عن طريق اللمس تكييف وتحليل حركة استراتيجيات أخذ العينات Antennal في نحل العسل ( أبيس mellifera L.)
December 12th, 2012
في هذا البروتوكول نعرض كيفية تسخير حالة نحل العسل للمؤثرات عن طريق اللمس وإدخال تقنية التقاط الحركة 2D لتحليل الكينماتيكا الجميلة على نطاق ونمط أخذ العينات antennal.
تتمثل الأهداف العامة لهذا الإجراء في إظهار كيفية تكييف نحل العسل بالمحفزات اللمسية ، وإدخال تقنية التقاط الحركة ثنائية الأبعاد لتحليل حركية المقياس الدقيق و 10 أنماط أخذ العينات. في البداية ، يتطلب الإجراء التقاط النحل الطائر الحر أمام خليتهم. الخطوة الثانية هي تسخير النحل في أنابيب معدنية وسد عيونهم بالطلاء الأبيض.
بعد ذلك ، يتم تدريب النحل على التحفيز اللمسي باستخدام إجراء التكييف الكلاسيكي. الخطوة الأخيرة هي تسجيل حركة الهوائي للنحلة المكيفة بكاميرا فيديو رقمية. في النهاية ، يتم استخدام التقاط الحركة ثنائية الأبعاد في MATLAB لتحليل التغيرات في سلوك حركة الهوائي في نحل العسل بعد نماذج التعلم اللمسي الترابطية وغير الترابطية.
يمكن استخدام هذه الطريقة لدراسة التمييز اللمسي والإدراك في مختلف الأنواع القابلة للتغيير. يمكن أن يميز التغييرات الناتجة عن التعلم اللمسي غير الترابطي عن التغييرات التي تحدث من التعلم الترابطي كما هو الحال أثناء التكييف. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأنه يجب التعامل مع النحل بعناية فائقة وتوقيت إجراء التكييف اللمسي أمر بالغ الأهمية.
يمكن أن تساعد الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال استشعار اللمس النشط. يستخدم سلوكا انعكاسيا طبيعيا كسلوك إبلاغ ، مما يسمح لنا بمعرفة ما إذا كان بإمكان التمييز بين محفزين لمسيين أم لا. للبدء في جمع النحل مباشرة من مدخل الخلية.
التقط كل نحلة في قارورة زجاجية مغلقة بسدادة رغوية ، واصطحبها على الفور إلى المختبر لمزيد من التعامل معها في المختبر. لفترة وجيزة ، قم بتبريد النحل في ثلاجة أربع درجات مئوية حتى يبدأ في إظهار علامات الجمود. أولا ، شل حركة كل نحلة على أنبوب معدني.
ضع شريطا لاصقا حول الرأس والصدر وفوق البطن. تأكد من أن البروبوس والهوائيات متحركة بحرية لحجب رؤية النحلة. قم بطلاء عيون المركب وسيلي بالطلاء الأبيض.
ضع قطرة صغيرة من الشمع المذاب بين الرأس والشريط لمنع الرأس من الحركة. أثناء التسجيلات. لتسهيل التعرف عليه ، ضع علامة على شريط كل نحلة عسل برقم وضع الأنبوب في جو رطب لمنع الجفاف.
أخيرا ، استخدم حقنة مملوءة بمحلول 30٪ من السكروز لإطعام كل نحلة لمدة خمس ثوان واتركها تتعافى لمدة 30 دقيقة. قبل البدء في بروتوكول التكييف اللمسي ، قبل التكييف ، اختبر كل B لاستجابة تمديد PSIS أو PER. للقيام بذلك ، قم بتطبيق محفز السكروز بنسبة 30٪ على الهوائيات للحصول على استجابة صحيحة.
يجب أن يعبر طرف psis خطا افتراضيا بين الفك السفلي المفتوح. يتم استخدام النحل فقط مع PER الصحيح للدراسة. للتكييف اللمسي ، يتم استخدام هياكل الأسطح المعدنية كمحفز مشروط أو cs.
يمكن أن يكون سطحها أملسا أو محززا لإنشاء نسيج مختلف. الحافز غير المشروط أو الولايات المتحدة هو محلول سكروز بنسبة 30٪. ضع المكعب النحاسي في حامل على مناور صغير.
سيسمح ذلك بتحديد المواقع بدقة أثناء إجراء التكييف. بمجرد تركيب المنبه اللمسي ، ضع نحلة أمام المناور الدقيق. بعد ذلك ، ضع Cs ببطء بحيث يكون سطح المنبه اللمسي موازيا لرأس النحلة.
يجب أن تكون النحلة قادرة على مسح المنبه اللمسي في وضع مريح باستخدام كل من الهوائي. لبدء إجراء التكييف ، اسمح للحبة بمسح المنبه اللمسي لمدة خمس ثوان. بعد الثواني الثلاث الأولى ، استخدم حقنة لتقديم قطرة من محلول السكروز بنسبة 30٪ تحت الخراب.
استخدم طرف المحقنة لرفع البروبوس برفق. يجب أن يثير هذا التحفيز PER غير المشروط. اسمح للنحلة بلعق السكروز.
