Name: تحديد الجمال النائم الإدراج ينقول في الأورام الصلبة باستخدام رابط بوساطة PCR (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: اكتشف طريقة تحديد الجينات المسرطنة والكابتة للأورام باستخدام إدراجات النقالة الجمال النائم في نموذج الفأر. تُمكّن هذه التقنية الباحثين من رسم خرائط التغيرات الجينية التي تدفع تكوين الأورام الصلبة.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

فإن الكتاب أود أن أشكر براندن Moriarity، Largaespada ديفيد، وكنج فنسنت في جامعة مينيسوتا، ودوبوي آدم في جامعة ولاية ايوا لمساعدتهم في تطوير بروتوكول الموصوفة أعلاه.

<ol><li>Fearon, E. R., Vogelstein, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+model+for+colorectal+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A genetic model for colorectal tumorigenesis.</a> Cell. 61, 759-767 (1990).</li>
<li>Wood, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Genomic+Landscapes+of+Human+Breast+and+Colorectal+Cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The Genomic Landscapes of Human Breast and Colorectal Cancers.</a> Science. 318, 1108-1113 (2007).</li>
<li>Ivics, Z., Hackett, P. B., Plasterk, R. H., Izsvák, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Reconstruction+of+Sleeping+Beauty%2C+a+Tc1-like+Transposon+from+Fish%2C+and+Its+Transposition+in+Human+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular Reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like Transposon from Fish, and Its Transposition in Human Cells.</a> Cell. 91, 501-510 (1997).</li>
<li>Starr, T. K., Largaespada, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+gene+discovery+using+the+Sleeping+Beauty+transposon%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Cancer gene discovery using the Sleeping Beauty transposon.</a> Cell Cycle. 4, 1744-1748 (2005).</li>
<li>Mueller, P. R., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Footprinting+of+a+Muscle+Specific+Enhancer+by+Ligation+Mediated+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In Vivo Footprinting of a Muscle Specific Enhancer by Ligation Mediated PCR.</a> Science. 246, 780-786 (1989).</li>
<li>Bergemann, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+methods+for+finding+common+insertion+sites+and+co-occurring+common+insertion+sites+in+transposon-+and+virus-based+genetic+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">New methods for finding common insertion sites and co-occurring common insertion sites in transposon- and virus-based genetic screens.</a> Nucleic acids research. 40, 3822-3833 (2012).</li>
<li>Copeland, N. G., Jenkins, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+transposons+for+cancer+gene+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Harnessing transposons for cancer gene discovery.</a> Nature Reviews Cancer. 10, 696-706 (2010).</li>
<li>Collier, L. S., Carlson, C. M., Ravimohan, S., Dupuy, A. J., Largaespada, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+gene+discovery+in+solid+tumours+using+transposon-based+somatic+mutagenesis+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cancer gene discovery in solid tumours using transposon-based somatic mutagenesis in the mouse.</a> Nature. 436, 272-276 (2005).</li>
