إنتاج ثاني كبريتيد استقرت مجمعات الببتيد عبر الغشاء الدراسات الإنشائية

ينتج هذا البروتوكول مجمعات مستقرة تساهميا من الببتيدات عبر الغشاء للدراسات الهيكلية التي تهدف إلى فهم كيفية تفاعل بروتينات الغشاء مع بعضها البعض من خلال مجالاتها المضمنة في الدهون. أولا ، عبر عن بروتين اندماج موسوم ب hist يحتوي على تسلسل الغشاء ذي الأهمية في الإشريكية القولونية. ثم استخرج البروتين من جزء الجسم المدرج باستخدام غينيا والمنظفات باستخدام مصفوفة تقارب النيكل.

قم بتركيز بروتين الاندماج الموسوم ب hist وربطه بالشكل القطري عن طريق غسل العمود في محلول يحتوي على عوامل مؤكسدة. بعد ذلك ، قم بتصفية بروتين الاندماج المتشابك في حمض الخليك Tri Fluor ومعالجته ببروميد السيانوجين لإطلاق شريك الاندماج ، وانتقل إلى عزل منتج الببتيد المتشابك من خليط الهضم عن طريق HPLC في المرحلة العكسية. في النهاية ، يتم التحقق من هوية المنتجات ونقائها من خلال صفحة SDS وتحليلات قياس الطيف الكتلي.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن المجمعات الاجتماعية النقية يتم إنتاجها للدراسات الهيكلية باستخدام تقنيات مثل المحلول أو الحالة الصلبة بالرنين المغناطيسي النووي. حتى عندما يكون من المعروف أن مجالين عبر الغشاء يتفاعلان ، فإن قابلية ذوبان الببتيد والتكوين المعقد غالبا ما يكونان على خلاف في ظل الظروف التجريبية. يمكن أن يؤدي البدء بمركب مستقر تساهميا محدد جيدا إلى توسيع نطاق الظروف التجريبية التي يمكن اختبارها لجمع البيانات عالية الجودة.

بشكل عام ، سيعاني الأفراد الجدد في هذه الطريقة من صعوبة التعامل مع شظايا البروتين شديدة المساء. تم تصميم هذا البروتوكول والنصائح المقدمة في المخطوطة المصاحبة لتوفير بعض الحلول البسيطة لبعض التحديات الأكثر شيوعا في عملية التنبؤ والتنقية. الحنك ، مزرعة لتر واحد من البكتيريا تعبر عن اندماج الببتيد الكرشة وتعلق في 50 مل من محلول التحلل.

ثم قم بإجراء ثلاث دورات من الصوتنة بأقصى إخراج لمدة دقيقة واحدة وتبرد على الجليد لمدة خمس دقائق. حصاد مادة الجسم غير القابلة للذوبان عن طريق الطرد المركزي عند 20،000 جم لمدة 15 دقيقة صب ووضع المادة الطافية جانبا. قد تتكرر خطوات الصوتنة والطرد المركزي إذا كانت هناك حاجة إلى نقاء محسن لجزء البكالوريا الدولية.

احتفظ بعينات من الحبيبات والمواد الطافية لتحليل صفحة SDS لتأكيد الرحلة. يؤدي توطين اندماج TM إلى أجسام التضمين الآن إلى إذابة كريات الجسم المدرجة في محلول غينيا باستخدام ما بين 25 و 50 مل لكل لتر من الثقافة. مزيج معالج بلطف في درجة حرارة الغرفة لعدة ساعات مع شمس من حين لآخر.

بعد ذلك ، قم بمسح تحلل جسم التضمين عن طريق الطرد المركزي عند 75 ، 000 إلى 100 ، 000 مرة G لمدة ساعة واحدة. في درجة حرارة الغرفة ، قم بتصفية supernat من خلال غشاء 0.2 ميكرون في أنبوب مخروطي سعة 50 مل. اجمع بين محللة جسم التضمين التي تم تطهيرها مع راتنج تقارب النيكل الذي تم موازنته بمحلول غينيا لربط الدفعات.

