Name: يعيش التصوير من تخليص الخلية أفكارك أثناء ذبابة الفاكهة مرحلة التطور الجنيني (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: تعلم تقنية التصوير الحي لدراسة ديناميكيات تخلص الخلايا المبرمجة في أجنة ذبابة الفاكهة باستخدام المجهر المكافئ. تتيح هذه الطريقة مراقبة سلوك البلعميات والخلايا الميتة في الوقت الفعلي.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

وأيد هذا العمل من قبل كوري إعادة الإدماج منحة ماري (IRG249084). ونحن نشكر جميع أعضاء المختبر Kurant.

لمتابعة ديناميات إزالة الخلايا الميتة في الجسم الحي يجب أن يكون المسمى اثنين من السكان من الخلايا: الخلايا البلعمية والخلايا أفكارك. بمناسبة السكان الخلية البلعمية نستخدم خط ذبابة الفاكهة التي تحتوي على علامة تليفون-cytGFP، التي تصف الخلايا البلعمية حصرا في الجنين: الضامة، والخلايا الدبقية الأديم الظاهر 8. يمكن للمرء استخدام علامات مختلفة للخلايا البلعمية، بما في ذلك خطوط تحتوي على السائق GAL4 كرية دموية محددة (CRQ-GAL4) أو الدبقية محددة GAL4 السائق (الريبو-GAL4) ومراسل الفلورسنت المشفرة جينيا تحت السيطرة UAS (UAS GFP-). لرصد الخلايا أفكارك خلال إزالة الخلايا الميتة التي نستخدمها موت الخلايا المبرمج مختلفة / علامات البلعمة. Annexin V (المسابر الجزيئية) بمثابة مؤشر مبكر لخلايا أفكارك 10؛ Phiphilux (OncoImmunin) هي الفلورة كاسباس 3 الركيزة، التي يستخدم كأساس apopto في وقت لاحقجهاز الأمن والمخابرات علامة، وLysoTracker (المسابر الجزيئية) يعمل كعلامة يبلوع. نحن حقن هذه الكواشف باستخدام نظام حقن مكروي PicoPump PV 820. 1. يستعد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الغراء هيبتان: انبسط الشريط مزدوجة من جانب ووضع بقدر ما يمكنك في قارورة التلألؤ، وملء مع هيبتان، ختم قارورة مع parafilm، والصخور لمدة 24 ساعة. إضافة هيبتان إذا الغراء سميكا جدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نسمح الذباب لتضع على عصير العنب قبل تحسنت وحة آغار + الخميرة لصق لمدة 2 ساعة، ثم نقل لوحة إلى 25 درجة مئوية لمدة 10-12 ساعة (يعتمد على المرحلة المطلوبة) قبل حقن مكروي والوقت الفاصل بين التسجيلات من الأجنة حقن. نحن جمع أجنة من لوحات أجار الحفاظ على 25 درجة مئوية، وبالتالي توفير الأجنة من مرحلة 15 أو 16 من التنمية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد إبرة: لإعداد إبر للحقن، ونحن نستخدم &quot;أداة سوتر &#39;ساحبة إبر وخيوط زجاجية رقيقة الجدران (أنابيب شعرية FHC). واندلعت غيض من تجميع الشعريةN ليبلغ قطرها 0.5-2 ميكرون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ساترة مع الغراء: تلميح باستخدام ماصة تفريق قطرة من الغراء هيبتان في سطر واحد في منتصف ساترة. اتركها لتجف لبضع ثوان. إعداد عدد قليل من هذه coverslips على. </li></ol> 2. تحضير الجنين <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الأجنة من لوحات أجار ونقلها إلى مصفاة الخلية (علوم الحياة SPL) باستخدام فرشاة الطلاء نظيفة ومياه جارية. ويقام على مصفاة كوب لجمع مياه الصرف الصحي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الأجنة في مصفاة الخلية باستخدام المياه حتى يتم إزالة كافة عجينة الخميرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجف الماء الزائد عن طريق مسح السطح الخارجي للمصفاة باستخدام Kimwipes. