يعيش التصوير من تخليص الخلية أفكارك أثناء ذبابة الفاكهة مرحلة التطور الجنيني

الهدف العام من هذا الإجراء هو متابعة ديناميكيات إزالة الخلايا المبرمجة في جنين ذبابة الفاكهة. يتم تحقيق ذلك باستخدام الذباب المعدل وراثيا الذي يحتوي على علامة GFP السيتوبلازمية ، والتي تصنف أجنة الخلايا البلعمية التي تحمل علامة Simio GFP يتم جمعها وغسلها وتغطيتها. بعد ذلك ، يتم وضع الأجنة للحقن متبوعا بمراقبة الجهاز العصبي المركزي.

الخطوة الثالثة هي وضع العلامات على الخلايا المبرمجة عن طريق حقن الأجنة بعلامات بلعمة موت الخلايا المبرمج المحددة ، مثل X في خمسة ، والخطوة الأخيرة هي إجراء تسجيلات بفاصل زمني للجهاز العصبي المركزي الجنيني باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر. في النهاية ، يمكن أن تظهر النتائج توطين وسلوك الخلايا المبرمجة والخلايا البلعمية خلال مراحل مختلفة من إزالة الخلايا المبرمجة من خلال الفحص المجهري متحد البؤر الفلوري. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل الكيمياء النسيجية المناعية على الأجنة الثابتة هي أنه يمكننا اتباع ديناميكيات إزالة الخلايا المبرمجة.

إزالة الخلايا المبرمجة هي عملية ديناميكية للغاية تحتوي على خطوات متنوعة. تسمح لنا هذه التقنية باتباع الخطوات المختلفة باستخدام علامات محددة للخلايا موت الخلايا المبرمج والخلايا البلعمة. يبدأ البروتوكول بصنع غراء من الكواشف التقليدية ، قم بفك الشريط على الوجهين ، ثم قم بلفه مرة أخرى ليناسب قارورة التلألؤ.

املأ القارورة بالهيبتان وأغلقها بالبارام. ثم قم بإرفاق القارورة بقطعة الجوز وهزها برفق لمدة 24 ساعة. في درجة حرارة الغرفة ، في اليوم التالي يتم نقل الغراء المحضر إلى قارورة جديدة.

استخدم PE زجاجيا لنقل الغراء المحضر إلى ملف جديد. بمجرد التحضير ، استخدم طرف الماصة لتطبيق الغراء لتغطية الزلات. قم بتفريق قطرة من غراء السباعي في خط أسفل منتصف زلة الغطاء.

دع الغراء يحاول لبضع ثوان. يمكن بعد ذلك تخزين زلات الغطاء في درجة حرارة الغرفة في صندوق مغلق لمدة تصل إلى شهر بعد تخدير الذباب بثاني أكسيد الكربون تجمع حوالي 400 ذبابة في حاوية تجميع مع صفيحة وضع عصير العنب الدافئة التي يتم استبدالها في 25 درجة مئوية لمدة ساعتين. اجمع طبق وضع عصير العنب وقم بتغطية الحاوية بطبق جديد لإبقاء الذباب سعيدا.

اللوحة المجمعة على أجنة عمرها من صفر إلى ساعتين. أعد صفيحة وضع عصير العنب التي تم جمعها مع الأجنة إلى حاضنة 25 درجة مئوية حتى تصل إلى النقطة الزمنية المطلوبة للنمو. في هذا المثال، يتم تحضين الأجنة بين 10 و12 ساعة، بحيث تتطور إلى المرحلة 15 أو 16 بعد نموها.

استخدم ماء الصنبور وفرشاة الرسم النظيفة لنقل الأجنة من الصفيحة إلى الخلية. مصفاه. احتفظ بالمصفاة فوق وعاء حتى يمكن استعادة أي أجنة تتسرب اشطف الأجنة المجمعة حتى تتم إزالة معجون الخميرة بالكامل.

ثم جفف الماء الزائد عن طريق مسح المصفاة من الخارج. ضع مصفاة الخلية في طبق بتري نظيف لإزالة الكوريون بدرجة كافية. 50٪ مبيض لتغطية الأجنة في مصفاة الخلية وانتظر دقيقتين مع تحريكها مرتين إلى ثلاث مرات.

بعد ذلك ، اشطف الأجنة حتى تختفي رائحتها مثل المبيض. ضع الأجنة في حاوية الخلية في طبق بتري نظيف وقم بتغطيتها بالماء لمنعها من الجفاف. لحقن الأجنة.

قم بإعداد إبر الحقن مسبقا باستخدام مجتذب إبرة وخيوط زجاجية رقيقة الجدران. قم بتحميل ميكرولتر واحد من الكاشف المطلوب في إبرتين بإبرة واحدة تعمل كنسخة احتياطية. علامة ثابتة لا تبيض بسهولة ، مثل X في خمسة ، تصنع كاشفا جيدا.