<li>Starr, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transposon-based+genetic+screen+in+mice+identifies+genes+altered+in+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A transposon-based genetic screen in mice identifies genes altered in colorectal cancer.</a> Science. 323, 1747-1750 (2009).</li>
<li>Keng, V. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conditional+transposon-based+insertional+mutagenesis+screen+for+genes+associated+with+mouse+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A conditional transposon-based insertional mutagenesis screen for genes associated with mouse hepatocellular carcinoma.</a> Nature. 27, 264-274 (2009).</li>
<li>Dupuy, A. J., Akagi, K., Largaespada, D. A., Copeland, N. G., Jenkins, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+mutagenesis+using+a+highly+mobile+somatic+Sleeping+Beauty+transposon+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mammalian mutagenesis using a highly mobile somatic Sleeping Beauty transposon system.</a> Nature. 436, 221-226 (2005).</li>
</ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شاشة الوراثية إلى الأمام باستخدام نظام النوم ينقول الجمال يوفر طريقة لتحديد الطفرات التي تسبب السرطان. عن طريق اختيار المروج المناسبة لمراقبة لجنة المساواة العرقية Recombinase بالإضافة إلى أي طفرات المهيئة، فإن الشاشة SB تحديد جينات جديدة معروفة وسرطان مرشح. نجاح على شاشة SB يعتمد إلى حد كبير على الفئران التي اختيرت لإنشاء الشاشة. لينقول، نوصي باستخدام الماوس سلالتين مختلفة تحمل concata...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td><td> التعليقات (اختياري) </td></tr><tr><td> متأكد الختم التعريفي غرفة </td><td> الدماغ شجرة العلمية </td><td> EZ-177 </td><td></td></tr><tr><td> Cryovial </td><td> Bioexpress </td><td> C-3355-2 </td><td></td></tr><tr><td> التخزين المؤقت الفورمالين 10٪ </td><td> سيغما الدريتش </td><td> HT501128-4L </td><td></td></tr><tr><td> البروتين الأمطار الحل </td><td> QIAGEN </td><td> 158910 </td><td></td></tr><tr><td> الخلية تحلل العازلة </td><td> QIAGEN </td><td> 158906 </td><td></td></tr><tr><td> بروتين K </td><td> QIAGEN </td><td> 158920 </td><td></td></tr><tr><td> ريبونوكلياز A </td><td> QIAGEN </td><td> 158924 </td><td></td></tr><tr><td> TE العازلة </td> &lt;TD&gt; Promega </td><td> V6232 </td><td></td></tr><tr><td> BfaI </td><td> نيو انغلاند Biolabs </td><td> R0568S </td><td></td></tr><tr><td> NlaIII </td><td> نيو انغلاند Biolabs </td><td> R0125S </td><td></td></tr><tr><td> MinElute 96 لوحات جيدة </td><td> QIAGEN </td><td> 28051 </td><td></td></tr><tr><td> QIAvac متعددة فراغ 96 </td><td> QIAGEN </td><td> 19504 </td><td></td></tr><tr><td> صفيحة ميكروسكوبية متعددة الجني، 120V </td><td> العلمية للصناعات، وشركة </td><td> SI-4000 </td><td></td></tr><tr><td> T4 يغاز DNA مع العازلة ربط 5X </td><td> إينفيتروجن </td><td> 15224-041 </td><td></td></tr><tr><td> BamHI </td><td> نيو انغلاند Biolabs </td><td> R0136S </td><td></td></tr><tr><td> 25mM dNTPs </td><td> Bioexpress </td><td> C-5014-200 </td><td></td></tr><tr><td> البلاتين طق </td><td> إينفيتروجن </td><td&gt; 10966-034 </td><td></td></tr><tr><td> FastStart البلمرة DNA طق </td><td> روش </td><td> 12032929001 </td><td></td></tr><tr><td> الاغاروز </td><td> Promega </td><td> V3121 </td><td></td></tr><tr><td> TAE عازلة </td><td> Promega </td><td> V4271 </td><td></td></tr><tr><td> TE العازلة </td><td> Promega </td><td> V6232 </td><td></td></tr><tr><td> إيثيديوم بروميد </td><td> Promega </td><td> H5041 </td><td></td></tr></tbody></table>

