Optogenetic تنشيط الخلايا العصبية الحسية الجسدية اسماك الزرد باستخدام الشيف-tdTomato

الهدف العام من هذا الإجراء هو تنشيط الخلايا العصبية الحسية الجسدية المفردة في أسماك الحمار الوحشي اليرقاتية. يتم تحقيق ذلك عن طريق إعداد كابل بصري أولا وتوصيله بالليزر الأزرق A-D-P-S-S. الخطوة الثانية هي حقن الجين المعدل في أجنة من مرحلة خلية إلى اثنتين.

بعد ذلك ، فحص الأجنة الدهنية التي تعبر عن طماطم C-H-E-F-T-D في الخلايا العصبية الحسية الجسدية وقم بتركيبها في الداخل. الخطوة الأخيرة هي توصيل نبضة قصيرة من الضوء الأزرق لتنشيط خلية عصبية واحدة وتسجيل السلوك الناتج. الميزة الرئيسية لهذه التقنية للطرق الحالية باستخدام جذر القناة الخيار الثاني هي أنه يمكن استخدام هذا النهج لاستنباط الاستجابات السلوكية من الخلايا العصبية المفردة التي يتم تنشيطها لمدة تصل إلى أربعة أيام على الأقل بعد دخول المستشفى.

على الرغم من استخدام هذه الطريقة لتوفير نظرة ثاقبة لوظيفة الخلايا العصبية الحسية الجسدية المحددة في يرقات الزرد. يمكن أيضا تكييف هذا النهج لدراسة السلوكيات التي أثارها أي مجموعة عصبية من أسماك الزرد مثل الخلايا العصبية الداخلية أو الخلايا العصبية الحركية. يمكن استخدام هذا النهج الجيني لتنشيط خلايا عصبية معينة في الجسم الحي ، وتوصيف التطور الوظيفي ، وتقييم آثار الطفرات أو الحصار الظاهري لبروتينات معينة على السلوك ورسم خرائط للشبكات العصبية النهائية التي تؤدي إلى استجابات سلوكية متميزة.

لبدء هذا الإجراء ، قم بإنشاء وحدة تخزين للكابل البصري عن طريق إذابة العنق المدبب للزجاج. ماصة المعكرونة فوق الراقات والموقد لعمل زاوية 150 درجة. بعد ذلك ، باستخدام قاطع الأسلاك أو شفرة الحلاقة ، قم بقص الكابل البصري بعناية إلى قطعتين.

يجب أن يكون لكل قطعة طرف مكشوف وطرف واحد مع محول FC PC. ثم قم بتجريد الكبل البصري إلى الكسوة عن طريق إزالة سترة الألياف وتقوية الألياف والطلاء من 5.0 سم من الطرف المقطوع للكابل. بعد ذلك ، أدخل الكبل البصري في ماصة المعكرونة المعدة.

تأكد من أن الكابل يمكن أن يتحرك بسهولة داخل طرف الماصة ويخرج منه باستخدام قاطع زجاجي ماسي أو ملقط ناعم الرؤوس. قم بتقطيع الألياف الزجاجية وقطع النهاية لإنشاء قطع نظيف في نهاية الألياف. بعد ذلك ، اسحب الكابل البصري في ماصة المعكرونة.

ثم ضع الكبل البصري في ماصة المعكرونة باستخدام مناور دقيق تحت المجهر يدويا قم بتغطية 24 إلى 48 جنينا من HPF باستخدام زوج من الملقط بعد ذلك ، وقم بتخدير اليرقات باستخدام 0.02٪ trica باستخدام مجهر تشريح الفلورسنت. تحديد اليرقات باستخدام خلية رون بيرد العصبية أو تعبير الخلايا العصبية ثلاثية التوائم الأجنة ذات التعبير المتناثر في الخلايا التي يمكن التعرف عليها بسهولة هي الأمثل ، ولكن سيتم استهداف الخلايا العصبية الفردية للتنشيط باستخدام كابل الألياف الضوئية ، لذلك فإن مجموعة واسعة من كثافة التعبير مقبولة. انقل اليرقات إلى طبق جديد مع ماء الجنين الأزرق الطازج PTU.

