باستخدام التصوير المقطعي عالي الدقة لتصور البنية الثلاثية وظيفة الأوعية الدموية النباتية

الهدف العام من هذا الإجراء هو استخدام تقنية التصوير المقطعي الدقيق بالأشعة السينية القائمة على السنكروترون لاستكشاف بنية ووظيفة نقل الأوعية الدموية في النباتات. يتم تحقيق ذلك عن طريق إعداد العينات أولا للتركيب في حامل ظرف أو حامل النبات الحي ، مما يضمن أن الجزء المراد مسحه ضوئيا عموديا قدر الإمكان وأخذ القياسات الفسيولوجية الأولية اللازمة. الخطوة الثانية هي وضع العينات المحضرة أو النباتات الحية في قفص A LS Beamline 8.3 0.2 ، وتأمين القفص للمسح الضوئي. مقبل.

بعد تحديد الموقع المناسب للعينة ، يبدأ الفحص. تتمثل الخطوة الأخيرة في استخدام أجهزة كمبيوتر محطة العمل لتطبيع جودة الفحص وإعادة بنائها وتقييمها قبل تمرير البيانات إلى VISO لعملية التصور ثلاثي الأبعاد. في النهاية ، يتم استخدام التصوير المقطعي الدقيق بالأشعة السينية للكشف عن تفاصيل دقيقة عن الترابط والحالة الوظيفية للأوعية الدموية الموصلة للمياه في النباتات.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل التقسيم التسلسلي والفحص المجهري الضوئي ، هي أنه يمكن استكشاف الأنسجة النباتية في أي اتجاه بدقة غير مسبوقة. يمكن أن تساعدنا هذه الطريقة في فهم الأسئلة الرئيسية في مجال بيولوجيا النبات ، من الجوانب الأساسية لنقل المياه في النباتات إلى الجفاف ، وتحمل التجميد إلى كيفية تحرك مسببات الأمراض بشكل منهجي في النباتات المضيفة. تم تصميم هذا البروتوكول كما هو موضح للعمل في مصدر الضوء المتقدم.

8.3 0.2. قد تكون هناك حاجة إلى تكيفات خط الشعاع للعمل في مرافق السنكروترون الأخرى. تأكد من اتباع التدريب على السلامة والإشعاع المطلوب لاستخدام هذه المرافق لبدء إعداد العينات للنباتات الحية.

أولا بزراعة النباتات في أواني قطرها حوالي 10 سم ، مما يضمن أن الجذع الرئيسي أو أي جزء آخر من النبات المراد مسحه ضوئيا في المنتصف قدر الإمكان وموجه عموديا في الوعاء. تحد الأبعاد المادية لأداة HRCT Hutch من ارتفاع النباتات الحية إلى حوالي متر واحد. نتيجة لذلك ، من الأفضل إجراء تصوير النباتات الحية على الشتلات أو الشتلات.

تزرع في أواني صغيرة ، وتستخدم حامل وعاء من الألومنيوم الصلب المصنوع خصيصا لتركيب النباتات المحفوظة بوعاء حي. يجب تعديل ارتفاع اللوحة العلوية لاستيعاب مجموعة من ارتفاعات الوعاء. هنا ، تم تصميم الجزء العلوي من اللوحة ليتماشى مع الجزء العلوي من سطح التربة ويبرز النبات من وسط اللوحة المكونة من جزأين.

بمجرد تركيبه في الحامل ، قم بقياس إمكانات مياه الساق باستخدام غرفة ضغط على غرار SHO أو معلمة ورقة مشبك لتحديد الحالة الفسيولوجية للنبات قبل المسح. قم بلف قطعة صغيرة من الأسلاك النحاسية حول الجذع لتكون بمثابة مؤتمن لضمان موقع مسح متسق للنباتات التي سيتم مسحها ضوئيا بشكل متكرر. الآن ، ضع أسطوانة أكريليك رقيقة الجدران فوق النبات أعلى حامل مصنع الألمنيوم وثبتها في مكانها بمسامير لتثبيت العينة.