تحديد<em&gt; الجمال النائم</em&gt; الإدراج ينقول في الأورام الصلبة باستخدام رابط بوساطة pcr

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

الجينومية وتحليل البروتين، transcriptomic، وepigenomic الأورام الإنسان تشير إلى أن هناك الآلاف من الحالات الشاذة في كل جينوم السرطان مقارنة مطابقة الأنسجة الطبيعية. بناء على هذه التحليلات من الواضح أن هناك العديد من السائقين الجينية غير مكتشفة من السرطان 1. للأسف مخفية ضمن برامج التشغيل هذه عدد أكبر بكثير من الحالات الشاذة الركاب في الخريطة الوراثية البشرية التي لا تساهم مباشرة في تشكيل الورم. وثمة جانب آخر للجينوم السرطان أن هناك عدم تجانس كبير الوراثية ضمن أنواع الأورام مماثلة. يمكن لكل ورم تؤوي الطفرات المختلفة التي توفر ميزة انتقائية لتكوين ورم 2. أداء غير منحازة شاشة الوراثية إلى الأمام في الفئران يوفر الأدوات اللازمة لتوليد أورام وتحليل تركيبتها الجينية، مع الحد من خلفية الطفرات الركاب. ونظام النوم الجمال ينقول (SB) هو أسلوب واحد من هذا القبيل 3. النظام يستخدم المحمول SB الخامسectors (ترانسبوزونات) التي يمكن إدراجها في جميع أنحاء الجينوم من قبل انزيم transposase. وتقتصر الطفرات إلى نوع خلية معينة من خلال استخدام أليل transposase الشرطي الذي يتم تفعيلها من خلال لجنة المساواة العرقية Recombinase. خطوط الماوس وجود العديد من لجنة المساواة العرقية التي Recombinase صريحة في أنسجة معينة. عن طريق عبور واحدة من هذه الخطوط إلى أليل transposase المشروطة (مثل السلمون المدخن للتوقف وكس-SB11)، يتم تنشيط نظام SB فقط في الخلايا التي تعبر عن لجنة المساواة العرقية Recombinase. ستقوم لجنة المساواة العرقية Recombinase المكوس شريط التوقف الذي يمنع التعبير عن أليل transposase، وبالتالي تفعيل الطفرات ينقول في نوع من الخلايا المعينة. يبدأ على شاشة SB عن طريق تربية ثلاث سلالات من الفئران المعدلة وراثيا بحيث تحمل الفئران التجريبية أليل transposase المشروط، وهو concatamer من ترانسبوزونات، وRecombinase لجنة المساواة العرقية أليل الأنسجة محددة. ويسمح لهذه الفئران في العمر حتى شكل أورام وتصبح المحتضرة. الفئران هي ثميتم عزل الحمض النووي الجيني وnecropsied من الأورام. المقبل، وتعرض الحمض النووي الجيني لPCR-رابط بوساطة (LM-PCR) التي تؤدي إلى التضخيم من مواضع الجينومية التي تحتوي على ينقول SB. LM-PCR يقوم على وجود ورم واحد سيؤدي إلى مئات amplicons متميزة تمثل مئات مواضع الجينومية التي تحتوي على الإدراج في 4 ينقول ورم واحد. يتم تحليل الإدراج ينقول في جميع الأورام وتحديد المواقع الإدراج المشترك (كيبك) باستخدام الأساليب الإحصائية المناسبة 5. الجينات داخل رابطة الدول المستقلة من المرجح للغاية أن تكون الجينات المسرطنة أو الجينات الكابتة للورم، وتعتبر جينات السرطان مرشح. مزايا استخدام نظام لتحديد الجينات SB سرطان المرشحة هي: 1) يمكن بسهولة أن يكون موجودا ينقول في الجينوم لأنه من المعروف تسلسل لها، 2) تبديل يمكن أن يوجه إلى نوع تقريبا أي خلية و3) وقادر على ينقول عرض كل مكسب والخسارة من وظيفة الطفرات 6. وfollowiنانوغرام بروتوكول يصف كيفية وضع وتنفيذ شاشة الوراثية إلى الأمام باستخدام نظام ينقول SB لتحديد جينات السرطان مرشح (الشكل 1).

بعد تم تأسيس نظام التربية، وينبغي أن مربي إنتاج القمامة كل يوم 19-21. سوف تختلف حجم القمامة ما بين 5 و 12 الجراء، وهذا يتوقف على عمر من المربين والخلفية الوراثية. وبالإضافة إلى ذلك، تأكد من أن التركيب الوراثي من القمامة يلي مندلية الوراثة كوسيلة لتأكيد أن المخطط تربية صحيحة على حد سواء وناجحة. للتجربة أن تكون ناجحة، يجب أن حدوث الأورام في حيوانات التجارب تكون أكبر بكثير من حدوث الأورام في الحيوانات السيطرة. إذا ل...

ووصف طريقة التعرف السائقين غير معروف من التسرطن باستخدام نهج غير متحيز. أسلوب يستخدم<em&gt; الجمال النائم</em&gt; ينقول بوصفها المغير العشوائية الموجهة إلى أنسجة معينة. رسم الخرائط الجينية من الإدراج ينقول التي تدفع تشكيل الورم يحدد الجينات المسرطنة الرواية والجينات الكابتة للورم

تحديد<em&gt; الجمال النائم</em&gt; الإدراج ينقول في الأورام الصلبة باستخدام رابط بوساطة PCR

Genomic, proteomic, transcriptomic, and epigenomic analyses of human tumors indicate that there are thousands of anomalies within each cancer genome ...