امزج التعليق برفق طوال الليل في درجة حرارة الغرفة. قم بتحميل نظام التضمين لتحليل راتنج النيكل في عمود تدفق الجاذبية الفارغ مع دعم السرير المسامي حتى يتدفق الحجم بالكامل. اجمع التدفق الذي قد لا يزال يحتوي من خلاله على بروتين اندماج غير مرتبط وضعه جانبا

ثم اغسل راتنج النيكل بالجاذبية. تدفق مع خمسة أحجام من محلول اليوريا يحتوي على خمسة مللي مولار شعاع ميركابتو إيثانول. قم بإجراء غسل ثان بدون شعاع ميركابتو إيثانول للغسل الثالث.

استخدم محلول اليوريا المكمل بكبريتات النحاس والجلوتاثيون المؤكسد. ثم أغلق مخرج العمود واحتضن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة للسماح بتكوين أقصى قدر من رابطة ثنائي الكبريتيد. اغسل محلول اليوريا المؤكسد ب 10 كميات من الماء.

ثم ضع خطا مفرغا لتجفيف طبقة العمود وإغلاق مخرج العمود. الآن في غطاء أمان كيميائي ، أضف 1.5 حجم سرير من TFA الأنيق ، وحرك راتنج النيكل بملعقة صغيرة لضمان التعرض المتساوي للحمض واحتضانه لمدة خمس دقائق. اجمع حمض التصريف بالضغط برفق باستخدام شركة طيران مضغوطة إذا لزم الأمر لإخراج كل السائل.

كرر خطوة التخفيف الحمضي مع أحجام أخرى بحجم 1.5 سرير من TFA الأنيق لقياس إنتاجية البروتين ، قم بتخفيف TFA EIT في الإيثانول ثلاثي الفلورو وقم بقياس الامتصاص عند 280 نانومتر مقابل A-T-F-A-T-E. خفف الحمض إلى 80٪ تركيز TFA النهائي بالتنقيط. إضافة الماء مع الخلط برفق.

إذا قمت بترسيب الأشكال ، أضف كمية صغيرة من TFA مرة أخرى حتى يتضح المحلول. ثم أعد التصحيح إلى 80٪ بالماء. احتفظ بعينة من الهضم المسبق سعة خمسة ميكرولترات لتحليل صفحة SDS وقم بتجميدها على الفور في النيتروجين السائل.

بعد ذلك ، قم بوزن بلورات بروميد السيانوجين لحوالي 0.2 جرام لكل مليلتر من العينة. الحرص على وزن المادة الكيميائية السامة بأمان. أضيفي بروميد السيانوجين إلى العينة في غطاء أمان واخلطيهم برفق حتى يذوب تماما.

الآن اغسل وعاء التفاعل داخل ختم غاز خامل واحتضانه لمدة ثلاث إلى أربع ساعات في درجة حرارة الغرفة محمية من الضوء. احتفظ بعينة من خمس ميكرولتر بعد الهضم لتحليل صفحة SDS ، وقم بتجميدها على الفور في النيتروجين السائل وتجميدها مع عينة الهضم المسبق. ثم انقل تفاعل الهضم إلى كاسيت غسيل الكلى السليلوز المتجدد ، مما يسمح بزيادة كبيرة في الحجم.

الكبري للعينة طوال الليل مقابل أربعة لترات من الماء في غطاء المحرك الكيميائي. في صباح اليوم التالي ، قم بإزالة محلول التفاعل الممحلول ببروتين معلق من كاسيت غسيل الكلى وانقل المعلق إلى أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلترا. ثم قم بتجميد العينة وتجميدها لعدة أيام لإزالة الماء وأي آثار للسيانوجين والبروميد و TFA لإذابة ما يصل إلى 100 ملليغرام من منتجات الهضم المجففة بالتجميد إلى ثلاثة ملليلتر من خلط حمض الفورميك الأنيق حتى يزول المحلول تماما.