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع مصفاة الخلية في طبق بتري نظيفة وإضافة ما يكفي من مواد التبييض 50٪ لتغطية الأجنة في مصفاة الخلية. Dechorionate الأجنة لمدة 2 دقيقة في بعض الأحيان (2-3 مرات) التحريك لهم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف مع المياه على نطاق واسع حتى الأجنة فضفاض رائحة التبييض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع مصفاة الخلية في نظيفةطبق بتري وتغطية الأجنة مع الماء لمنع الجفاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل البدء في إعداد الأجنة، تحميل 1 ميكرولتر من كاشف المطلوب في اثنين من الإبر (أحيانا إبرة يمكن انسداد). يستغرق حوالي 5 دقائق للسائل للوصول إلى رأس الإبرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع قطعة مستطيلة من العنب آغار عصير ووضعها على شريحة المجهر. نقل الأجنة dechorionated من طبق بيتري إلى قطعة أجار باستخدام فرشاة الطلاء نظيفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت المجهر تشريح فلوري حدد بشكل صحيح نظموا الأجنة معربا عن علامة GFP باستخدام فرشاة الطلاء الرطب وتضع كل جنين على مقربة من حافة قطعة أجار في صف واحد تلو الآخر (الشكل 1A). ينبغي أن توضع الأجنة مع جانبهم بطني حتى لالبلعمة التصوير بواسطة الخلايا الدبقية في الجهاز العصبي المركزي (CNS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد حوالي 10 الأجنة في صف واحد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نعلق الأجنة إلى ساترة المغلفة في الوسط مع شريط من الغراء هيبتان (الشكل 1B، C </strong&gt;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع ساترة في غرفة الجفاف لمدة 5 دقائق (وهذا يعتمد على نسبة الرطوبة في الغرفة والمبلغ الذي يتم حقنه). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد تجفيف تغطية الأجنة مع زيت الهالوكربون 700 (سيجما) لتجنب المزيد من الجفاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع ساترة على شريحة المجهر مع الأجنة مواجهة. قد كنت وضعت قطرة من الماء على الشريحة لمنع الانتقال من ساترة. الأجنة هي الآن جاهزة للحقن. موقع الحقن هو عادة على الجانب الوحشي في منتصف الجنين. </li></ol> 3. حقن الجنين <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إرفاق الإبرة إلى مياداة مجهرية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكسر غيض إبرة وضعت على حافة ساترة في مجال الرؤية وضبط الإبرة إلى الطائرة الاتصال نفسه. تحرك بحذر جدا ساترة حتى يضرب رأس الإبرة ويكسر ذلك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع التركيز على الأجنة، ضع الإبرة في النفط وتأكد من الحصول على قطرة السائل من إبرة. ذلك يعني تم غيض إبرةكسر جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دون لمس حامل إبرة نقل الجنين في إبر وحقن تسقط في جنين. نقل الجنين بعيدا والمضي قدما إلى المرحلة التالية حتى يتم حقن كل الأجنة. </li></ol> 4. التصوير نحن صورة الأجنة على مجهر متحد البؤر المقلوب مع الهدف 40X أو 100X. ونحن نتطلع لوضع الجنين بشكل جيد مع الجهاز العصبي المركزي في الوسط، مما يدل على التعبير GFP قوي ووضع العلامات الجيدة من الخلايا أفكارك بعد الحقن. للمرة تسجيلات انقضاء الأجنة الحية نختار عادة 5 أو 6 شرائح متحد البؤر (2 ميكرون سميكة لكل منهما). بعد ذلك، ونحن جعل الإسقاط من 3 شرائح (6 سماكة ميكرون) من أجل مراقبة الخلايا بأكملها. نحن نستخدم علامات لخلايا أفكارك التي هي مستقرة ولا التبييض بسهولة. لتجنب التبييض نجعل التسجيلات في فترات من 60 ثانية GFP. في بعض الحالات قد تبدأ الأجنة المتداولخلال ذلك الوقت من تسجيل الفيديو. ولذلك، فإننا نلقي نظرة مرة واحدة في حين لاخر على تسجيل من أجل وقف والبدء من جديد إذا لزم الأمر.