يوضح هذا الإجراء كيفية تحديد الجينات المسرطنة الجديدة والجينات المثبطة للورم عن طريق رسم خرائط التبديل عند عمليات الإدراج في الفأر التي تدفع تكوين الورم. يتم تحقيق ذلك عن طريق توليد الأورام وحصادها أولا من نموذج الفأر المعدلة وراثيا. تتمثل الخطوات التالية من الإجراء في عزل الحمض النووي للورم ، وإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل بوساطة الرابط ، ثم تسلسل عينات الحمض النووي المضخمة وتحليل التبديل عند الإدخال.في النهاية ، يحدد الإجراء الجينات المرشحة لمحرك الورم. الميزة الرئيسية لاستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل بوساطة الرابط جنبا إلى جنب مع الفحص الجيني غير المتحيز باستخدام ينقولات الجمال النائم ، هي أنه يمكننا بسهولة تحديد الدوافع الجينية الجديدة للسرطان. ابدأ دائما في التشريح عن طريق رش الجزء الخارجي من الفأر المضحى به بنسبة 70٪ من الإيثانول.يجب تقسيم الأنسجة والأورام المجمعة إلى أربعة أقسام ، يتراوح حجمها من 50 إلى 100 ملليغرام. قم بإصلاح قسم واحد في فورمين مخزن مؤقت بنسبة 10٪ لمدة 18 ساعة ، متبوعا بنسبة 70٪ من الإيثانول. يمكن استخدام هذا القسم لتلوين h و E و / أو الكيمياء المناعية.قم بتجميد الأجزاء المتبقية في النيتروجين السائل. يمكن تخزينها في الفريزر واستخدامها في D-N-A-R-N-A وعزل البروتين لجمع الحمض النووي من عينة الورم المجمدة. أولا ، قم بفرم الأنسجة بشفرة حلاقة.بعد ذلك ، هضم الأنسجة في أنبوب 1.5 مليلتر مع مليلتر واحد من المخزن المؤقت لتحلل الخلايا ، وخمسة ميكرولتر من 20 ملليغرام لكل مليلتر. يعمل محلول البروتياز K على دوامة الخليط جيدا والمضي قدما في استخراج الحمض النووي القياسي القائم على الأيزوبروبانول. ابدأ هذا البروتوكول عن طريق تلدين الروابط في أنبوب سعة 1.5 مل.امزج 50 ميكرولترا من كل محلول رابط مع ميكرولترين من كلوريد الصوديوم المركز. ثم ضع الأنبوب في كتلة حرارية 95 درجة مئوية. بعد خمس دقائق ، أطفئي النار واتركيها تبرد ببطء إلى درجة حرارة الغرفة ، والتي قد تستغرق ساعة أو أكثر بعد التبريد.يمكن تخزين الروابط الشرجية في الفريزر لحين الحاجة. قم بإعداد 2 96 لوحة بئر بواسطة علي نقلا عن ميكروغرام واحد من الحمض النووي من كل عينة في الآبار المقابلة في كلتا لوح الآبار البالغ عددها 96 لوحا. على سبيل المثال ، ضع ميكروغراما واحدا من الحمض النووي من عينة واحدة في البئر A واحدة من كلتا لوحي البئر.سيتم هضم الحمض النووي الموجود في إحدى ألواح الآبار البالغ عددها 96 باستخدام إنزيم الجانب الأيمن NLA ثلاثة وهضم عينات الحمض النووي في لوحة 96 البئر الأخرى باستخدام إنزيم الجانب الأيسر BFA واحد. اسمح للحمض النووي بالهضم طوال الليل عند 37 درجة مئوية. في اليوم التالي ، قم بإنهاء عملية الهضم بالحرارة ، وتعطيل الإنزيمات لمدة 20 دقيقة.الآن قم بتنظيف تفاعلات الهضم باستخدام لوح صغير من المسروقات 96. باستخدام الماصة متعددة القنوات، انقل كل عينة إلى المسروقات الصغيرة. 96 لوحة بئر.ضع لوح البئر المسروق الصغير 96 في مشعب مفرغ. ضع مكنسة كهربائية على الطبق حتى تبدو الآبار جافة. عادة ، 15 دقيقة طوال هذا البروتوكول.يجب توخي الحذر الشديد حتى لا تلوث عيناتك. عند العمل مع 96 ، تحافظ ألواح الآبار على الآبار مغطاة بأغطية قدر الإمكان وتتجنب تمرير الماصة فوق الآبار المفتوحة لأن أي قطرة من السائل غير المرغوب فيه يمكن أن تدمر العينة. قم بإزالة لوحة المسروقات الصغيرة من مشعب التفريغ وسد الجزء السفلي من اللوحة بمنشفة ورقية حتى يجف تماما.أعد تعليق الحمض النووي في المسروقات الصغيرة. 96 لوحة بئر بإضافة 30 ميكرولترا من الماء المقطر المزدوج لكل منها. حسنا ، ضع لوحة المسروقات الصغيرة على شاكر مداري مضبوطة على درجة عالية لمدة دقيقتين.بعد ذلك ، انقل محتويات لوحة المسروقات الصغيرة إلى لوحة نظيفة 96 بئر. لأداء تفاعلات ربط الرابط. قم بإعداد تفاعل الربط عن طريق خلط كمية كافية من المخزن المؤقت للربط ، وروابط راكبة من الخطوة 3.2 T أربعة DNA ligase والماء في خزان الكاشف.