قياس الخواص الميكانيكية للالكنان السكري غشائي مع مجهر القوة الذرية

الهدف العام من التجربة التالية هو قياس الخواص الميكانيكية للجليكوكليكس البطاني باستخدام مجهر القوة الذرية أو FM. يتم تحقيق ذلك من خلال الزراعة الأولى ، وهي طبقة أحادية من الخلايا البطانية تحت تدفق فسيولوجي في مفاعل حيوي من أجل بناء طبقة الجليكوكاليكس كخطوة ثانية. يتم إرفاق حبات بحجم ميكرون بناتئ FM وتستخدم كمسبار لقياس القوة المقاومة لجسم الخلية والجليكوكاليكس أثناء المسافة البادئة. بعد ذلك ، تتناسب منحنيات المسافة البادئة مع نموذج من طبقتين من أجل تحديد معامل الجليكوكاليكس ويتم الحصول على نتائج السماكة التي توضح أن الجليكوكاليكس البطاني له معامل 0.7 كيلو باسكال وسمك 380 نانومتر بناء على تحليل الطبقتين.

مرحبا ، أنا ريك وا ، أنا رئيس قسم الهندسة الطبية الحيوية في جامعة روتشستر. كان هناك الكثير من النقاش في السنوات الأخيرة حول الدور المحتمل للجليكوكاليكس البطاني في الالتهاب ، لا سيما فيما يتعلق بما إذا كان قد يعمل كحاجز وقائي لمنع التصاق الخلايا غير المرغوب فيها أثناء الالتهاب. أحد مفاتيح حل الأسئلة التي تحيط بهذه المشكلة هو القدرة على قياس الخصائص الفيزيائية ، أي سمك وصلابة هذه الطبقة ، سواء في الظروف العادية أو أثناء الاستجابة الالتهابية.

أنا جراهام مارش. أنا طالب دراسات عليا في قسم الهندسة الطبية الحيوية بجامعة روتشستر. المشكلة الكبيرة في توصيف الجليكوكاليكس البطاني هي أنها ناعمة بشكل لا يصدق.

النهج الذي توصلنا إليه هو لصق حبة كبيرة على طرف ناتئ A و A FM بحيث تكون القوى المقاسة قابلة للحل مع A FM.To بدء هذا الإجراء ، وبناء غرفة تدفق مثل تلك الموضحة هنا ، قادرة على زراعة الخلايا تحت ضغط قص يبلغ 1.0 باسكال. قم بإعداد غرفة التدفق للتجربة عن طريق تنظيف الشرائح الزجاجية أولا في محلول سمكة البيرانا لمدة 15 دقيقة. شطفها ثلاث مرات بالماء المقطر وتجفيفها على حرارة 70 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.

بعد ذلك ، قم بتغطية الشرائح ب amino propyl trixi أو cy lane أو apte عن طريق ترسيب البخار. أضف ملليلتر واحد من apte إلى قارورة متصلة بغرفة التفريغ مع العينة. ثم قم بتغطية القارورة واسحب فراغا 0.7 بار لمدة ساعة واحدة.

خلال هذا الوقت ، قم بتحديث المكنسة الكهربائية ثلاث مرات. بعد ذلك ، قم بقص حشية غرفة تدفق جديدة من لوح سيليكون بسمك 0.4 ملم باستخدام أداة قطع SD ذات صورة ظلية. يبلغ عرض القناة 6.4 ملم وطولها 19 ملم ، ويتم قطع القطر الخارجي إلى 35 ملم حتى تتناسب مع طبق ثقافة اللجوء.

باستخدام هذه الأبعاد ، احسب معدل التدفق اللازم لتوليد إجهاد مطلق يبلغ باسكال واحد بالمعادلة الموضحة هنا. يمثل Q معدل التدفق. تاو هو الإجهاد المطلق.

مو هي لزوجة الوسط. H هو ارتفاع القناة ، و W هو عرض غرفة التدفق. الخطوة التالية هي محاذاة القطعة العلوية من غرفة التدفق مع الحشية الموجودة في طبق زراعة الخلية وتثبيتها بحلقة مغناطيسية.