<ol><li>Kinchen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+to+die+for%3A+signaling+to+apoptotic+cell+removal+in+worm%2C+fly+and+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">A model to die for: signaling to apoptotic cell removal in worm, fly and mouse.</a> Apoptosis. 15, 998-1006 (2010).</li>
<li>Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagosome+maturation%3A+going+through+the+acid+test%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Phagosome maturation: going through the acid test.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 781-795 (2008).</li>
<li>Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytic+signaling%3A+you+can+touch%2C+but+you+can%27t+eat%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Phagocytic signaling: you can touch, but you can't eat.</a> Curr. Biol. 18, 521-524 (2008).</li>
<li>Stuart, L. M., Ezekowitz, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis%3A+elegant+complexity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis: elegant complexity.</a> Immunity. 22, 539-550 (2005).</li>
<li>Lauber, K., Blumenthal, S. G., Waibel, M., Wesselborg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearance+of+apoptotic+cells%3A+getting+rid+of+the+corpses%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Clearance of apoptotic cells: getting rid of the corpses.</a> Mol. Cell. 14, 277-287 (2004).</li>
<li>Henson, P. M., Hume, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+cell+removal+in+development+and+tissue+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Apoptotic cell removal in development and tissue homeostasis.</a> Trends Immunol. 27, 244-250 (2006).</li>
<li>Kurant, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keeping+the+CNS+clear%3A+glial+phagocytic+functions+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Keeping the CNS clear: glial phagocytic functions in Drosophila.</a> Glia. 59, 1304-1311 (2011).</li>
<li>Kurant, E., Axelrod, S., Leaman, D., Gaul, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Six-microns-under+acts+upstream+of+Draper+in+the+glial+phagocytosis+of+apoptotic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Six-microns-under acts upstream of Draper in the glial phagocytosis of apoptotic neurons.</a> Cell. 133, 498-509 (2008).</li>
<li>Mergliano, J., Minden, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-independent+cell+engulfment+mirrors+cell+death+pattern+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Caspase-independent cell engulfment mirrors cell death pattern in Drosophila embryos.</a> Development. 130, 5779-5789 (2003).</li>
<li>van den Eijnde, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+exposure+of+phosphatidylserine+during+apoptosis+is+phylogenetically+conserved%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">Cell surface exposure of phosphatidylserine during apoptosis is phylogenetically conserved.</a> Apoptosis. 3, 9-16 (1998).</li>
</ol>

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

إزالة الخلايا أفكارك هي المرحلة الأخيرة الحاسمة من موت الخلايا المبرمج، وهو ديناميكية للغاية. لذا دراسات الوقت الحقيقي من عملية ذات أهمية قصوى. نحن هنا وصف البروتوكول الذي يتيح رصد إزالة الخلايا أفكارك في العيش النامية أجنة ذبابة الفاكهة. في هذا الإجراء، يجب أن تكون وضعت اثنين من السكان من الخلايا باستخدام علامات محددة: الخلايا أفكارك والبالعات. مراسل تليفون-cytGFP هو مناسبة لرصد الضامة البلعمة، الدبقية والأديم الظاهر في وقت واحد في نفس الجنين، hich ث يج...

القضاء السليم للخلايا غير المرغوب فيها أو الشاذة من خلال موت الخلايا المبرمج والبلعمة اللاحقة أمر بالغ الأهمية لنمو الجنين وكذلك للتوازن الأنسجة في الكبار. البلعمة من الخلايا أفكارك أو إزالة الخلايا أفكارك هي عملية ديناميكية للغاية التي تسير في أربع خطوات: (1) تعيين البالعات إلى الخلية أفكارك (&#39;العثور-ME&#39;)، (2) الاعتراف الخلية كهدف للالبلعمة ( &#39;أكل لي&#39;) و (3) الغمر، تليها (4) نضوج يبلوع وتدهور جسيم أفكارك 1-5. هناك نوعان من البالعات: الضامة &#39;المهنية&#39; والخلايا الجذعية غير الناضجة، و &#39;غير مهنية&#39; الخلايا المجاورة الأنسجة المقيمين، والتي هي حاسمة لإزالة الخلايا أفكارك أثناء تطوير metazoan 6،7. ذبابة الفاكهة في التنمية، والقضاء على خلايا زائدة عن الحاجة من خلال موت الخلايا المبرمج يحدث في ثلاثة ممراحل عين، لأول مرة في منتصف إلى أواخر الجنين، ثم في منتصف خادرة، ومرة ​​أخرى في الكبار في وقت مبكر. خلال مرحلة التطور الجنيني تتم إزالة الجسيمات أفكارك بواسطة البالعات &#39;المهنية&#39;، الضامة، والأديم الظاهر و&#39;غير مهنية&#39; والدبقية 8،9. في أعمالنا السابقة حددنا مستقبلات البلعمية، لمدة ستة ميكرون تحت (SIMU)، وهو ما يعبر عنه حصرا في الخلايا البلعمية خلال مرحلة التطور الجنيني. باستخدام المروج تليفون ولدت لدينا علامة محددة للسكان الخلية البلعمية (سيمو-cytGFP) والتي تمكننا من رصد الضامة، الأديم الظاهر والدبقية في وقت واحد في وضع الجنين ايف 8. وبالإضافة إلى ذلك، باستخدام علامات محددة للخلايا أفكارك في مراحل مختلفة من موت الخلايا المبرمج، ونحن قادرون على تتبع تحركات لإزالة الخلايا الميتة في الجسم الحي.