استخدم ماصة متعددة القنوات لنقل 10 ميكرولترات من الحمض النووي المهضوم من الخطوة السابقة إلى لوحة بئر جديدة سعة 96. ثم استخدم ماصة متعددة القنوات إلى Eloqua 10 ميكرولتر من تفاعل الربط لجميع آبار لوحة البئر 96. بعد كل شيء ، تم تحميل الآبار بالحمض النووي وكواشف الربط.احتضن الطبق لمدة أربع ساعات إلى بين عشية وضحاها عند 16 درجة مئوية. في صباح اليوم التالي. قم بإنهاء الربط عن طريق تعطيل T four Ligase عند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.كما كان من قبل ، قم بتنظيف تفاعل الربط باستخدام ألواح المسروقات الصغيرة ومشعب التفريغ لتجفيف اللوحة ثم مسح الجزء السفلي من اللوحة حتى يجف تماما. أعد تعليق الحمض النووي في 30 ميكرولتر من الماء المقطر المزدوج. ضعه على شاكر مداري لمدة دقيقتين ثم انقل محتويات لوحة المسروقات الصغيرة إلى طبق نظيف.بعد ذلك ، قم بإجراء عملية هضم ثانية للحمض النووي باستخدام bam H واحد لتدمير الينقولات الكونcat المتبقية. هضم الحمض النووي عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث إلى ست ساعات أو طوال الليل ، ثم يتم تنظيف الهضم باستخدام ألواح المسروقات الصغيرة باتباع نفس الإجراء كما كان من قبل. قم بإجراء 30 دورة PCR باستخدام برايمر خاص بالتبديل وبرايمر خاص بالرابط.يجب أن يحتوي التفاعل على ثلاثة ميكرولترات من الحمض النووي المهضوم مع الروابط. بعد ذلك ، قم بتنظيف تفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام غنائم صغيرة. 96 لوحة بئر ومشعب فراغ كما تم إجراؤه سابقا.أعد تعليق الحمض النووي في 30 ميكرولترا من الماء وانقل المعلقات إلى 96 نظيفة. استمر في اللعب بشكل جيد عن طريق تخفيف ميكرولترين من منتجات تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل إلى 148 ميكرولتر من الماء المقطر المزدوج باستخدام ميكرولترين فقط من المنتجات المخففة. قم بإجراء 30 دورة PCR باستخدام إصدارات متداخلة من الاشعال في 100 ميكرولتر من الحجم.هذه الاشعال مخصصة لآلة Illumina GA two X. ستحتوي كل عينة على رمز شريطي فريد مكون من 12 زوجا أساسيا من تشغيل تفاعل البوليميراز المتسلسل ، و 45 ميكرولترا من كل منتج على هلام بنسبة 1٪ مع بروميد AUM. يجب أن يكون هناك مسحة لمنتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل التي تمثل أمبليكونات للعديد من عمليات إدخال الينقولات المختلفة في الورم.استخدم طريقة الغسيل بالتفريغ الموضحة سابقا لتنظيف 50 ميكرولترا المتبقية من تفاعل البوليميراز المتسلسل ، ثم أعد تعليق الحمض النووي في 50 ميكرولترا من الماء وقم بإجراء الغسيل بالمكنسة الكهربائية مرة أخرى. الآن Resus ، قم بتعليق الحمض النووي في 30 ميكرولتر من TE ونقله إلى صفيحة نظيفة 96 جيدا. تحديد تركيز الحمض النووي في كل عينة.ثم اجمع كميات متساوية من الحمض النووي من كل عينة في أنبوب واحد. من الممكن تسلسل عدة مئات من عينات الحمض النووي في حارة واحدة من تشغيل Illumina طالما تم إنشاء كل عينة باستخدام برايمر باركود مميز باستخدام البروتوكول. يجب أن يؤدي L-M-P-C-R الناجح إلى تضخيم مئات التحويلات عند الإدخالات في ورم واحد بعد تشغيل نصف منتج PCR الثانوي على هلام بنسبة 1٪ ، وتمثل مسحة الحمض النووي هذا التضخيم.إذا لم ينجح LM PCR ، فسيكون هناك غياب لطاخة الحمض النووي. بدلا من ذلك ، سترى نطاقات نهائية من الحمض النووي تسلسل واحد إلى 200 ورم في حارة واحدة من منصة Illumina GA two X يجب أن تنتج أكثر من 30 مليون تسلسل من 100 زوج أساسي لكل منها أثناء محاولة هذا الإجراء. من المهم أن تتذكر العمل ببطء وحذر لضمان عدم حدوث تلوث بعد هذا الإجراء.يمكن إجراء تحليل الدوافع الجينية المكتشفة حديثا للسرطان من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل ، أي من هذه الدوافع يمكن استهدافها للعلاج؟

