على البروتين MultiBac مجمع منصة الإنتاج في EMBL

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنتاج مجمعات بروتينية باستخدام نظام خلايا حشرة فيروس الباولا متعدد الظهر. يتم تحقيق ذلك عن طريق إنشاء بنية متعددة الجينات أولا ، وترميز مركب البروتين المفضل. الخطوة الثانية هي صنع فيروس باولا مركب يحتوي على بنية متعددة الجينات عن طريق تحويل الخلايا البكتيرية وفحص منتصف الظهر الصحيح.

بعد ذلك ، قم بعزل الجينوم الفيروسي الباولا واستخدمه لإصابة الخلايا الحشرية على نطاق صغير في صفيحة من ستة آبار بعد اختبار إنتاج البروتين. يتم التعبير عن مركب البروتين المفضل على نطاق أوسع ويتم تنقيته. في النهاية ، يتم استخدام مركب البروتين المنقى لاكتشاف هيكله ووظيفته وربما لاكتشاف الأدوية.

المزايا الرئيسية لهذه التقنية على أنظمة فيروس الصدى الحالية ذات شقين. يمكن إنتاج مجمعات MultiPro بشكل غير مسبوق. أيضا ، المواد المنتجة ذات جودة أعلى بكثير لأننا نصمم فيروس الصدى لإنتاج البروتين الأمثل.

تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى ما هو أبعد من الأسئلة البيولوجية الأساسية. تم استخدام منصة الأكياس المتعددة الخاصة بنا بنجاح لإنتاج بروتينات واعدة للقاحات جديدة مرشحة لمجموعة متنوعة من الأمراض وتحفيز أبحاث السرطان من خلال إنتاج مجموعات البروتين الرئيسية التي تسبب نمو الورم. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة قليلا مع العمليات والحاجة إلى العقم.

لذلك عملنا بجد لوضع إجراءات تشغيل قياسية لجعل تطبيق البنوك المتعددة سهلا قدر الإمكان للمستخدمين غير المتخصصين. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية حيث يمكن فهم الخطوات الروبوتية بسهولة أكبر عند عرض العملية أثناء الحركة. لا يمكنك استخراج هذا بمجرد النظر إلى البروتوكولات التي يتم تدوينها بغض النظر عن مدى تفاصيلها.

قبل البدء في هذا الإجراء ، من المهم التخطيط بعناية لاستراتيجية التعبير المشترك. يوصى بمحاكاة التجربة أولا. في السيليكو.

يجب توزيع الجينات على البلازميدات المتقبلة والمانحة. ما يعمل بشكل أفضل هو تجميع الوحدات الفرعية التي قد تشكل وحدات فرعية فسيولوجية. نظرا لأن المجمعات الكبيرة تحتوي على العديد من الوحدات الفرعية للبروتين ، يجب التعبير عن العديد من الجينات في وقت واحد.

يبسط نظام الظهر المتعدد إلى حد كبير استنساخ الجينات باستخدام إجراءات آلية لوضع الجينات في جزيئات سلف الحمض النووي الصغيرة التي تحتوي على تسلسل DNA قصير يسمى أقفال P يتم التعرف عليه بواسطة إنزيم Cree recombinase. ثم يتم دمج هؤلاء الأسلاف في تفاعل خطوة واحدة عن طريق إضافة ما قبل إعادة التركيب ، والذي يربط كل ما يحتوي على موقع lox P في بلازميد DNA واحد كبير. يتم إدخال هذا البناء متعدد الجينات لاحقا في جينوم فيروس الحميضة الخلفية المتعددة.

إذا كان سيتم إنشاء عدد كبير من التركيبات ، يوصى باستخدام البرامج النصية الروبوتية ومحطة عمل مناولة السوائل. تم تجهيز محطة العمل بمكنسة كهربائية للتحضير المصغر وتنظيف PCR ، وجهاز EEL للتحميل التلقائي لعينات PCR. يخطو [ثرموكلير] ل [بكر] وحضانة [هكر] ل [ريسوس] يعلق خلايا وكتل باردة.

بالنسبة للإنزيمات ، يتم إدخال الجينات ذات الأهمية في المتبرعين والمتقبلين المختارين باستخدام إنزيمات التقييد والليگاز أو بدلا من ذلك ، باستخدام طرق مستقلة عن الربط ، التحقق من صحة جميع تركيبات المتبرعين والمستقبلين ، المستنسخة عن طريق رسم خرائط التقييد والتسلسل. تابع مجموعات متقبلات المتبرعين المنتشرة عن طريق إعادة تركيب CRE LAX P لإنشاء تركيبات التعبير متعدد الجينات المفضلة. يتم التحقق من صحة التركيبات متعددة الجينات المجمعة من خلال تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل التحليلية مع مجموعات مصممة خصيصا من الاشعال.