قم بتخزين الأجنة عند 28.5 درجة مئوية في الظلام حتى المرحلة التجريبية المرغوبة. في هذا القسم ، اصنع 1.5٪ من المالتاز المنخفض والماء المقطر المزدوج واحفظه في كتلة حرارية 42 درجة مئوية لمنعه من التصلب. باستخدام ماصة المعكرونة الزجاجية ، انقل إحدى يرقات ما قبل الغربلة إلى أنبوب من 1.5٪ من الاغاروز منخفض الذوبان مع أقل قدر ممكن من ماء الجنين الأزرق.

ثم انقل اليرقة في قطرة من الاغاروز إلى طبق بتري صغير. تحت مجهر تشريح ، ضع الجانب الظهري للحمم البركانية لأعلى عندما يتم ترسيخ الحكام. استخدم شفرة حلاقة رفيعة لقطع الشخروف من جانبي الحمم البركانية.

املأ المنطقة المحيطة بالماء الأزرق الجنيني. بعد ذلك ، قم بعمل قطعتين قطريتين على جانبي الصفار ، مع الحرص على عدم تقطيع الحمم البركانية. بعد ذلك ، اسحب الجرو بعيدا عن جذع وذيل الحمم البركانية.

الآن قم بتركيب الكاميرا عالية السرعة على نطاق التشريح وقم بتوصيل الكاميرا بالكمبيوتر. ثم قم بتشغيل الكمبيوتر والكاميرا عالية السرعة. افتح برنامج تصوير الفيديو واضبط إعدادات الكاميرا.

بعد ذلك ، قم بتوصيل الكبل البصري والليزر والمحفز معا. ثم قم بتشغيل المحفز واضبطه على خمسة فولت كحد أقصى ومدة النبضة خمس مللي ثانية. بعد ذلك قم بتشغيل الليزر.

بعد ذلك ، استخدم مجهر تشريح الفلورسنت لوضع طرف الكبل البصري بالقرب من جسم خلية الخلايا العصبية بتعبير طماطم C-H-E-F-T-D. توصيل نبضة من الضوء الأزرق لتنشيط الخلايا العصبية الحسية. ثم سجل الردود باستخدام كاميرا عالية السرعة.

اضبط على 500 أو 1000 إطار في الثانية ، وكرر التجربة لمدة دقيقة واحدة على الأقل بين عمليات التنشيط لتجنب التعود ، لتحرير الجزء السابق من الحمم البركانية ، و Aris بالملقط ، والحرص على عدم إدراج. ثم انقله إلى ماء الجنين الأزرق الطازج. يمكن السماح للحيوانات بالتطور أكثر ويمكن تكرار الإجراء في المراحل القديمة.

يمكن أيضا إعادة تركيب الجنين للتصوير متحد البؤر عالي الدقة للخلية المنشطة من أجل ربط السلوك بالبنية الخلوية. يتم تثبيت الحمم البركانية لسمك الزرد المرسومة هنا جزئيا في 1.5٪ من الشعير المنخفض Aris ممثلة بخطوط الاندفاعة المحيطة بالجزء المنقاري. تم تصوير الخلايا العصبية ثلاثية التوائم والخلايا العصبية للحية روهان في خلايا الفم الحمراء من خلال خطوط الشرطة في الرسم التوضيحي.

إليكم فيلم يوضح أن تنشيط خلية عصبية واحدة من لحية روهان تعبر عن طماطم C-H-E-F-T-D في حوالي 35 حمم بركانية HPF يثير استجابة سلوكية. يظهر هذا الفيلم تنشيط طماطم C-H-E-F-T-D التي تعبر عن الخلايا العصبية للحية روهان في حمم بركانية 60 HPF ، ويظهر هذا الفيلم تنشيط الخلايا العصبية لللحية عبر الطماطم C-H-E-F-T-D في الحمم البركانية الرباعية DPF بمجرد إتقانها. يمكن تنفيذ هذا النهج الجيني في أقل من ساعة واحدة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تنشيط الخلايا العصبية الفردية وأسماك الميزان اليرقات في نقاط زمنية مختلفة. لا تنس أن العمل بالليزر يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب دائما اتخاذ احتياطات السلامة المناسبة أثناء تنفيذ هذا الإجراء.