تحديد الجمال النائم الإدراج ينقول في الأورام الصلبة باستخدام رابط بوساطة PCR

يوضح هذا الإجراء كيفية تحديد الجينات المسرطنة الجديدة والجينات المثبطة للورم عن طريق رسم خرائط التبديل عند عمليات الإدراج في الفأر التي تدفع تكوين الورم. يتم تحقيق ذلك عن طريق توليد الأورام وحصادها أولا من نموذج الفأر المعدلة وراثيا. تتمثل الخطوات التالية من الإجراء في عزل الحمض النووي للورم ، وإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل بوساطة الرابط ، ثم تسلسل عينات الحمض النووي المضخمة وتحليل التبديل عند الإدخال.

في النهاية ، يحدد الإجراء الجينات المرشحة لمحرك الورم. الميزة الرئيسية لاستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل بوساطة الرابط جنبا إلى جنب مع الفحص الجيني غير المتحيز باستخدام ينقولات الجمال النائم ، هي أنه يمكننا بسهولة تحديد الدوافع الجينية الجديدة للسرطان. ابدأ دائما في التشريح عن طريق رش الجزء الخارجي من الفأر المضحى به بنسبة 70٪ من الإيثانول.

يجب تقسيم الأنسجة والأورام المجمعة إلى أربعة أقسام ، يتراوح حجمها من 50 إلى 100 ملليغرام. قم بإصلاح قسم واحد في فورمين مخزن مؤقت بنسبة 10٪ لمدة 18 ساعة ، متبوعا بنسبة 70٪ من الإيثانول. يمكن استخدام هذا القسم لتلوين h و E و / أو الكيمياء المناعية.

قم بتجميد الأجزاء المتبقية في النيتروجين السائل. يمكن تخزينها في الفريزر واستخدامها في D-N-A-R-N-A وعزل البروتين لجمع الحمض النووي من عينة الورم المجمدة. أولا ، قم بفرم الأنسجة بشفرة حلاقة.

بعد ذلك ، هضم الأنسجة في أنبوب 1.5 مليلتر مع مليلتر واحد من المخزن المؤقت لتحلل الخلايا ، وخمسة ميكرولتر من 20 ملليغرام لكل مليلتر. يعمل محلول البروتياز K على دوامة الخليط جيدا والمضي قدما في استخراج الحمض النووي القياسي القائم على الأيزوبروبانول. ابدأ هذا البروتوكول عن طريق تلدين الروابط في أنبوب سعة 1.5 مل.

امزج 50 ميكرولترا من كل محلول رابط مع ميكرولترين من كلوريد الصوديوم المركز. ثم ضع الأنبوب في كتلة حرارية 95 درجة مئوية. بعد خمس دقائق ، أطفئي النار واتركيها تبرد ببطء إلى درجة حرارة الغرفة ، والتي قد تستغرق ساعة أو أكثر بعد التبريد.

يمكن تخزين الروابط الشرجية في الفريزر لحين الحاجة. قم بإعداد 2 96 لوحة بئر بواسطة علي نقلا عن ميكروغرام واحد من الحمض النووي من كل عينة في الآبار المقابلة في كلتا لوح الآبار البالغ عددها 96 لوحا. على سبيل المثال ، ضع ميكروغراما واحدا من الحمض النووي من عينة واحدة في البئر A واحدة من كلتا لوحي البئر.

سيتم هضم الحمض النووي الموجود في إحدى ألواح الآبار البالغ عددها 96 باستخدام إنزيم الجانب الأيمن NLA ثلاثة وهضم عينات الحمض النووي في لوحة 96 البئر الأخرى باستخدام إنزيم الجانب الأيسر BFA واحد. اسمح للحمض النووي بالهضم طوال الليل عند 37 درجة مئوية. في اليوم التالي ، قم بإنهاء عملية الهضم بالحرارة ، وتعطيل الإنزيمات لمدة 20 دقيقة.

الآن قم بتنظيف تفاعلات الهضم باستخدام لوح صغير من المسروقات 96. باستخدام الماصة متعددة القنوات، انقل كل عينة إلى المسروقات الصغيرة. 96 لوحة بئر.

ضع لوح البئر المسروق الصغير 96 في مشعب مفرغ. ضع مكنسة كهربائية على الطبق حتى تبدو الآبار جافة. عادة ، 15 دقيقة طوال هذا البروتوكول.

يجب توخي الحذر الشديد حتى لا تلوث عيناتك. عند العمل مع 96 ، تحافظ ألواح الآبار على الآبار مغطاة بأغطية قدر الإمكان وتتجنب تمرير الماصة فوق الآبار المفتوحة لأن أي قطرة من السائل غير المرغوب فيه يمكن أن تدمر العينة. قم بإزالة لوحة المسروقات الصغيرة من مشعب التفريغ وسد الجزء السفلي من اللوحة بمنشفة ورقية حتى يجف تماما.

أعد تعليق الحمض النووي في المسروقات الصغيرة. 96 لوحة بئر بإضافة 30 ميكرولترا من الماء المقطر المزدوج لكل منها. حسنا ، ضع لوحة المسروقات الصغيرة على شاكر مداري مضبوطة على درجة عالية لمدة دقيقتين.