<table><tr><tbody><td colspan = "4" >Reagent</td></tr><tr><td>Annexin V </td><td>Molecular Projects</td><td>A35108</td><td></td></tr><tr><td>PhiPhiLux G2D2</td><td>OncoImmunin</td><td>A304R2G-5</td><td></td></tr><tr><td>LysoTracker</td><td>Molecular Projectes</td><td>L-7528</td><td></td></tr><tr><td>زيت الهالوكربون 700</td><td>Sigma</td><td>H8898</td><td></td></tr><tr><td colspan = "4">< قوية > المواد < / قوية ></td></tr> <tr><td>أنابيب شعرية</td><td>FHC</td><td>30-30-0</td><td></td></tr><tr><td>مصفاة الخلية</td><td>SPL</td><td>93100</td><td></td></tr><tr><td>فرشاة</td><td></td><td></td><td></td> الرسم</tr></tbody></table>

يعيش التصوير من تخليص الخلية أفكارك أثناء<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; مرحلة التطور الجنيني

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

القضاء السليم للخلايا غير المرغوب فيها أو الشاذة من خلال موت الخلايا المبرمج والبلعمة لاحقة (إزالة الخلايا الميتة) أمر بالغ الأهمية من أجل التنمية طبيعي في جميع الكائنات الحية metazoan. إزالة الخلايا أفكارك هي عملية ديناميكية للغاية يرتبط ارتباطا وثيقا مع موت الخلايا؛ تعتبر الخلايا أفكارك unengulfed بالكاد في الجسم الحي في ظل ظروف طبيعية. من أجل فهم الخطوات المختلفة لإزالة الخلايا الميتة ومقارنة البالعات &#39;المهنية&#39; - الضامة، والخلايا الجذعية إلى &#39;غير مهنية&#39; - خلايا الأنسجة المجاورة المقيمين، في الجسم الحي التصوير المباشر لعملية قيمة للغاية. نحن هنا وصف بروتوكول لدراسة التخليص الخلية أفكارك في العيش أجنة ذبابة الفاكهة. لمتابعة ديناميات الخطوات المختلفة في البلعمة نستخدم علامات محددة للخلايا أفكارك والبالعات. وبالإضافة إلى ذلك، يمكننا رصد نظامين بلعمية في نفس الوقت: الضامة &#39;المهنية&#39; و &#39;نصف profeالدبقية ssional &#39;في الجهاز العصبي المركزي النامية (CNS). الطريقة الموضحة هنا توظف الجنين ذبابة الفاكهة نموذجا ممتازا للدراسات في الوقت الحقيقي من إزالة الخلايا الميتة.

وتظهر إطارات ممثل عن فيلم التي وصفت الخلايا أفكارك مع Annexin V، ويطلق عليها الخلايا الدبقية، الأديم الظاهر والضامة مع تليفون-cytGFP في الشكل 2. كل الإطار هو إسقاط 3 شرائح 2 ميكرومتر لكل منهما. يتم وضع الجنين من مرحلة 15 بشكل صحيح تبين CNS الجنينية في الوسط مع الدبقية المسمى كذلك (ز). الضامة (M)، التي هي في معظمها خارج الجهاز العصبي المركزي، وتبين قوية التعبير GFP حشوية. وصفت الخلايا الأ...