الآن ضع قطعة مستطيلة من أجار عصير العنب على المجهر. حرك الأجنة وانقلها من المصفاة إلى الأجار. باستخدام فرشاة طلاء نظيفة تحت مجهر تشريح الفلورسنت ، حدد أجنة تم تنظيمها بشكل صحيح للحقن باستخدام علامة GFP.

باستخدام فرشاة رسم مبللة ، انقل الأجنة المحددة إلى صف من 10 مع جوانبها البطنية لأعلى. ضع الصف على حافة الكتلة الزراعية. يمكن رؤية GFP في الجهاز العصبي المركزي للجنين.

الآن نعلق الأجنة على زلة غطاء مع شريط من الغراء سباعي. الموضع الصحيح للأجنة مهم جدا لنجاح الحقن. خذ وقتك وتأكد من اصطفاف الأجنة بدقة في الاتجاه الصحيح.

بعد ذلك ، ضع زلة الغطاء في غرفة الجفاف لمدة خمس دقائق تقريبا. بعد تجفيف الأجنة ، قم بتغطيتها بزيت الكربون Hello 700 لتجنب المزيد من الجفاف. أخيرا ، ضع قطرة ماء على شريحة مجهرية.

ثم ضع شفة الغطاء مع الأجنة لأعلى على شريحة المجهر الرطب. الأجنة جاهزة الآن للحقن. ابدأ بتوصيل إبرة بمناور ميكروم ومضخة بيكو.

تتحكم المضخة في كمية السائل المحقون عن طريق دفع النيتروجين إلى الإبرة. تتحكم دواسة القدم في طرد النيتروجين المسور تحت المجهر. ركز على طرف الإبرة وضعه بالقرب من حافة زلة الغطاء مع طرف الإبرة وانزلاق الغطاء في التركيز بعناية فائقة.

حرك زلة الغطاء حتى تصطدم بطرف الإبرة وتكسرها. يجب أن يكون قطر الفتح من نصف إلى ميكرومترين. ركز الآن على الأجنة.

أحضر الإبرة إلى الزيت. إذا تم كسر طرف الإبرة بشكل صحيح ، فيجب أن يكون هناك قطرة من السائل تتسرب إلى الزيت. عندما تضغط على الدواسة دون لمس حامل الإبرة ، حرك المرحلة بحيث يتم ثقب الحافة الجانبية للجنين بواسطة الإبرة.

حقن قطرة من المحلول بسرعة في الجنين. انقل الجنين بعيدا وانتقل إلى الجنين التالي حتى يتم حقن الأجنة العشرة جميعها. صور الأجنة على مجهر متحد البؤر مقلوب بهدف 40 × أو 100 ×.

ابحث عن جنين في وضع جيد مع الجهاز العصبي المركزي في المنتصف ، مما يظهر تعبيرا قويا عن GFP ووضع علامات على الخلايا المبرمجة. لعمل تسجيلات بفاصل زمني ، اختر خمس أو ست شرائح متحدة البؤر لتلتصق الميكرون في هذه المواقع. قم بإجراء فحص كل 60 ثانية ، وهو فاصل لا ينبغي أن يكون فيه تبييض GFP مشكلة.

بعد ذلك ، قم بعمل إسقاط من ثلاث شرائح بسمك ستة ميكرون لمراقبة الخلايا بأكملها. في بعض الحالات ، قد يبدأ الجنين في التدحرج أثناء وقت تسجيل الفيديو. لذلك ، راقب التسجيل حتى لا يضيع الوقت في تحريك الأجنة.

يظهر جنين المرحلة 15 الموضوع بشكل صحيح الجهاز العصبي المركزي الجنيني في المنتصف مع الخلايا الدبقية المسمى جيدا المميزة ب g البلاعم M ، والتي تقع في الغالب خارج عرض الجهاز العصبي المركزي. تعبير GFP السيتوبلازمي القوي. يتم تصنيف خلايا الأديم الظاهر E أيضا ب GFP السيتوبلازمي.

تظهر هذه الإطارات خلايا موت الخلايا المبرمج المسمى ب ex في خمسة والأديم الظاهر clea والضامة المسماة ب cite GFP. كل إطار عبارة عن إسقاط من ثلاث شرائح وكل شريحة بسمك ميكرونين. يوجد العديد من السابقين في خمس خلايا إيجابية داخل وخارج الجهاز العصبي المركزي.

يظهر الحدث المعبأ خلية دبقية تبتلع جسيما موت الخلايا المبرمج. لاحظ سلوك الفحص للخلية الدبقية. يلامس الجسيم موت الخلايا المبرمج عدة مرات قبل الالتزام بابتلاع الخلية موت الخلايا المبرمج بعد تطورها.

مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال إزالة الخلايا المبرمجة لاستكشاف البلعمة للخلايا المبرمجة أثناء التطور. باستخدام هذه التقنية ، يمكننا استكشاف السلوك الديناميكي للغاية لإزالة الخلايا المبرمجة.