يجب استخدام مناشف ورقية بلاستيكية إضافية وشريط لاصق لتقليل اهتزاز وحركة أجزاء النبات ، مما قد يتسبب في تشوهات الصورة. قم بتوصيل حامل الوعاء المخصص بمرحلة تحمل الهواء وقم بتثبيته في مكانه بين مصدر الأشعة السينية ومستشعر التصوير ومعدات الكاميرا. تأكد من وضع الجذع عموديا قدر الإمكان وتوسيط العينة على قاعدة الظرف المغناطيسي لضمان بقائها في مجال الرؤية أثناء الدوران ، يمكن مسح المواد النباتية الطازجة ، عادة السيقان أو الأليفة ، بعد إزالتها الفورية من نبات حي.

إذا كان الغرض من التجربة هو تصور شبكة نسيج الخشب بأكملها ، فيجب أولا إخلاء المياه داخل الأوعية واستبدالها بالهواء. للقيام بذلك ، قم بتركيب العينة في غرفة ضغط على غرار التشهير وادفع الهواء المضغوط أو النيتروجين عبر العينة عند ضغط منخفض لمدة خمس دقائق تقريبا. ستختلف الأنواع في الوقت اللازم لإخلاء شبكة السفن.

إذا كان القصد هو تقييم مدى تكوين الانسداد في الأنسجة النباتية الطازجة ، فقم باستئصال العينات من النبات باستخدام شفرة حلاقة جديدة تجعل الجروح تحت الماء. بعد ذلك ، لف العينة بطبقة من الطفيلي لمنع الجفاف أثناء المسح ، قم بتركيب العينة في ظرف حفر مثبت على صفيحة معدنية مثبتة في مركز مرحلة محمل الهواء ، وقم بتوجيه العينة عموديا كما هو موضح سابقا لضمان بقاء العينة في مجال الرؤية. لتحضير عينات من الأنسجة الخشبية المجففة ، ابدأ بقطع العينات إلى حوالي ستة سنتيمترات في الطول.

حدد العينات المستقيمة قدر الإمكان في منطقة المسح المستهدفة ويبلغ قطرها حوالي سنتيمتر واحد. الخطوة التالية هي تجفيف العينة بأكملها ببطء لضمان التصور الأمثل لعينة الأنسجة وتباين الصورة. ضع عينة الأنسجة الخشبية في فرن تجفيف على درجة حرارة منخفضة لتجفيف العينة ببطء دون التسبب في أي تشقق أو انقسام للأنسجة.

في بعض الحالات، قد يكون من المستحسن إرفاق علامة ائتمانية بالعينة. هذا يضمن أن التشريح والتصور اللاحق باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح يمكن توجيهه إلى نقاط محددة في صورة HRCT. للقيام بذلك ، قم بلصق حبة معدنية أو زجاجية أو سلكا على السطح الخارجي للجذع باستخدام العطر.

أخيرا ، قم بتركيب العينة في فحص الحفر وتوسيطها كما هو موضح أعلاه قبل المسح. حدد التكبير الذي سيعمل بشكل أفضل مع تطبيقك. يتمتع A LS Beamline 8.3 0.2 المستخدم هنا بالقدرة على المسح الضوئي باستخدام العدسات ذات التكبير اثنين × خمسة x و 10 x.

اضبط طاقة الأشعة السينية على 15 كيلو إلكترون فولت. تعتمد أوقات التعرض بشكل عام على سمك العينة وكثافتها وتتراوح من 100 إلى 1000 مللي ثانية. اختر زيادة زاوية مناسبة لتطبيقك.

