style=";text-align:right;direction:rt...

ووصف طريقة لقياس طول جمود العاطفة أو استمرار من البوليمرات الحيوية. أسلوب يستخدم كينيسين يحركها مقايسة مزلق أنيبيب تجريبيا لتحديد طول استمرار ميكروتثبول الفردية وقابلة للتكيف مع المقايسات مزلق الأكتين مقرا لها.

Microtubules are cytoskeletal polymers which  play a role in cell division, cell mechanics, and intracellular transport. Each of these functions requires ...

الهدف العام من هذا الإجراء هو استخدام مقايسة الانزلاق لقياس صلابة UAL للأنابيب الدقيقة. يتم تحقيق ذلك عن طريق ربط بروتين كينيسين الحركي أولا على وجه التحديد بشريحة مجهرية مع مجالات حركية حرة لربط الأنابيب الدقيقة. الخطوة الثانية هي إضافة الأنابيب الدقيقة المصنفة بالفلورسنت إلى العينة ، والتي يتم ترجمتها بواسطة كينيسين.يتم جمع مقاطع الفيديو التالية للأنابيب الدقيقة المنزلقة باستخدام الفحص المجهري الفلوري. الخطوة الأخيرة هي تحليل مقاطع فيديو الفحص المنزلق لحساب صلابة انحناء الأنابيب الدقيقة. في النهاية ، يتم استخدام فحوصات الانزلاق لتحديد صلابة الانحناء للأنابيب الدقيقة المفردة.يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال ميكانيكا الهيكل الخلوي ، مثل صلابة الانحناء لبوليمرات الهيكل الخلوي الفردية. ستظهر هذا الإجراء آنا راتليف ، طالبة من مختبري. لبدء هذا الإجراء ، قم بإعداد المخزن المؤقت لفحص العمل عن طريق إضافة 10 ميكرولترات من 200 مللي مول DIO ثلاثة atol أو DTT إلى مليلتر واحد من محلول مخزن فحص المخزون المخزن المؤقت واخلطه.احتفظ بهذا وجميع حلول العمل الأخرى في درجة حرارة الغرفة أثناء الإجراء. بعد ذلك ، باستخدام المخزن المؤقت لفحص العمل ، قم بإعداد 40 ميكرولترا من المخزن المؤقت BSA للبيوتين عن طريق الجمع بين ألبومين مصل الأبقار المصفى البيوتينيل المعقم بملليغرام لكل ملليلتر مع المخزن المؤقت للمقايسة العاملة بنسبة واحد إلى واحد وخلط المحلول. ثم قم بإعداد المخزن المؤقت BSA عن طريق الجمع بين 645 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفحص مع 5.5 ميكرولتر من 117 ملليغرام لكل مليلتر BSA ، وخلط المحلول.قم أيضا بإعداد المخزن المؤقت tritin عن طريق خلط 57 ميكرولترا من المخزن المؤقت للفحص مع ثلاثة ميكرولترات من البكتيريا العقدية المعقمة المفلترة بمعدل 10 ملليغرام لكل مليلتر في مخزن مؤقت للمقايسة. بعد ذلك ، قم ببناء ممرات التدفق على غطاء انزلاق 24 × 60 ملم ، وبثق خمسة خطوط رفيعة من الشحوم المفرغة من حقنة 10 ملليلتر. باستخدام طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر لتنظيم التدفق ، يجب أن تكون الخطوط متباعدة بأربعة ملليمترات تقريبا.ضع زلة غطاء مقاس 22 × 22 ملم فوق الشحم المفرغ واضغط برفق لأسفل لتشكيل القنوات. بحجم تقريبي يبلغ 10 ميكرولترات ، يجب أن تنتشر خطوط الشحوم المفرغة إلى ما يقرب من ضعف العرض الأصلي. تتمثل الخطوة التالية في تجهيز الممرات مسبقا بألبومين مصل الأبقار البيوتينيل عن طريق سحب 10 ميكرولترات من المخزن المؤقت bioTE BSA في كل حارة تدفق باستخدام القوة الشعرية لسحب الحضانة العازلة لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.ثم اشطف كل حارة ثلاث مرات عن طريق حقن 15 ميكرولترا من المخزن المؤقت BSA في جانب واحد من كل حارة أثناء سحب المحلول من الجانب الآخر باستخدام مسح Kim أو ورق ترشيح. احرص على عدم إدخال فقاعات الهواء في الممرات. التدفق التالي ، 15 ميكرولترا من الستربتافيدين عازلة في كل حارة وتحتضن لمدة تصل إلى ساعتين بحد أدنى 10 دقائق.أثناء الحضانة ، قم بإعداد alpha KC في المخزن المؤقت عن طريق خلط 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت BSA و 50 ميكرولترا من ألفا KC المعقم المصفى بخمسة ملليغرام لكل مليلتر في مخزن الفحص و 0.8 ميكرولتر من 15 ميكرومولار TP عند درجة الحموضة سبعة. قم أيضا بإعداد محلول كينيسين عن طريق سحب المخزن المؤقت alpha KCM في أنبوب جديد وإضافة كينيسين البيوتين إلى 10 نانو مولار ثم خلطه بعد الحضانة مع المخزن المؤقت للستربتافيدين. اشطف كل حارة ثلاث مرات باستخدام 15 ميكرولترا من المخزن المؤقت BSA.