هنا نحن تصف طريقة فعالة لدراسة ديناميات إزالة الخلايا الميتة<em&gt; في الجسم الحي</em&gt;. هذا الأسلوب يعمل العيش<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الأجنة كنموذج قوية لرصد البلعمة للخلايا أفكارك باستخدام وضع العلامات المحددة للخلايا أفكارك والبالعات.

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

الهدف العام من هذا الإجراء هو تتبع ديناميكيات التخلص من الخلايا المبرمجة (apoptotic cells) في جنين ذبابة الفاكهة (drosophila). ويتم تحقيق ذلك باستخدام ذباب معدل وراثياً يحتوي على علامة GFP سيتوبلازمية، والتي تحدد مجموعات الخلايا البلعمية؛ حيث يتم جمع الأجنة التي تحمل علامة Simio GFP، وغسلها، وتغطيتها. بعد ذلك، يتم وضع الأجنة في وضعية تسمح بالحقن، يلي ذلك مراقبة الجهاز العصبي المركزي (CNS).تتمثل الخطوة الثالثة في وسم الخلايا المبرمج موتها عن طريق حقن الأجنة بعلامات بلعمة خاصة بالموت الخلوي المبرمج، مثل X in five، والخطوة النهائية هي إجراء تسجيلات زمنية (time-lapse) للجهاز العصبي المركزي الجنيني باستخدام المجهر البؤري. وفي النهاية، يمكن للنتائج أن توضح تموضع وسلوك الخلايا المبرمج موتها والخلايا البلعمية خلال مراحل مختلفة من التخلص من الخلايا المبرمج موتها عبر المجهر البؤري الفلوري. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل الكيمياء النسيجية المناعية على الأجنة المثبتة، في قدرتنا على تتبع ديناميكيات التخلص من الخلايا المبرمج موتها.تعد عملية التخلص من الخلايا المبرمجة عملية ديناميكية للغاية تتضمن خطوات متنوعة. تتيح لنا هذه التقنية تتبع الخطوات المختلفة باستخدام واسمات محددة للخلايا المبرمجة والخلايا البلعمية. يبدأ البروتوكول بصنع مادة لاصقة من كواشف تقليدية؛ حيث يتم فك شريط لاصق مزدوج الوجه، ثم لفه مرة أخرى ليتناسب مع قارورة وميضية.املأ القارورة بالهيبتان وأغلقها بإحكام. ثم قم بتثبيت القارورة على جهاز هزاز وقم برجها بلطف لمدة 24 ساعة. وفي اليوم التالي، وفي درجة حرارة الغرفة، يتم نقل الغراء المُحضّر إلى قارورة جديدة.استخدم ماصة زجاجية لنقل الغراء المُحضّر إلى وعاء جديد. وبمجرد التحضير، استخدم رأس ماصة لوضع الغراء على شرائح التغطية. وزع قطرة من غراء الهيبتان في خط مستقيم بمنتصف شريحة التغطية.اترك الغراء ليجف لبضع ثوانٍ. يمكن بعد ذلك تخزين شرائح التغطية في درجة حرارة الغرفة داخل صندوق مغلق لمدة تصل إلى شهر بعد تخدير الذباب باستخدام ثاني أكسيد الكربون. ضع حوالي 400 ذبابة في وعاء تجميع مع لوح وضع بيض يحتوي على عصير العنب الدافئ، مع ضبط درجة الحرارة على 25 degrees Celsius لمدة ساعتين. اجمع لوح وضع البيض بعصير العنب وغطِّ الوعاء بلوح جديد للحفاظ على استقرار الذباب.تحتوي الشريحة التي تم جمعها على أجنة يتراوح عمرها من صفر إلى ساعتين. أعد شريحة وضع البيض التي تحتوي على عصير العنب والأجنة إلى حاضنة بدرجة حرارة 25 درجة مئوية حتى تصل إلى النقطة الزمنية التنموية المطلوبة. في هذا المثال، يتم تحضين الأجنة لمدة تتراوح بين 10 و 12 ساعة، لكي تتطور إلى المرحلة 15 أو 16 بعد نموها.استخدم مياه الصنبور وفرشاة رسم نظيفة لنقل الأجنة من الطبق إلى مصفاة خلايا. ضع المصفاة فوق وعاء بحيث يمكن استعادة أي أجنة قد تسقط. اشطف الأجنة المجمعة حتى يتم إزالة جميع بقايا عجينة الخميرة.بعد ذلك، جفف المياه الزائدة عن طريق مسح الجزء الخارجي من المصفاة. ضع مصفاة الخلايا في طبق بتري نظيف لإزالة الغشاء الكوريوني بشكل كافٍ. أضف مبيضاً بتركيز 50% لتغطية الأجنة الموجودة في مصفاة الخلايا وانتظر لمدة دقيقتين، مع تحريكها من مرتين إلى ثلاث مرات.بعد ذلك، اشطف الأجنة حتى تزول رائحة المبيّض. ضع الأجنة الموجودة في حاوية الخلايا داخل طبق بتري نظيف وغطِّها بالماء لمنع جفافها. وذلك تمهيداً لحقن الأجنة.قم بتجهيز إبر الحقن مسبقاً باستخدام أداة سحب الإبر وخيوط زجاجية رقيقة الجدران. قم بتحميل 1 µL من الكاشف المطلوب في إبرتين، بحيث تكون إحدى الإبر بمثابة احتياطية. ويُعد استخدام علامة مستقرة لا تبهت بسهولة، مثل X in five، خياراً جيداً للكاشف.