قم بتحميل العينة على عمود zoax SB 300 C3 على مقياس تحضيري في تدفق المذيب A باستخدام حلقة عينة سعة خمسة ملليلتر. ثم قم بتصفية منتجات الهضم في تدرج من المذيب B ، على خمسة أحجام أعمدة على الأقل. قم بتحليل كسور HPLC بواسطة صفحة SDS وقياس الطيف الكتلي MALDI TOF لتحديد الأنواع ذات الأهمية وتأكيد التجميد الكتلي المتوقع.

كسور HPLC التي تحتوي على منتج الببتيد المتشابك. إذا جف المنتج إلى فيلم بدلا من مسحوق ، فيمكن إعادة إذابته في كمية صغيرة من HFIP المجمدة في سائل ومجفف. مرة أخرى ، ستكون النتيجة مخروطا أبيض رقيقا يمكن إمالته ووزنه بسهولة تسلسل الحمض النووي الذي يشفر الغشاء ومناطق وضع العلامات لجزيء إشارات الغشاء لمستقبلات المناعة.

تم استنساخ DAP 12 في ناقل الببتيد PMM باستخدام مواقع تقييد الهندية الثلاثة و BAM H واحد. ينتج عن بناء التعبير البكتيري الناتج بروتين اندماج رحلته الموسوم مع بقايا الميثيونين والسيستين الداخلية الفريدة لانقسام بروميد السيانوجين والربط المتقاطع المؤكسد. يختلف مستوى التعبير الذي تم تحقيقه لاندماج الكرشة اعتمادا على تسلسل الأحماض الأمينية للببتيد المرفق.

أسفر هذا المستحضر عن ما يقرب من 120 ملليغرام من بروتين الانصهار النقي السليم من لتر واحد من الثقافة وأربعة ملليلتر من مصفوفة النيكل. بعد تحلل الخلية ، تم توطين بروتين الاندماج في حبيبات الجسم المدرجة. ما يقرب من 70٪ من كرشة النيكل المنقاة DAP 12 TM كان متشابكة مع ثاني كبريتيد متشابك مع شكل DME.

على الرغم من أن منتجات الببتيد DAP 12 TM لا يمكن التعرف عليها بسهولة في إجمالي عينات هضم بروميد السيانوجين ، إلا أن مقارنة نطاقات الاندماج السليمة وشظايا الرحلة في عينة الهضم المخفضة تشير إلى أن هضم الاندماج كان مكتملا بنسبة 60٪ تقريبا في هذا الفصل النموذجي لمنتجات الهضم. على عمود C3 على مقياس تحضيري باستخدام HPLC في الطور العكسي ، تم التلميح إلى المنتجات المرتبطة في تدرج على مرحلتين من المذيب B. يمكن تحديد منتج الببتيد المتشابك لكبريتيد diss في تحليل صفحة SDS لكسور HPLC الرئيسية في ظل ظروف غير مختزلة ومختزلة. يؤكد تحليل قياس الطيف الكتلي في Maldi tof هوية الببتيد deme في الذروة الرابعة مع المنتج الرئيسي عند 6729.2 دالتون.

لا تنس أن العمل مع بروميد السيانوجين والمذيبات العضوية والأحماض المركزة يمكن أن يكون خطيرا للغاية. يجب أن تكون معدات الحماية المناسبة مناسبة أثناء تنفيذ هذه الإجراءات ويجب عدم التعامل مع بروميد السيانوجين خارج غطاء الأمان الكيميائي المعتمد. قدمت هذه التقنية مادة الدراسة الرئيسية لثلاثة هياكل مختلفة من المحلول n MR لمجمعات الببتيد عبر الغشاء ، مما يوضح كيفية تجمع المستقبلات المناعية متعددة الوحدات الفرعية من خلال تفاعلات البروتين داخل غشاء الخلايا الليمفاوية.

نعتقد أن تطبيق هذه التقنية سيثبت أنه ذو قيمة متساوية لأنظمة البروتين الغشائي الأخرى.