مكافأة لمدة ثانية واحدة. استمر في إجراء التكييف حتى تتلقى النحلة خمسة أزواج بعد أول أزواج بمكافأة ، يجب أن يبدأ النحل في الاستجابة لعرض CS التقديمي من خلال تمديد PSIS الخاص بهم مما يشير إلى أنهم يتوقعون المكافأة القادمة.
يتم تسجيل PSIS الممتد بالكامل في أي وقت خلال الثواني الثلاث الأولى من عرض التحفيز اللمسي قبل عرض السكروز كاستجابة إيجابية. أخيرا ، يتم إنشاء منحنى تعليمي لمجموعة من النحل. لهذا ، يتم رسم النسبة المئوية للنحل الذي يظهر PER أثناء عرض CS لكل تجربة.
بعد التكييف ، يتم استخدام كاميرا فيديو رقمية بعدسة ماكرو مناسبة لتسجيل حركات الهوائي. هنا نستخدم كاميرا Basler 602 F ، ومجهزة بعدسة VZM 200 ذات المواصفات الفنية تعمل بسرعة 50 إطارا في الثانية عبر وصلة سلك النار ، وضبط الكاميرا بحيث تكون النحلة المسخرة والتحفيز اللمسي مرئية. بعد ذلك ، قم بمعايرة الكاميرا عن طريق التقاط صور فردية لرقعة شطرنج معايرة من اتجاهات مختلفة.
استخدم برنامجا متخصصا مع أداة معايرة الكاميرا لتحليل الصور. بمجرد المعايرة، ضع حرف B ثابت واحد أسفل عدسة الكاميرا وقدم الحافز اللمسي. كما هو موضح سابقا.
سجل حركة الختم أثناء قيام النحلة بمسح الجسم. بمجرد جمع البيانات ، يتم استخدام MATLAB لتحديد خلفية الصورة أولا ، وحساب متوسط قيمة المقياس الرمادي بمرور الوقت لكل بكسل. ستشكل الكائنات الثابتة مثل الرأس الثابت للنحلة والتحفيز اللمسي خلفية الصورة عن طريق طرح خلفية الصورة من كل إطار الأجزاء المتحركة في الفيديو.
من الناحية المثالية ، يتم عزل هوائيات النحلة باعتبارها المناطق الوحيدة ذات القيم غير الصفرية لمزيد من المعالجة. يفترض أن أكبر منطقتين بقيم بكسل غير صفرية هما الهوائيات. يتم إنشاء قناع لترجمة أطراف الهوائي وللصورة بأكملها لتقليل مقدار الخطأ.
يتم تطبيق مجموعة من أدوات تآكل الصور والتوسع بمجرد أن تقلل هذه التقنيات من مستوى الضوضاء. يتم استخدام وظيفة القناع الثنائي لتجميع المناطق المفككة. يتم حساب مركز الثقل لأكبر مجموعتين من هذه المجموعات من أجل التمييز بين الهوائي الأيسر والأيمن.
هنا ، يتم تصنيفها باللون الأحمر والأخضر. أخيرا ، يمكن تعريف طرف الهوائي لكل هوائي على أنه البكسل في مجموعة ذات أعلى قيمة في الاتجاه القريب إلى البعيد ، ويتم إنشاء رسم بياني ثنائي الأبعاد يوضح التوزيع المكاني للطرف المعروض. فيما يلي منحنى التعلم لتكييف PER اللمسي في حبوب اللقاح.
كانت النسبة المئوية للاستجابات الإيجابية بعد الاقتران الأول أعلى بشكل ملحوظ عند مقارنتها بالسلوك العفوي ، ويظهر منحنى التعلم التشبع بعد المكافأة الثالثة. في هذا المثال ، تم تسجيل حركة الطرف الشرجي في كل من المجموعة المشروطة والساذجة لمدة دقيقة واحدة في وجود أو عدم وجود المنبه اللمسي الذي شوهد. فيما يلي حركات نفق عفوية قبل عرض التحفيز.
يظهر absa الموضع الجانبي لطرف النفق بينما يظهر الإحداثي الموضع البعيد. يشير مقياس الألوان إلى النسبة المئوية للوقت الذي يقضيه طرف أنين في أي مكان معين. يشير اللون الأصفر إلى المواقع المتكررة جدا باللون الأحمر والأقل تكرارا والمواقع السوداء بعيدة المنال.
تظهر هذه البيانات أن كلا من المجموعة المشروطة غيرت نمط حركتها الوعلية في وجود حافز لمسي مقارنة بسلوكها التلقائي. لاحظ أن المنطقة الصفراء المستطيلة بالقرب من سطح المنبه تشير إلى أن طرف كعب النمل قضى الكثير من الوقت في أخذ عينات من السطح. أمضى النحل من المجموعة المشروطة وقتا أطول بكثير مع طرف الهوائي في منطقة المنبه أكثر من النحل الساذج.