الآن، ضع قطعة مستطيلة من أغار عصير العنب على المجهر. قم بتزليق ونقل الأجنة من المصفاة إلى الأغار. وباستخدام فرشاة رسم نظيفة تحت مجهر تشريح فلوري، اختر الأجنة في المرحلة العمرية المناسبة للحقن باستخدام علامة GFP.باستخدام فرشاة رسم مبللة، انقل الأجنة المختارة إلى صف مكون من 10 أجنة بحيث تكون جوانبها البطنية للأعلى. ضع الصف عند حافة كتلة الآجار. يمكن رؤية GFP في الجهاز العصبي المركزي للجنين.الآن قم بتثبيت الأجنة على شريحة غطاء باستخدام شريط من غراء الهبتان. إن الوضع الصحيح للأجنة أمر بالغ الأهمية لنجاح عملية الحقن. خذ وقتك وتأكد من محاذاة الأجنة بدقة وفي الاتجاه المناسب.بعد ذلك، ضع غطاء الشريحة في غرفة التجفيف لمدة خمس دقائق تقريبًا. وبعد تجفيف الأجنة، غطّها بزيت Hello carbon oil 700 لتجنب المزيد من التجفيف. وأخيرًا، ضع قطرة من الماء على شريحة مجهرية.بعد ذلك، ضع حافة الغطاء بحيث تكون الأجنة متجهة للأعلى على شريحة المجهر الرطبة. الأجنة الآن جاهزة للحقن. ابدأ بتوصيل الإبرة بجهاز التحكم الدقيق (micromanipulator) ومضخة بيكو (pico pump).تتحكم المضخة في كمية السائل المحقون عن طريق دفع النيتروجين إلى الإبرة. وتتحكم دواسة قدم في عملية الطرد المقيد للنيتروجين تحت المجهر. ركز على طرف الإبرة وقم بوضعه بالقرب من حافة غطاء الشريحة مع التأكد بعناية شديدة من ضبط تركيز طرف الإبرة وغطاء الشريحة.حرك غطاء الشريحة حتى يلامس طرف الإبرة ويؤدي إلى كسره. يجب أن يتراوح قطر الفتحة بين 0.5 إلى 2 µm. الآن، قم بضبط التركيز على الأجنة.أدخل الإبرة في الزيت. إذا تم كسر طرف الإبرة بشكل صحيح، يجب أن تظهر قطرة من السائل تتسرب إلى الزيت. عند الضغط على الدواسة دون لمس حامل الإبرة، حرك المنصة بحيث يتم ثقب الحافة الجانبية للجنين بواسطة الإبرة.احقن قطرة من المحلول بسرعة في الجنين. حرك الجنين بعيداً وانتقل إلى الجنين التالي حتى يتم حقن جميع الأجنة العشرة. قم بتصوير الأجنة باستخدام مجهر بؤري مسحي مقلوب بعدسة شيئية بقوة 40 x أو 100 x.ابحث عن جنين في وضعية مناسبة بحيث يكون الجهاز العصبي المركزي (CNS) في المنتصف، ويظهر تعبيراً قوياً لبروتين GFP ووسماً للخلايا المبرمجة (apoptotic cells). ولإجراء تسجيلات الفاصل الزمني (time-lapse)، اختر خمس أو ست شرائح بؤرية (confocal slices) لتثبيتها بدقة الميكرون في هذه المواقع. قم بإجراء مسح كل 60 ثانية، وهو فاصل زمني لا ينبغي أن يسبب مشكلة في تبييض (bleaching) بروتين GFP.بعد ذلك، قم بعمل مسقط لثلاث شرائح بسُمك 6 micron لملاحظة الخلايا بأكملها. في بعض الحالات، قد يبدأ الجنين في الدوران أثناء فترة تسجيل الفيديو؛ لذا، راقب التسجيل لضمان عدم ضياع الوقت بسبب تحرك الأجنة.يظهر جنين في المرحلة 15 في وضعية صحيحة الجهاز العصبي المركزي الجنيني في المنتصف مع تسمية واضحة للخلايا الدبقية المرمزة بـ g، بينما تظهر البلاعم M، والتي تقع معظمها خارج الجهاز العصبي المركزي، تعبيراً قوياً لبروتين GFP في السيتوبلازم. كما تم وسم الخلايا الأديمية الخارجية E ببروتين GFP السيتوبلازمي أيضاً.تظهر هذه الإطارات خلايا استماتية تم وسمها بـ ex in five، وخلايا الأديم الظاهر والبلاعم التي تم وسمها بـ cite GFP. كل إطار عبارة عن مسقط لثلاث شرائح، وسمك كل شريحة 2 microns. توجد العديد من الخلايا الموجبة لـ an ex in five داخل وخارج الجهاز العصبي المركزي (CNS).يُظهر الحدث المؤطر خلية دبقية تقوم بابتلاع جسيم موت خلوي مبرمج. لاحظ سلوك الاستقصاء للخلية الدبقية؛ حيث تلمس جسيم الموت الخلوي المبرمج عدة مرات قبل أن تشرع في ابتلاع الخلية المبرمجة بعد تطورها.لقد مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال التخلص من الخلايا المبرمج لاستكشاف عملية البلعمة للخلايا المبرمج أثناء التطور. وباستخدام هذه التقنية، يمكننا استكشاف السلوك الديناميكي للغاية لعملية التخلص من الخلايا المبرمج.

