العزلة وتمايز الخلايا إلى خلايا الأوعية الدموية اللحمية بيج / برايت

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل الخلايا الشحمية الأولية والحث على تمايزها في الثقافة إلى خلايا بيج أو مشرقة. الخطوة الأولى هي تشريح الأنسجة الدهنية من الفئران. بعد ذلك ، يتم هضم الأنسجة بالكولاجيناز.

بمجرد عزل الجزء الوعائي للسدى ، يتم طلاء الخلايا. الخطوة الأخيرة هي تحفيز تمايز الخلايا إلى خلايا بيج أو مشرقة. في النهاية ، يتم استخدام الطرق التحليلية لإظهار زيادة التعبير عن جينات الخلايا الشحمية البنية المحددة.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في معالجة الأسئلة الرئيسية في الأنسجة الدهنية البنية ، وهي الآلية الجزيئية التي تنظم تطور الخلايا الساطعة أو الخلايا. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى علاج السمنة وأمراض نمط الحياة الأخرى. نظرا لأن التلاعب بالأنسجة الدهنية البنية في البشر يمكن استخدامه كتدخل علاجي محتمل ، فإن الخطوة الأولى هي تحضير وسط الهضم.

ثم بعد القتل الرحيم ، تتم إزالة الأنسجة الدهنية. أولا ، قم بعزل الأنسجة الدهنية البنية بين الكتفين أو الخفافيش عن طريق القطع على طول الجزء الخلفي من وصولا إلى الرقبة. يمكن العثور على فصين من الأنسجة الدهنية البنية تحت الجلد بين الكتفين.

بعد ذلك ، قم بإزالة الطبقة الرقيقة من الدهون البيضاء التي تغطي الخفافيش بعناية. بمجرد عزلها ، ضع الأنسجة مباشرة في PBS نظيف. تم العثور على الأنسجة الدهنية البيضاء الأربية أو الوات مباشرة تحت الجلد على كلا الجانبين.

يمتد إلى داخل الفخذين ونزولا باتجاه الخصيتين. قم بإزالة المنديل ووضعه في PBS نظيف. يتم تطبيق الخطوات التالية على كل من الخفافيش والعينات الرطبة.

قم بإزالة جميع الملوثات بسرعة مثل الشعر والعضلات الهيكلية والأنسجة الضامة من أقسام الأنسجة. بعد ذلك ، جفف المنديل بسرعة على منشفة ورقية لمنع تخفيف وسط التشريح باستخدام PBS ووضعه على طبق جاف. أضيفي وسط الهضم وافرم المنديل إلى قطع صغيرة.

بعد ذلك ، انقل الأنسجة إلى أنبوب سعة 50 مليلتر يحتوي على باقي وسط الهضم. ضع الأنبوب في حاضنة 37 درجة مئوية مع تحريك مستمر لمدة 40 إلى 50 دقيقة حتى يهضم. تحقق كل 10 إلى 15 دقيقة للتأكد من أن الهضم يسير على ما يرام ولمنع الإفراط في الهضم.

بعد هضم الأنسجة جيدا ، أوقف الهضم. بإضافة خمسة ملليلتر من الوسط الكامل وخلطها جيدا ، يجب أن تكون الخلايا متجانسة تماما تقريبا. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للعينة عند 700 مرة G لمدة 10 دقائق.

يجب أن يكون جزء الأوعية الدموية اللحمية مرئيا الآن على شكل حبيبات بنية اللون في الجزء السفلي من الأنبوب ، وتستنشق طبقة الخلايا الشحمية الزيتية الناضجة في الأعلى ومعظم الطبقة السائلة. بعد ذلك ، قم بإذابة الحبيبات في 10 ملليلتر ، وتخلط بشكل متوسط واخلطها جيدا. بمجرد الخلط ، ضع مصفاة خلية فوق أنبوب جديد سعة 50 مليلتر وقم بتصفية تعليق الخلية.

انقل معلق الخلية المصفى إلى أنبوب سعة 15 مليلتر وجهاز طرد مركزي عند 700 مرة جم لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، استنشق الوسط وأعد تعليق الحبيبات. في 10 ملليلتر من الماصة المتوسطة الكاملة واخلطها جيدا ، قم بتقطيع الخلايا حسب الحاجة.

بشكل عام ، ستنتج خمسة فئران لوحين بطول 10 سم من البات الإربي ولوحة واحدة من الخفافيش. بعد ساعة أو ساعتين من الطلاء. قم بشفط الغسيل المتوسط باستخدام PBS مرتين وأضف متوسطا جديدا.

هذه الخطوة مهمة لأن هذا يمكن أن يزيل خلايا الدم الحمراء والخلايا المناعية والملوثات الأخرى. يتم تحضير وسائط الصيانة والحث في وقت مبكر. بمجرد أن تنمو الخلايا الشحمية الأولية إلى 95 إلى 97٪ التقاء ، قم بتغيير الوسط الكامل العادي بوسط الحث.

بعد 48 ساعة ، قم بتغيير وسيط الصيانة إلى وسط الصيانة الذي يحتوي على 0.5 ميكرومولار RO glitazone. بعد 48 ساعة إضافية ، قم بالتغيير إلى وسط الصيانة الطازج الذي يحتوي على ميكرومولار RO glitazone لمدة يومين إلى ثلاثة أيام إضافية. ستظهر القطرات بعد حوالي ثلاثة إلى أربعة أيام من التحريض كما هو موضح هنا بعد ستة إلى سبعة أيام من إضافة وسط الحث لأول مرة.

يجب أن تتمايز الخلايا تماما إلى خلايا دهنية ناضجة ويجب أن تمتلئ بقطرات الزيت. يمكن الآن حصاد الخلايا واستخدامها لمزيد من التحليل. يمكن تقييم تحمير الخلايا الشحمية الأولية عن طريق قياس mRNA للجينات المحددة أو الانتقائية للدهون البنية بواسطة Q-R-T-P-C-R كما هو موضح هنا.

RO glitazone, بقوة الناجم UCP واحد تعبير المرنا فورسكولين العلاج المعين هنا على أنه دورة MP. زيادة التعبير الواحد الناجم عن RO glitazone ل UCP. Cdia. كما تمت زيادة جين آخر انتقائي للدهون البنية بقوة بطريقة تعتمد على الجرعة. زاد علاج RO glitazone أيضا من التعبير عن FABP four وعلامة الشحمية لكل من الدهون البنية والبيضاء.

لم يكن تأثير اللون البني هذا ناتجا ببساطة عن تعزيز تكوين الشحم في حد ذاته. نظرا لأن تحريض UCP واحد وتعبير CDIA كان لا يزال مهما ، حتى لو تم تطبيع مستويات mRNA إلى مستويات FABP أربعة ، فإن هذه اللطخة الغربية تؤكد زيادة مستوى البروتين في UCP one. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل الخلايا الشحمية وكيفية تمييز هذه الخلايا إلى خلايا بيج أو مشرقة في الثقافة.