identification-sleeping-beauty-transposon-insertions-solid-tumors

Research

JoVE Journal

Medicine

الطب

يعد إثراء gDNA لتسلسل NGS أداة سهلة وقوية لدراسة الطفرات الدستورية. في هذه المقالة ، نقدم الإجراء لتحليل التسلسل الكامل ل 11 جينا مشاركا في إصلاح تلف الحمض النووي.

gDNA التخصيب من قبل القائم على تقنية Transposase لتحليل NGS من تسلسل كامل ل BRCA1، BRCA2، و 9 الجينات المسؤولة عن إصلاح الحمض النووي الأضرار

نصف هنا بروتوكولا فعالا ومتعدد الاستخدامات للحث على الأورام الأرومية الدبقية الجديدة (GBM) ومراقبتها وتحليلها باستخدام الحمض النووي للينقولات المحقون في بطينات الفئران حديثي الولادة. خلايا المنطقة تحت البطينية ، التي تمتص البلازميد ، تتحول وتتكاثر وتولد أورام ذات خصائص نسيجية مرضية ل GBM البشري.

ينقول ساطة دمج البلازميد الحمض النووي في المنطقة Subventricular من الفئران حديثي الولادة لتوليد نماذج جديدة من ورم أرومي دبقي

نقدم هنا، بروتوكول مفصلة لتحديد الأحداث جزئ المتجانسة التي وقعت في الخلايا الجذعية الجنينية الماوس باستخدام النشاف الجنوبية و/أو PCR. ويتجلى هذا الأسلوب توليد نونموسكلي الميوسين الثانية استبدال الوراثية الماوس النماذج باستخدام الجنينية يستند إلى الخلية الجذعية المتجانسة اقترانها بوساطة تستهدف التكنولوجيا التقليدية.