live-imaging-apoptotic-cell-clearance-during-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

hemocytes ذبابة الفاكهة تفريق أكثر من مجمل الجنين النامية. هذا البروتوكول يوضح كيفية تحميل الصور وهذه الهجرات استخدام الاجنة مع hemocytes fluorescently المسمى.

يعيش تصوير ذبابة الفاكهة السوداء البطن هجرات كرية دموية الجنينية

يوضح هذا الفيديو تقنية تلطيخ مناعي لتصور ابتلاع الخلايا المبرمج في الخلايا الجنينية المتجانسة ذبابة الفاكهة السوداء. توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة على فسيولوجيا الخلايا من خلال تحديد مدى ابتلاع الخلايا المبرمجة.

مقايسة البلعمة: تقنية تلغيم مناعي لتصور ابتلاع الخلايا المبرمج في الخلايا الجنينية ذبابة الفاكهة السوداء

يوضح هذه الورقة استخدام المجهر متحد البؤر المسح السريع إلى سلوك الخلية صورة مباشرة من خلال puparium. من خلال ترك حالة العذراء سليمة، وهذا الأسلوب يسمح للمراقبة وقياس العمليات الحيوية في الخلية مرحلة من مراحل التنمية ذبابة الفاكهة التي يصعب دراسة مباشرة.

التصوير من خلال حالة العذراء من<em&gt; ذبابة الفاكهة السوداء البطن</em

هذا البروتوكول تفاصيل طريقة مبسطة تستخدم لإجراء التصوير الخلية الحية في سياق الدماغ اليرقات سليمة. النهج التصوير الخلية الحية لا تقدر بثمن لدراسة الخلايا الجذعية العصبية الانقسامات غير المتماثلة فضلا عن العمليات العصبية والتنموية الأخرى، كشف باستمرار الآليات التي تم تجاهلها سابقا.