يتم تدوير العينات بزاوية 180 درجة أثناء المسح الضوئي ، ويمكن أن يكون لعدد الصور الملتقطة أثناء الدوران تأثير كبير على حجم مجموعة البيانات وطول الفاصل الزمني للمسح وجودة الصورة النهائية. يتم إجراء عمليات المسح النموذجية بزيادات قدرها 0.25 درجة ، مما ينتج عنه 513 صورة لكل مسح. يمكن تحقيق فترات مسح أقصر باستخدام إعداد التصوير المقطعي المستمر الذي تدور خلاله العينة باستمرار أثناء التقاط الصور لكل مسح ضوئي ، ويجب أيضا جمع صور Brightfield و darkfield.

صور Brightfield هي صور بدون العينة في الحزمة. غالبا ما يتم جمعها قبل وبعد فحص العينة عن طريق ترجمة العينة أفقيا. يتم جمع الحقول المظلمة عن طريق إغلاق مصراع الأشعة السينية.

يقيس هذا مقدار الإشارة التي تعرضها الكاميرا بدون أشعة سينية. بمجرد اكتمال الفحص ، انقل صور TIFF ثنائية الأبعاد الأولية من كمبيوتر الاقتناء إلى خادم الملفات ثم قم بالتصدير إلى جهاز كمبيوتر لاستخدامها في معالجة البيانات. بعد ذلك ، يجب تحويل الصور إلى مقياس نقل بالنسبة المئوية.

يحتوي Beamline 8.3 0.2 على مكون إضافي مخصص لتطبيع الخلفية يمكن تنزيله واستخدامه مع حزم البرامج المتاحة مجانا. تقوم الصورة J أو Fiji بتحميل الصور الطبيعية في حزمة برامج الأخطبوط، ثم إعادة بناء مجموعة بيانات ثلاثية الأبعاد من ملفات صور TIFF الأولية ثنائية الأبعاد باستخدام خطوات المعالجة المحددة. بعد ذلك ، يمكن تصور مجموعة الصور في واحدة من مجموعة متنوعة من حزم البرامج.

هنا يتم استخدام حزمة برامج aviso ، وتحميل مجموعات البيانات في ذاكرة النظام وعرض العينة في اتجاهات الشريحة المستعرضة أو الطولية أو الشعاعية الافتراضية نظرا للسمات ثلاثية الأبعاد لمجموعة البيانات ، يمكن تدوير الشرائح الافتراضية من خلال العينة في أي مستوى لتتماشى مع مناطق الاهتمام. بمجرد الانتهاء من التجزئة ، من الممكن تحديد هياكل النبات المستهدفة أو التغييرات الوظيفية في الحجم أو الطول أو العرض أو الوجود أو عدم وجود الماء أو الهواء وما إلى ذلك. تم تنفيذ فحوصات السنكروترون HRCT بنجاح على مجموعة متنوعة من الأنسجة والأنواع النباتية باستخدام Beamline 8.3 0.2 ، وقدمت رؤى جديدة حول بنية ووظيفة نسيج الخشب النباتي بدقة غير مسبوقة في 3D.

تسمح قدرات التصور والاستكشاف التي توفرها عمليات إعادة البناء ثلاثية الأبعاد كما هو موضح هنا بالتحديد الدقيق لموقع واتجاه الهياكل باستخدام شبكات Xylem على كل من عينات المكوس وفي النباتات الحية. هنا نرى إعادة بناء ثلاثية الأبعاد لجذع الخشب الأحمر المعرض لإجهاد الجفاف وإظهار كل من القصبات الهوائية والمياه بمجرد إتقانها ، يمكن تنفيذ هذه التقنية في دقائق إذا تم إجراؤها بشكل صحيح باتباع هذا الإجراء. يمكن استخدام طرق أخرى مثل الفحص المجهري الإلكتروني للتحقق من صحة الهياكل التي نراها داخل النباتات والتوصل إلى عتبات الحجم ، والتي يتم إدخالها بعد ذلك في برامج المعالجة التي نستخدمها لتحليل البيانات.