تحديد الأحداث جزئ مثلى في الخلايا الجذعية الجنينية الماوس باستخدام النشاف الجنوبي وتفاعل البوليميراز المتسلسل

نقدم هنا، بروتوكولا لتولد السرطان استنساخ الخلية التي تحتوي على علامة تسلسل MS2 في سوبتيلوميري واحد. ويمكن هذا النهج، الاعتماد على نظام MS2-التجارة والنقل، والتصور النصوص الذاتية من تيلوميريك التي تحتوي على تكرار "الحمض النووي الريبي" (TERRA) أعرب من telomere واحدة في الخلايا الحية.

جيل من سرطان الخلية استنساخ لتصور تيلوميريك التي تحتوي على تكرار الحمض النووي الريبي تيرا أعرب من Telomere واحدة في الخلايا الحية

توضح هذه المقالة طريقه للتعرف علي التعديلات النسيلي و subclonal بين العينات المختلفة من مريض معين. علي الرغم من ان التجارب الموصوفة هنا تركز علي نوع معين من الورم ، والنهج ينطبق علي نطاق واسع علي الأورام الصلبة الأخرى.

تحليل آلافات المقارنة من خلال نهج التسلسل المستهدف

توضح هذه المقالة اختبارًا بسيطًا يستند إلى PCR لمراقبة نشاط الرجعية LINE-1 النشطة ولرسم خريطة للتبديل الرجعي في جينوم معين. باستخدام خط الخلية MCF7، نبين هنا كيف يمكن تطبيق هذا الأسلوب للكشف عن نشاط LINE-1 الموجود في 22q12.1.

الكشف عن نشاط الرجعية من الخط الساخن-1S من قبل لمسافات طويلة معكوس PCR

هذا العمل المسبقة بروتوكول متقدم لتقييم دقيق تحميل الورم عن طريق الكشف عن البروتين الفلوري الأخضر وإشارات الإضاءة الحيوية، فضلا عن التكامل بين تقنية الكشف الجزيئي الكمي.

دراسة ثلاثية سلبية سرطان الثدي باستخدام نموذج سرطان الثدي Orthotopic

هنا نقدم بروتوكول لاختبار فعالية العلاجات المستهدفة المختارة على أساس التركيبة الجينومية للورم. ويصف البروتوكول تحديد وإعادة التحقق من إعادة ترتيب الحمض النووي الهيكلي، وgragraftment من أورام المرضى في الفئران واختبار الاستجابات للأدوية المقابلة.

اختبار العلاجات المستهدفة في السرطان باستخدام تحليل تعديل الحمض النووي الهيكلي وXenografts المستمدة من المريض

الليزر المجهري (LMD) هو تقنية حساسة وقابلة للاستنساخ للغاية التي يمكن استخدامها للكشف عن المسارات التي تتوسط عدم تجانس الورم الدبقي والغزو. هنا، نحن نصف بروتوكول الأمثل لعزل المناطق المنفصلة من أنسجة الورم الدبقي باستخدام الليزر LMD تليها تحليل النسخ.

الليزر التقاط Microdissection من المناطق دون الإقليمية ديوموما للتوصيف المكاني والجزيئي للتغاير داخل الورم، Oncostreams، والغزو

يعد استخدام نموذج الورم الأصلي المختص بالمناعة والمدفوع بطفرات المريض الشائعة للاختبار قبل السريري أمرا بالغ الأهمية لاختبارات العلاج المناعي. يصف هذا البروتوكول طريقة لتوليد نماذج فأر ورم في المخ باستخدام التوصيل القائم على التثقيب الكهربائي للحمض النووي البلازميد الذي يمثل طفرات المريض الشائعة ، وبالتالي توفير نموذج فأر دقيق وقابل للتكرار ومتسقة.

نمذجة أورام الدماغ في الجسم الحي باستخدام التوصيل القائم على التثقيب الكهربائي للحمض النووي البلازميد الذي يمثل توقيعات طفرة المريض

اكتشف طريقة تحديد الجينات المسرطنة والكابتة للأورام باستخدام إدراجات النقالة الجمال النائم في نموذج الفأر. تُمكّن هذه التقنية الباحثين من رسم خرائط التغيرات الجينية التي تدفع تكوين الأورام الصلبة.

تحديد

استكشف المزيد من الفيديوهات