قم بتوصيل منافذ التدفق في طبق زراعة الخلايا بثلاثة صمامات موجية بخطوط إلى المحاقن سعة 30 ملليلترا. ثم قم بتعقيم المجموعة بأكملها عن طريق الشطف بكحول الأيزوبروبيل لمدة خمس دقائق. ثم قم بإزالة الكحول واتركه يجف في الهواء في الأنسجة.

غطاء المزرعة Prewarm 4٪ مصل عجل الجنين في متوسط McCoy إلى 37 درجة مئوية. بعد تركه ليجف لمدة خمس إلى 10 دقائق ، تخلص من الكحول المتبقي مع 30 مل من مصل ربلة الساق الجنينية الدافئة. ثم املأ المحاقن ب 20 مل من وسط النمو veek MCDB 1 31.

بعد ذلك ، قم بتغطية المحاقن لمنع التلوث. عند نقل النظام من غطاء المحرك المعقم ، قم بتركيب غطاء خزان الصيد بالإبرة التي تصل إلى السائل لسحب الوسط مرة أخرى إلى خزان المنبع. أخيرا ، قم بإرفاق مرشحات معقمة 0.2 ميكرون بمداخل الهواء على الأغطية بعد حصاد الوريد السري البشري.

نمت الخلايا البطانية إلى التقاء في قارورة T 25. أعد تعليق الخلايا المحببة عند 100 ، 000 خلية لكل مليلتر في الوسط واسحب المحلول إلى حقنة. ثم قم بحقن التعليق في غرفة التدفق من خلال الصمام ثلاثي الاتجاهات.

اسمح للخلايا بالاستقرار والالتصاق بالركيزة الزجاجية لمدة ساعتين. قبل بدء التدفق ، انقل المفاعل الحيوي والخلايا إلى حاضنة حيث يسمح للخلايا بالاستقرار والالتصاق لمدة ساعتين. يمر الأنبوب الذي يربط الخزانات بمضخة تمعجية عبر الجزء الخلفي من الحاضنة بمجرد أن تلتصق الخلايا ، اضبط المضخة التمعجية على معدل التدفق المطلوب.

تتحرك الوسائط بين الخزانات ، مما يخلق رأس ضغط وتدفقا عبر المفاعل الحيوي الذي ينتج إجهاد قص الجدار بمقدار باسكال واحد. اسمح للخلايا بالتحتضن بتدفق مستمر عند 37 درجة مئوية لمدة يوم إلى خمسة أيام حتى تتماسك الغرفة. لبدء تحضير الكابولي ، نظف طرفا بالإضافة إلى ناتئ FM في حمض النيتريك لمدة خمس دقائق ، متبوعا بشطفه بالماء المقطر.

بمجرد أن يجف ، قم بتشغيل الكابول باستخدام apdi في غرفة ترسيب البخار كما هو موضح سابقا للشرائح الزجاجية. ثم قم بإعداد محلول خمسة ملليغرام لكل مليلتر بالوزن NHS Sulf O lc ، البيوتين في محلول الملح المخزن في هانك. اغمر الكابولي في المحلول لمدة 15 دقيقة.

يرافق هذا التفاعل CY وأكسيد الهيدروكسي النهائي ويقدم جزيئات البيوتين على سطح الكاتيليفر. في اليوم السابق ، ابدأ في تحضير محلول من الوسط الخالي من البيوتين عن طريق الجمع بين 20 مل من وسط ثقافة vexcel الذي يحتوي على 20٪ مصل مع 200 ميكرولتر من الخرز المطلي ب STREPT ENC ، واحتضانه لمدة 12 ساعة أثناء الدوران. في يوم التجربة.

اسحب الخرزات المغناطيسية إلى أسفل الأنبوب بمغناطيس لمدة دقيقتين وانقل المادة الطافية التي تحتوي على وسط خال من البيوتين إلى أنبوب جديد. عقم الوسائط عن طريق تمريرها عبر مرشح 0.22 ميكرومتر ووضعها في أنبوب جديد. الخطوة التالية هي إزالة غرفة التدفق من طبق زراعة الخلية ثم غسل الخلايا ثلاث مرات بملليلترين من 37 درجة مئوية ، وسط خال من البيوتين.

ثم أضف ميكروغراما واحدا بقطر 2.4 ميكرومتر ، وخرزات عدن المطلية بها. أضف تركيزا قدره 10 ميكروغرام لكل مليلتر إلى طبق زراعة الخلايا واخلطه برفق. بعد ذلك ، قم بمعايرة A FM tib عن طريق ربطه بحبة شريطية والضغط عليها في سطح زجاجي عادي.