ثم اشطف كل حارة ب 15 ميكرولترا من المخزن المؤقت alpha kcn من أجل تقليل الارتباط غير المحدد للكينيسين والأنابيب الدقيقة بالزجاج. بعد ذلك ، أضف 15 ميكرولترا من محلول كينيسين إلى كل حارة واحتضن لمدة 15 دقيقة إلى ساعة. خلال هذا الوقت ، سيشكل كينيسين البيوتين رابطة قوية مع الستربتافيدين المرتبط بالسطح ويسمح بالوصول إلى مجالات حركية كينيسين للأنابيب الدقيقة المربوطة.في غضون ذلك ، قم بإعداد محلول من 40 ميكرومولار باكليتاكسيل وألفا KC والعازلة. يعتبر باكليتاكسيل مهما لمنع الأنابيب الدقيقة من تفكك. في غطاء الدخان ، قم بإعداد المخزن المؤقت المضاد للتبييض الفلوري عن طريق خلط 95 ميكرولتر من المخزن المؤقت alpha KCM ، و 2.5 ميكرولتر من مخزون الجلوكوز ، وميكرولتر واحد من 100 × كسح الأكسجين.امزج ميكرولتر واحد من باكليتاكسيل و DMSO بأربعة مللي مولار. وأخيرا ، ميكرولتر واحد من بيتا مي كابتو إيثانول. بعد الحضانة ، اشطف أي كينيسين بيوتين مجاني عن طريق غسل كل حارة ب 15 ميكرولترا من درجة حرارة الغرفة.قد يؤدي باكليتاكسيل في محلول ألفا كيان باستخدام المخزن المؤقت البارد إلى إزالة بلمرة الأنابيب الدقيقة. أخيرا ، قم بتوصيل المخزن المؤقت المضاد للتبييض الفلوري إلى أنبوب جديد وأضف الأنابيب الدقيقة المصنفة بالفلورسنت إلى تخفيف من واحد إلى 100 إلى واحد إلى 1000. ثم أضف مللي مولار TP واخلط.حقن 15 ميكرولترا من محلول النبيبات الدقيقة في حارة واحدة ولاحظ استخدام الفحص المجهري الفلوري في غضون 30 دقيقة. تتمثل الجوانب الأكثر أهمية في هذا الإجراء في الحصول على تركيز مثالي للأنابيب الدقيقة لضمان عدم تداخلها والحصول على خلفية منخفضة. تستخدم الممرات المتبقية لتحسين تركيز الأنابيب الدقيقة ، ونستخدم المجهر نفسه لمحاذاة وتركيزها.يتم تصوير الأنابيب الدقيقة الانزلاقية باستخدام مجهر مضان انعكاس داخلي كلي محلي الصنع. يعرض هدف الفتحة العددية العالية 100 × مجالا يبلغ حوالي 50 ميكرون × 50 ميكرون ، وهو مساحة كافية لعرض الحركة لمدة 100 ثانية تقريبا بمعدل 0.5 ميكرون في الثانية. يستخدم الليزر للإثارة لإعداد طاقة من ثلاثة إلى خمسة مللي واط.هذه الطاقة منخفضة بما يكفي لمنع التبييض الضوئي لأرضية الأربعة بسرعة أكبر من 100 ثانية للسماح بوقت تصوير مناسب. باستخدام برنامج التقاط الصور ، اجمع تسلسلات الصور بمعدل خمسة إطارات في الثانية لمدة دقيقتين. يجب أن تكون التسلسلات طويلة بما يكفي حتى تجتاز الأنابيب الدقيقة مجال الرؤية بأكمله.قم بتحليل بيانات الصورة باستخدام روتين IDL مثل الملف ، واحصل على LP Pro ، والذي يمكن الحصول عليه من المواد التكميلية. يقوم روتين DL هذا بإرجاع قيمة طول الثبات التي تستند إلى جميع الأنابيب الدقيقة التي تنزلق في تسلسل صورة معين. قم بتعديل معلمات الشدة اعتمادا على شدة الفلورو الأربعة وإعداد المجهر.يظهر هنا اختبار انزلاقي مأخوذ باستخدام الفحص المجهري الفلوري الانعكاس الداخلي الكلي. يمكن رؤية أرباعات الفلور مزينة بشكل ضئيل على طول الأنابيب الدقيقة. تم دمج مسارات الفلورو الأربعة المفردة الموضحة للتو ، حيث تجمع بين متوسط 10 فور أرباعي في نقطة واحدة لكل 100 نانومتر لتحسين تحليل البيانات.عند النظر إلى أنبوب دقيق واحد ، يمكن حساب زاوية الظل بين كل نقطة بسهولة وتعيينها كدالة للطول. باستخدام زوايا الظل ، يمكن حساب طول الثبات ويمكن رسم متوسط التوقيع المشترك لكل طول مقطع باستخدام المعادلة الموضحة هنا. يمكن تحديد أفضل خط مناسب بمجرد إتقانه.يمكن استخدام هذه التقنية لقياس صلابة الانحناء لعشرات الأنابيب الدقيقة في ثلاث أو أربع ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