التصوير المباشر ل<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; اليرقات Neuroblasts

يقدم هذا البروتوكول طريقة فعالة لتصوير ذبابة الفاكهة الظهارية العصبية الحية للعين العذراء. تعوض هذه الطريقة عن حركة الأنسجة والطوبولوجيا غير المتكافئة ، وتعزز تصور حدود الخلية من خلال استخدام العديد من بروتينات التوصيل الموسومة ب GFP ، وتستخدم جهاز تصوير سهل التجميع.

يعيش التصوير لل ذبابة الفاكهة العذراء العين

للكشف عن الخلايا السليمة في الحيوانات كلها التي تحتوي على مستويات منخفضة من النشاط كاسباس، تم إنشاء جهاز الاستشعار البيولوجي حساسة للغاية المعينة CaspaseTracker لذبابة الفاكهة. تم الكشف عن نشاط جهاز الاستشعار البيولوجي التي تعتمد على كاسباس في الخلايا السليمة عاش فترة طويلة في جميع أنحاء الأعضاء الداخلية للحيوانات الكبار تربى في ظل ظروف الأمثل في ظل غياب المحفزات الموت.

في فيفو جهاز الاستشعار البيولوجي المسارات غير أفكارك كاسباس آخر في ذبابة الفاكهة

نحن هنا وصف مقايسة البلعمة باستخدام الخلايا الجنينية فرقت من ذبابة الفاكهة . أنها تمكننا من تحديد بسهولة ودقة في مستويات البلعمة في الجسم الحي ، وتحديد جزيئات جديدة مطلوبة للبلعمة من الخلايا أبوبتوتيك.

البلعمة فحص الخلايا الخلوية في ذبابة الفاكهة الأجنة

يتم تقديمها هنا هو بروتوكول لmicroinject وفي وقت واحد صورة الأجنة Drosophila متعددة خلال النمو الجنيني باستخدام لوحة المستندة إلى، صورة عالية المحتوى.

Drosophila إعداد الجنين و Microinjection لالمجهر الخلية لايف تنفيذها باستخدام محلل المحتوى العالي الآلي

المجهر الفلوري القائم على الورقة الخفيفة هو الأداة الأكثر قيمة في علم الأحياء التنموي. ومن القضايا الرئيسية في الدراسات المقارنة التباين المحيط. يصف بروتوكولنا إطارا تجريبيا للتصوير الحي المتزامن لعينات متعددة ، وبالتالي ، يعالج هذه المشكلة بشكل نشط.

التصوير الحي المتزامن للأجنة الحشرية المتعددة في مجاهر فلورسينس ورقة الضوء المستندة إلى غرفة العينة

يصف هذا البروتوكول وضع العلامات الفلورية المخصصة القائمة على الأجسام المضادة وحقنها في أجنة ذبابة الفاكهة المبكرة لتمكين التصوير المباشر للبروتينات منخفضة الوفرة أو التعديلات اللاحقة للترجمة التي يصعب اكتشافها باستخدام أساليب GFP / mCherry-tag التقليدية.

تصور البروتينات منخفضة الوفرة والتعديلات اللاحقة للترجمة في أجنة ذبابة الفاكهة الحية عن طريق حقن الأجسام المضادة الفلورية

هنا ، نقدم بروتوكولا مفصلا لإجراء تصوير مباشر للانقسام غير المتماثل للخلايا الجذعية الجرثومية (GSCs) في ذبابة الفاكهة في مكانة المبيض. نستخدم خطا معدلا وراثيا يعبر في كل مكان عن اندماج البروتين الفلوري الأخضر (GFP) لبروتين الطيف Par-1.

التصوير الحي الممتد لمنافذ الخلايا الجذعية الجرثومية ذبابة الفاكهة السوداء

تعلم تقنية التصوير الحي لدراسة ديناميكيات تخلص الخلايا المبرمجة في أجنة ذبابة الفاكهة باستخدام المجهر المكافئ. تتيح هذه الطريقة مراقبة سلوك البلعميات والخلايا الميتة في الوقت الفعلي.

يعيش التصوير من تخليص الخلية أفكارك أثناء

استكشف المزيد من الفيديوهات