عرض لقطات لعملية TR بمساعدة الروبوت هنا. وهي تشمل تحضير تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل في ألواح متعددة الآبار ، وتوفير قالب الحمض النووي والبادئات ، وتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل للحمض النووي وإعداد تركيبات متعددة الجينات المزروعة في الثقافة البكتيرية عن طريق التحلل القلوي في ألواح متعددة الآبار. لبدء هذا الإجراء ، قم بدمج نواقل نقل الجينات المتعددة في الجينوم الفيروسي متعدد الشفتين عن طريق التحول إلى خلايا DH 10 ، مما يؤوي الجينوم الفيروسي والوظائف المطلوبة لتبديل TN السبعة.

بعد TN ، يتم اختيار سبع خلايا تبديل مع فيروس باولا مركب يحتوي على الجينات ذات الأهمية عن طريق فحص TN الأبيض الناجح ، ويؤدي التبديل الناجح إلى فقدان تكملة ألفا لبيتا جالاكتو. لذلك تظل المستعمرات ذات التبديل الصحيح ل TN سبعة بيضاء على APLs الانتقائية التي تحتوي على xal. تحضير المزارع البكتيرية من المستعمرات البيضاء وعزل الظهر عن طريق التحلل القلوي وترسيب إيثانول إيزوبروبانول.

بعد ذلك ، قم بعمل خلايا حشرية مشدة مع الجينوم الفيروسي باو المنقى الذي يعمل في قلنساط بذور غطاء معقم لخلايا الحشرات في مرحلة السجل SF 21 في صفيحة زراعة أنسجة بستة آبار. إلى كل منها ، أضف جيدا الجينوم الفيروسي باو المنقى وكاشف التعدي الممزوج في وسط الاستزراع. احتضان الخلايا المنقولة عند 27 درجة مئوية دون حركة لمدة 48 إلى 60 ساعة.

بعد 48 إلى 60 ساعة ، قم بحصاد الفيروس الأولي أو V صفر عن طريق إزالة الوسائط التي يتم تجديدها بوسائط جديدة وإعادة اللوحة إلى الحاضنة بعد يومين إلى ثلاثة أيام ، واختبر إنتاج البروتين. وفي حالة وجود علامة YFP ، اختبر التألق لتضخيم الفيروس. استخدم V صفر الفيروس الأولي لإصابة 25 إلى 50 ملليلتر من الخلايا في مرحلة السجل في قوارير شاكر إرلنماير صغيرة مضطربة على منصة مدارية.

شاكر بحساب الخلايا وتقسيم الخلايا كل 24 ساعة حتى تتوقف عن المضاعفة. اتبع تعدد منخفض من العدوى أو نظام وزارة الداخلية ، يجب أن تتضاعف الخلايا مرة واحدة على الأقل ، وإلا كرر التجربة بحجم أصغر من V صفر مضاف. تظهر الصورة الموجودة على اليسار خلايا حشرية غير مصابة بعد الإصابة بفيروس باولا متعدد الظهر.

توقفت الخلايا الحشرية المصابة عن التكاثر وزاد حجمها كما هو موضح في الصورة على اليمين. بعد 48 إلى 60 ساعة ، حصاد فيروس V واحد عن طريق تكوير الخلايا. قم بإزالة وتخزين الوسائط التي تحتوي على الفيروس.

Resus بتعليق الخلايا بوسائط جديدة ونقلها مرة أخرى إلى قارورة إرلينماير. قم بإزالة مرة واحدة في 10 إلى الخلايا الست كل 12 أو 24 ساعة عن طريق التكوير واختبار إنتاج البروتين وإشارة البروتين الواسماس إذا كانت أحجام التعبير الأكبر مطلوبة. قم بتضخيم الفيروس بشكل أكبر عن طريق إصابة ما يصل إلى 400 مل من الخلايا في قوارير شاكر سعة لترين بفيروس V واحد.

بعد نظام وزارة الداخلية المنخفض ، نوصي بشدة بتخزين فيروس V واحد كفيروس إنتاج باستخدام الخلايا الحشرية المصابة بالفيروسات أو طرق VIC لمنع تعديلات الفيروس المؤتلف والحفاظ على مستويات التعبير العالية. بعد 24 ساعة من توقف الانتشار لوحظ الخلايا المصابة بالحبيبات. في هذه المرحلة ، تحتوي الخلايا على جزيئات فيروسية كاملة قبل إطلاقها في الوسائط.