flexural-rigidity-measurements-of-biopolymers-using-gliding-assays

Research

JoVE Journal

Bioengineering

الهندسة الحيوية

في هذا الفيديو ، ونحن لشرح التقنيات المستخدمة لصنع التجريبية ، متوافقة مع المصفوفة خارج الخلية (ECM) ركائز مغلفة مناسبة لزراعة الخلايا ، والتي هي قابلة للالمجهري قوة الجر ومراقبة الآثار المترتبة على تصلب ECM على سلوك الخلية.

إعداد مصفوفات شكوى لقياس تقلص الخليوي

تعد متانة البوليمرات ومركبات البوليمر المقواة بالألياف في الخدمة جانبا مهما لتصميماتها وصيانتها القائمة على الحالة. نقدم منصة اختبار معملية جديدة منخفضة التكلفة للتحقيق في تأثير الأحمال الميكانيكية والبيئية المتزامنة ، وقد نساعد في تصميم هياكل مركبة أكثر كفاءة وأكثر أمانا.

ومنصة اختبار للدراسات متانة من البوليمرات و البوليمرات المقوى بالألياف المركبات تحت المحفزات وبالتزامن Hygrothermo الميكانيكية

هنا ، يتم وصف طريقة تتيح التحضير السريع والفعال وغير المكلف للمواد الهلامية بولي أكريلاميد في شكل لوحة متعددة الآبار. لا تتطلب الطريقة أي معدات متخصصة ويمكن اعتمادها بسهولة من قبل أي مختبر بحث. سيكون مفيدا بشكل خاص في الأبحاث التي تركز على فهم استجابات الخلايا المعتمدة على الصلابة.

بسيط Multiwell تصلب الفحص لدراسة الردود خلية تصلب التي تعتمد على أساس بولي أكريلاميد

ويرد منهجية جديدة لتجميع واللدائن البرنامج الرئيسية سلسلة السائل البلوري باستخدام أحادية بدءا المتاحة تجاريا. وهناك مجموعة واسعة من الخصائص الميكانيكية الحرارية ومصممة عن طريق ضبط كمية من crosslinker، في حين كان أداء يشتغل تعتمد على كمية من سلالة التطبيقية خلال البرمجة.