من أجل تحقيق هذا الهبوط ، قم بسحب الطرف الموجود على السطح الزجاجي بجوار الخرزة ، ثم ضع قمة الكابولي فوق الخرزة واضغط لأسفل لعدة ثوان. أخيرا ، استخدم الكابولي المعاير لوضع مسافة بادئة للعينات. توفر الخرزات 2.4 ميكرومتر مساحة تلامس أكبر مع سطح الخلية بحيث يمكن اكتشاف الخصائص الميكانيكية لطبقة الجليكوكاليكس الناعمة بسهولة أكبر.

لتحقيق هذا الموضع ، استخدم الكابولي فوق خلية بالقرب من نواة الخلية نهجا ناعما للطرف على الخلية لضبط ارتفاع الكابولي على بعد ثلاثة ميكرومتر تقريبا فوق سطح الخلية. ثم قم بوضع مسافة بادئة للسطح 20 مرة بمعدل ميكرومتر واحد في الثانية إلى قوة قصوى تبلغ سبعة. يسمح نانو نيوتن بمرور ست ثوان من الوقت بين جهات الاتصال المتتالية.

احسب سمك طبقة الجليكوكاليكس باستخدام المعادلات المتعلقة بنظرية الهرتز. يتم وصف قوة المسافة البادئة F بهذه المعادلة حيث دلتا هي عمق المسافة البادئة. R هو نصف قطر الكرة ، و estar هو المعامل المشترك للمواد تحت الضغط.

من أجل فصل معامل المرونة المدمج estar إلى مكونات خلوية وجليكوكاليكس ، تعامل مع طبقة الجليكوكاليكس كطبقة ناعمة موحدة ورقيقة على سطح جسم الخلية واستخدم نموذج الطبقتين من كليفورد C.In هذه المعادلة ، يتم تحديد PQ و N تجريبيا من نوبات البوليمر. M هو ثابت من نموذج البوليمر ، و Z مرتبط بسماكة الطبقة الرقيقة أو طبقة الجليكوكاليكس بالمعادلة الموضحة هنا. تبدأ القوة المقاسة بواسطة A FM المقاسة بالنانو نيوتن في الزيادة بعد ملامسة السطح ويهيمن عليها في البداية مكون طبقة الجليكوكاليكس.

بمجرد ضغط طبقة الجليكوكاليكس ، يصبح جسم الخلية المكون الرئيسي للتشوه. تم حساب خط ملاءمة الطبقة الأزرق من طبقتين عن طريق تركيب أربع معلمات حرة لجعله يتطابق مع بيانات المسافة البادئة الموضحة باللون الأحمر من المعادلة المستخدمة معامل الخلية ، ويمكن تحديد معامل الجليكوكاليكس ومعامل الطبقة ، وسمك طبقة الجليكوكاليكس. تم تجميع الخصائص من 25 خلية في الرسم البياني الموضح هنا.

تم تحديد متوسط معامل طبقة الجليكوكاليكس ليكون 0.7 زائد أو ناقص 0.5 كيبا كالوري ، وتم تحديد سمك طبقة الجليكوكاليكس ليكون 380 زائد أو ناقص 50 نانومتر. يمنحنا هذا النهج الأداة التي نحتاجها للإجابة على الأسئلة الأساسية حول دور الجليكوكاليكس في تنظيم التصاق الخلايا أثناء الالتهاب. نحن الآن قادرون على الإجابة على أسئلة حول كيفية تغيير خصائص الجليكوكاليكس أثناء الالتهاب.

بأي وسيلة يتم تحقيق هذه التغييرات. يمكن توسيع هذا النهج بعدة طرق. على سبيل المثال ، يمكن للمرء استخدامه لاختبار أوصاف نظرية جديدة وأكثر تعقيدا لخصائص الجليكوكاليكس.

أو على مستوى عملي أكثر ، قد يكون المرء قادرا على استخدام هذا لاختبار الطلاءات السطحية المستوحاة من الحيوية ، المصممة لحماية الأجهزة القابلة للزرع من الاستجابة المناعية في المضيف. شكرا جزيلا على اهتمامك بعملنا.