قم بإزالة الوسائط ، وأعد تعليق حبيبات الخلية في محلول التجميد ، وقم بتجميد BIIC في أنابيب التبريد لتشغيل إنتاج البروتين. استخدم V واحد V اثنين أو جزوات BIC المجمدة لإصابة مزارع الخلايا الكبيرة. عادة ما تلتزم 400 مل في قوارير سعة لترين بنظام وزارة الداخلية المنخفض.

ضبط حجم الفيروس المستخدم للعدوى بحيث تتضاعف الثقافة المصابة مرة واحدة على الأقل. في حالة وجود بروتين علامة YFP ، اسحب مرة واحدة في 10 إلى الخلايا الست على فترات محددة ، وصوتنة الطرد المركزي للخلايا ونقلها إلى 96 لوحة بئر قياس مستويات YFP في قارئ لوحة قياسي 96 جيدا قادر على تسجيل إشارات الفلورسنت تراقب تطور إشارة YFP حتى يتم الوصول إلى هضبة ، يشير إلى الحد الأقصى لإنتاج البروتين المؤتلف. يجب أن يتم تخزين خلايا الحصاد في هذه المرحلة ، وتخزين كريات الخلايا عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر على المدى القصير أو 80 درجة مئوية تحت الصفر للخلايا طويلة المدى بطريقة مصممة خصيصا لمتطلبات البروتين ثم العصارة الخلوية والنوى.

توجد البروتينات النووية المجزأة عادة في الحبيبات النووية. بينما تبقى البروتينات العصارية الخلوية في العصارة الخلوية. يتم تبسيط تنقية البروتين إلى حد كبير عن طريق التجزئة.

حيث يمكن إزالة الكثير من الملوثات في خطوة طرد مركزي واحدة. يمكن تنقية مجمعات البروتين بسهولة من مزارع الخلايا الأولية على نطاق صغير باستخدام طرق تنقية مصغرة مثل التنقية متعددة الآبار أو الأطراف الدقيقة. بالاقتران مع أنظمة الكروماتوغرافيا صغيرة الحجم مثل ACTA micro ، ستكون الخطوة المستقبلية هي تصغير ودمج الإعداد التجريبي بأكمله في تطبيق منضدي صغير متصل بمحطة عمل الاستنساخ.

يظهر هنا روبوت الدفعات الدقيقة قيد التطوير حاليا ، والذي سيتم استخدامه لهذا الغرض. يتم تحقيق التعبير المشترك القوي للبروتينات غير المتجانسة من خلال نظام الظهر المتعدد كما هو موضح هنا. يمكن تمييز حظر البروتين المفرط في التعبير عنه بوضوح في مستخلص الخلية بأكمله ، WCE والمحللة التي تم تطهيرها.

تكون جودة وكمية مادة البروتين المنتجة كافية. قم بتمكين التحديد المنظم لمجمعات البروتين مثل مركب نقطة التفتيش الانقسامية MCC الموضح في هذا الرسم التخطيطي. غالبا ما يكون عائد عمليات التنقية التحليلية هذه كافيا لتحليل بنية ووظيفة المركب المنقى بمجموعة متنوعة من الوسائل ، بما في ذلك المجهر الإلكتروني.

تسمح إجراءات التشغيل القياسية التي طورناها للمستخدمين غير المتخصصين بتطبيق نهجنا بسهولة ويمكن استخدام تقنيتنا في العديد من المختبرات المهتمة بمجمعات البروتين الكبيرة ، تماما كما هو الحال اليوم بالنسبة للبروتين الصغير في نيكولا. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام الأكياس المتعددة من أجل إنتاج مجمعات البروتين الخاصة بك ذات الأهمية بكمية ونوعية لا مثيل لها لأهدافك البحثية الطموحة. لا يتطلب العمل مع أنظمتنا ظروف أمان خاصة.

ومع ذلك ، ضع في اعتبارك أن الفيروس سوف يصيبك إذا كنت قذرا ، على الرغم من أنه لن يتكاثر في خلاياك. ولذلك, بعناية التعامل مع شروط الستيرويد الخاصة بك أمر لا بد منه أثناء تنفيذ هذا الإجراء. أصبحت طريقتنا شائعة جدا بالفعل أكثر من 600 مختبر في جميع أنحاء العالم.

استخدم تقنيتنا. نعتقد أنه في المستقبل ، ستصبح طريقتنا جزءا لا يتجزأ من جهود الجينوم الهيكلي واسعة النطاق التي تعالج منطقة المعقدة البشرية. قد يساعد هذا في الكشف عن أساس الأمراض وعلى المدى الطويل يؤدي إلى أدوية وعلاجات جديدة وأفضل.