بعد ذلك ، انقل محتويات لوحة المسروقات الصغيرة إلى لوحة نظيفة 96 بئر. لأداء تفاعلات ربط الرابط. قم بإعداد تفاعل الربط عن طريق خلط كمية كافية من المخزن المؤقت للربط ، وروابط راكبة من الخطوة 3.2 T أربعة DNA ligase والماء في خزان الكاشف.

استخدم ماصة متعددة القنوات لنقل 10 ميكرولترات من الحمض النووي المهضوم من الخطوة السابقة إلى لوحة بئر جديدة سعة 96. ثم استخدم ماصة متعددة القنوات إلى Eloqua 10 ميكرولتر من تفاعل الربط لجميع آبار لوحة البئر 96. بعد كل شيء ، تم تحميل الآبار بالحمض النووي وكواشف الربط.

احتضن الطبق لمدة أربع ساعات إلى بين عشية وضحاها عند 16 درجة مئوية. في صباح اليوم التالي. قم بإنهاء الربط عن طريق تعطيل T four Ligase عند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.

كما كان من قبل ، قم بتنظيف تفاعل الربط باستخدام ألواح المسروقات الصغيرة ومشعب التفريغ لتجفيف اللوحة ثم مسح الجزء السفلي من اللوحة حتى يجف تماما. أعد تعليق الحمض النووي في 30 ميكرولتر من الماء المقطر المزدوج. ضعه على شاكر مداري لمدة دقيقتين ثم انقل محتويات لوحة المسروقات الصغيرة إلى طبق نظيف.

بعد ذلك ، قم بإجراء عملية هضم ثانية للحمض النووي باستخدام bam H واحد لتدمير الينقولات الكونcat المتبقية. هضم الحمض النووي عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث إلى ست ساعات أو طوال الليل ، ثم يتم تنظيف الهضم باستخدام ألواح المسروقات الصغيرة باتباع نفس الإجراء كما كان من قبل. قم بإجراء 30 دورة PCR باستخدام برايمر خاص بالتبديل وبرايمر خاص بالرابط.

يجب أن يحتوي التفاعل على ثلاثة ميكرولترات من الحمض النووي المهضوم مع الروابط. بعد ذلك ، قم بتنظيف تفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام غنائم صغيرة. 96 لوحة بئر ومشعب فراغ كما تم إجراؤه سابقا.

أعد تعليق الحمض النووي في 30 ميكرولترا من الماء وانقل المعلقات إلى 96 نظيفة. استمر في اللعب بشكل جيد عن طريق تخفيف ميكرولترين من منتجات تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل إلى 148 ميكرولتر من الماء المقطر المزدوج باستخدام ميكرولترين فقط من المنتجات المخففة. قم بإجراء 30 دورة PCR باستخدام إصدارات متداخلة من الاشعال في 100 ميكرولتر من الحجم.

هذه الاشعال مخصصة لآلة Illumina GA two X. ستحتوي كل عينة على رمز شريطي فريد مكون من 12 زوجا أساسيا من تشغيل تفاعل البوليميراز المتسلسل ، و 45 ميكرولترا من كل منتج على هلام بنسبة 1٪ مع بروميد AUM. يجب أن يكون هناك مسحة لمنتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل التي تمثل أمبليكونات للعديد من عمليات إدخال الينقولات المختلفة في الورم.

استخدم طريقة الغسيل بالتفريغ الموضحة سابقا لتنظيف 50 ميكرولترا المتبقية من تفاعل البوليميراز المتسلسل ، ثم أعد تعليق الحمض النووي في 50 ميكرولترا من الماء وقم بإجراء الغسيل بالمكنسة الكهربائية مرة أخرى. الآن Resus ، قم بتعليق الحمض النووي في 30 ميكرولتر من TE ونقله إلى صفيحة نظيفة 96 جيدا. تحديد تركيز الحمض النووي في كل عينة.

ثم اجمع كميات متساوية من الحمض النووي من كل عينة في أنبوب واحد. من الممكن تسلسل عدة مئات من عينات الحمض النووي في حارة واحدة من تشغيل Illumina طالما تم إنشاء كل عينة باستخدام برايمر باركود مميز باستخدام البروتوكول. يجب أن يؤدي L-M-P-C-R الناجح إلى تضخيم مئات التحويلات عند الإدخالات في ورم واحد بعد تشغيل نصف منتج PCR الثانوي على هلام بنسبة 1٪ ، وتمثل مسحة الحمض النووي هذا التضخيم.

إذا لم ينجح LM PCR ، فسيكون هناك غياب لطاخة الحمض النووي. بدلا من ذلك ، سترى نطاقات نهائية من الحمض النووي تسلسل واحد إلى 200 ورم في حارة واحدة من منصة Illumina GA two X يجب أن تنتج أكثر من 30 مليون تسلسل من 100 زوج أساسي لكل منها أثناء محاولة هذا الإجراء. من المهم أن تتذكر العمل ببطء وحذر لضمان عدم حدوث تلوث بعد هذا الإجراء.

يمكن إجراء تحليل الدوافع الجينية المكتشفة حديثا للسرطان من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل ، أي من هذه الدوافع يمكن استهدافها للعلاج؟