باتباع هذا الإجراء ، يمكن العثور على طرق فيزيولوجية كهربية ودوائية للإجابة على أسئلة إضافية مثل ، ما هو الأساس الفيزيولوجي العصبي لسلوك اللمس النشط في نحل العسل بعد تطوره؟ مهدت تقنية التكييف اللمسي هذه الطريق للباحثين في مجال الاستشعار النشط باللمس لاستكشاف جوانب مختلفة من تمييز التحفيز اللمسي ، ولكن أيضا التعلم اللمسي والذاكرة في أواني ألفا. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحليل حركات البحث وأخذ العينات النشطة عن طريق اللمس والحشرات.
لاحظ أنه يمكن توسيع تحليل الحركة إلى تحليل ثلاثي الأبعاد إذا تمت إضافة كاميرا أخرى واحدة على الأقل بالتزامن مع الكاميرا الأولى.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
المراجع
يوضح هذا البروتوكول كيفية تدريب نحل العسل المقيد على التحفيزات اللمسية ويقدم تقنية تصوير الحركة ثنائية الأبعاد لتحليل ديناميكيات الحركة للأنماط الدقيقة لأخذ العينات الهوائية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- علم الأعصاب
- علم الأحياء السلوكي
- علم وظائف الأعضاء الحيواني
الخلفية
- تظهر نحل العسل سلوكيات معقدة استجابةً للتحفيزات اللمسية.
- يمكن أن يوفر فهم معالجتها الحسية رؤى حول الآليات العصبية.
- تتيح تقنية تصوير الحركة التحليل الدقيق لأنماط الحركة.
- يمكن تطبيق التكييف الكلاسيكي لدراسة التعلم لدى النحل.
هدف الدراسة
- لتكييف نحل العسل للاستجابة للتحفيزات اللمسية.
- لتحليل أنماط حركة الهوائيات باستخدام تصوير الحركة.
- لدراسة التعلم الارتباطي وغير الارتباطي لدى النحل.
الطرق المستخدمة
- التقاط النحل الطائر بحرية أمام خلية النحل.
- تقييد النحل في أنابيب معدنية وتغطية عيونها.
- تدريب النحل باستخدام تقنيات التكييف الكلاسيكي.
- تسجيل حركة الهوائيات بكاميرا فيديو رقمية وتحليلها باستخدام MATLAB.
النتائج الرئيسية
- تم تحقيق التكييف الناجح للنحل للتحفيزات اللمسية.
- نجح تصوير الحركة ثنائي الأبعاد في تحليل حركات الهوائيات.
- لوحظت تغييرات في سلوك الحركة بعد التكييف.
- اكتسبت الدراسة رؤى حول نماذج التعلم.
الاستنتاجات
- يوفر البروتوكول طريقة موثوقة لدراسة التعلم اللمسي لدى نحل العسل.
- تعد تقنية تصوير الحركة أداة قيّمة لتحليل السلوك.
- تساهم النتائج في فهم المعالجة الحسية لدى الحشرات.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
This method enables mechanistic de-risking of sensory processing models by quantifying active touch behaviors in a genetically tractable invertebrate system. It supports target validation in neuroscience discovery by linking antennal movement patterns to associative learning outcomes. The approach provides predictive confidence for screening neuromodulatory compounds that influence tactile discrimination and memory formation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of tactile sensory pathways and their modulation by learning paradigms.
- Operational Value: Provides a quantifiable behavioral readout (PER) coupled with high-resolution movement analysis for target engagement assessment.
- Predictive Value: Differentiates associative from non-associative learning effects, reducing false positives in mechanistic screening.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Standardized conditioning protocol yields reproducible learning curves across bee cohorts.
- Quantitative Output: 2D motion capture generates spatial distribution maps of antennal tip sampling for objective comparison.
- Scalability: Platform supports testing of multiple tactile stimuli (e.g., grooved vs. smooth surfaces) in parallel conditions.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models multisensory integration processes relevant to neurodevelopmental disorder research.
- Translational Continuity: Links peripheral sensory input (antennal sampling) to central behavioral output (PER) for pathway analysis.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables early de-risking of compounds targeting sensory processing or memory formation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows where sensory processing mechanisms are interrogated prior to lead identification in neuropharmacology programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of neural circuits underlying active touch and sensory learning.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible behavioral endpoints with quantitative movement metrics.
- Analytics: Enables comparison of antennal sampling patterns between naive and conditioned groups to detect learning-induced plasticity.
- Translational Research: Connects peripheral sensory behavior to central nervous system function for mechanistic de-risking.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for evaluating neuromodulatory effects on sensory discrimination and memory.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Mechanistic de-risking of sensory processing targets through quantifiable behavioral and kinematic readouts.
- Operational Value: Standardized harnessing, conditioning, and motion capture workflow ensures reproducibility across laboratories.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing ambiguity in sensory mechanism validation.
- Portfolio Impact: Enables prioritization of compounds based on effects on learning-dependent sensory adaptation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in insect handling, classical conditioning, and video-based motion analysis.
- Dependent on high-speed video capture systems and MATLAB-based image processing pipelines.
- Necessitates standardization of tactile stimulus presentation and sucrose reward timing.
- Adaptation considerations include species-specific antennal morphology and tactile sensitivity thresholds.
- Practical limitations include sensitivity to handling stress and environmental conditions affecting bee motivation.