توليف للبرمجة الرئيسية سلسلة اللدائن السائل البلوري باستخدام مرحلتين ثيول-اكريليت رد الفعل

سيميفليكسيبلي البوليمرات عرض الخصائص الميكانيكية الفريدة التي يتم تطبيقها على نطاق واسع بنظم المعيشة. ومع ذلك، تقتصر دراسات منهجية في البوليمرات البيولوجية نظراً لخصائص مثل صلابة البوليمر غير قابل للوصول. هذه المخطوطة يصف كيف يتم التحايل على هذا القيد بالأنابيب النانوية الحمض النووي للبرمجة، تمكين دراسات تجريبية عن أثر صلابة خيوط.

النانومترية الحمض النووي كأداة مرنة لدراسة البوليمرات سيميفليكسيبلي

نحن نقدم على بروتوكول لإجراء الاختبارات الانحناء ثلاث نقاط على ألياف مقياس الملليمتر الفرعية باستخدام جهاز اختبار المواصفات ميكانيكية. يمكن قياس القوات تتراوح من 20 µN ما يصل إلى 10 ن الجهاز ويمكن أن تستوعب ذلك مجموعة متنوعة من أحجام الألياف.

نظام ملليمتر اختبار العاطفة مقياس لقياس الخواص الميكانيكية للاسفنج البحري سبيكوليس

ركائز مع تصلب في نطاق كيلوباسكال مفيدة لدراسة استجابة الخلايا لفسيولوجيا ذات الصلة الصغرى والبيئة صلابة. استخدام مجهر الأسفار ويديفيلد فقط، يمكن تحديد معامل للشباب من الهلام لينة سيليكون استخدام المسافة بادئة مع مجال مناسبة.

قياس صلابة من ركائز السيليكون لينة للدراسات ميتشانوبيولوجي باستخدام مجهر الأسفار ويديفيلد

يتم استخدام تقنية رهيوميتري المشبك قوة جديدة للتحقيق في الخواص الميكانيكية لعينات صغيرة الحجم على أساس البروتين المائية المربوطة بين لفائف صوت محرك، وجهاز استشعار قوة. نظام (PID) نسبي-متكاملة-مشتقات تناظرية يسمح 'لقط' قوة ذوي الخبرة إلى البروتوكول المطلوب.

المشبك قوة رهيوميتري لوصف الهلاميات المائية المستندة إلى البروتين

هنا ، نقدم بروتوكولًا لاقتران مونومر البروتين بواسطة الإنزيمات التي تشكل بروتين البوليمر مع تسلسل يتم التحكم فيه وشل حركته على السطح لإجراء دراسات مطياف قوة أحادية الجزيء.

OaAEP1 بوساطة التوليف الأنزيمي وتجميد البروتين المبلمر للمطاطي للقوة أحادية الجزيء

يوصف تطوير المقايسات على منصة مخصصة لVIBE أكثر حساسية والنتائج واستنساخه في مصفوفات الآلي المعقدة. خرطوشة عالمي يسمح المقايسات تكييفها بسهولة للاستخدام مع فحوصات مخصصة. هذا التنوع يتيح التطور السريع والتحقق من صحة الرواية أو الإصدارات المقايسات الآلي دليل المقايسات القائمة ، والمتمثلة في هذا الفيديو.

مخصص الصينية النامية الهامستر بروتين الخلية المبيض في استضافة فحوصات باستخدام التكنولوجيا الصوتية Microparticle الغشائية

تعلم قياس جمود العاطفة للأنابيب الدقيقة باستخدام فحص الانزلاق المحرك بالكينيسين. تُحدد هذه الطريقة طول الثبات لكل أنبوب دقيق على حدة وتُسهم في فهم ميكانيكا الهيكل الخلوي.

قياسات جمود العاطفة من البوليمرات الحيوية باستخدام فحوصات الانزلاق

استكشف المزيد من الفيديوهات