الوقت الفاصل بين التصوير من الخلايا الثديية سابق للورم ظهاري الأولية المستمدة من نماذج الماوس المعدلة وراثيا لسرطان الثدي

الهدف العام من التجربة التالية هو تحديد ما إذا كانت الآفات الوراثية المهيأة للإصابة بسرطان الثدي تغير سلوك خلايا الذاكرة البلاستيكية الصنوبرية في الثقافة الأولية. يتم تحقيق ذلك عن طريق عزل الخلايا الظهارية الثديية الأولية عن الفئران المعدلة وراثيا. كخطوة ثانية ، يتم إجراء تصوير الخلية الحية بفاصل زمني على مدى خمسة إلى سبعة أيام ، مما يؤدي إلى إنشاء فيلم لتحليل سلوك الخلية.

ثم يتم استخدام برنامج يتتبع الخلايا المفردة لتحديد ومقارنة سلوك الخلايا المعزولة من نماذج الفئران المعدلة وراثيا المختلفة لسرطان الثدي. تظهر النتائج أن آفات وراثية معينة تحفز سلوكيات مختلفة في ذاكرة ما قبل الأورام. تعتمد الخلايا الظهارية على التحليلات السلوكية الكمية التي يتم إجراؤها باستخدام تتبع الخلية الواحدة.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة حول كيفية تغيير الآفات الجينية المختلفة لسلوك الخلايا الظهارية الثديية الثديية قبل الأورام. يمكن تطبيقه أيضا على أنظمة أخرى مثل ما قبل الأورام ، والخلايا من الأعضاء الأخرى ، والخلايا السرطانية من أي أعضاء ، بما في ذلك دراسة التغيرات السلوكية المستحثة بالعلاج المحتمل ، بالإضافة إلى مقارنات سلوك الخلايا اللحمية من الأنسجة الطبيعية والسرطانية التي توضح الإجراء. اليوم ستكون الدكتورة بريسيلا فيرث ، المؤلفة الرئيسية لهذا المنشور ، وبيت جونسون ، مدير مركز الموارد المشتركة للفحص المجهري والتصوير في مركز لومباردي لأبحاث السرطان في جامعة جورج تاون.

القتل الرحيم للفأر والمضي قدما على الفور في التشريح. ضع الفأر مستلق على منصة تشريح الستايروفوم وقم بتأمين الأطراف الأربعة بحيث يكون الجلد البطني مشدودا. تشبع الجلد البطني والشعر ، بما في ذلك الجلد على الأطراف بنسبة 70٪ من الإيثانول.

كشف الرقمين اثنين وثلاثة والغدد الثديية رقم أربعة وخمس مع شق خط الوسط عبر الجلد. قم بتمديد الشق بشقين y عبر الجلد الإنسي للأطراف الأربعة. احرص على عدم دخول الصفاق باستخدام تشريح حاد.

افصل الجلد عن الصفاق الأساسي. اسحب جانبي الجلد للخلف حتى يصبح مشدودا وقم بتثبيته على المنصة بدءا من الجانب الخارجي. استخدم المقص لعمل تشريح حاد يعزل الغدد الثديية القشرية أو الصدرية السليمة عن النسيج الضام والعضلات الأساسية.

ضع واحدة أو اثنتين من الغدد الثديية في طبق بتري بطول 10 سم وانتقل إلى غطاء زراعة الأنسجة. الآن ، افحص الغدد بحثا عن الغدد الليمفاوية الثديية. عقيدات صغيرة مقيدة جيدا ذات لون مصفر.

باستخدام مشرط وملقط ، قم بإزالتها من الغدة المحيطة. افرم الأنسجة الثديية إلى مكعبات بحجم المليمتر باستخدام مشرطين. ضع الأنسجة الثديية المفرومة في أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر مع خمسة ملليلتر من وسائط التفكك.

امزجها مع ترتيب لطيف واحتضنها طوال الليل. احتفظ بالغطاء فضفاضا في اليوم التالي. عزل وزراعة الخلايا الظهارية الأولية.

مباشرة بعد طلاء الخلايا. ضع لوحة الآبار الستة بإحكام على مرحلة المجهر داخل غرفة الحضانة. اترك اللوحة تتوازن لمدة 15 دقيقة على الأقل.

اضبط المكثف لإضاءة كوهلر وتوسيط حلقات الطور. افتح برنامج الحصول على الصور مثل السرعة وقم بإنشاء مكتبة وتسمية لصور الفاصل الزمني واحفظها في موقع به مساحة كافية للملفات الكبيرة. اخفض العدسات لتجنب تداخل عدسة المسرح.

تحت عنوان المرحلة ، حدد مرحلة المعايرة لاستعادة مجموعة المستوى البؤري Z تساوي صفرا ضمن علامة التبويب X ، Y ، Z. وحدد نقاط التصوير عن طريق تحديد إضافة نقطة أسفل المرحلة. ضع العنوان نقاط التصوير في منتصف كل بئر.

قد يتم تشويه تصوير تباين الطور بالقرب من محيط الآبار البلاستيكية. رتب النقاط في مربع في أربعة في أربعة حقول لكل منها تداخل 5٪ تقريبا. احفظ النقاط المحددة تحت المرحلة.

ضمن المرحلة ، حدد إنشاء خريطة تركيز واتبع المطالبة لتعيين تركيز كل نقطة. ثم اضبط توقيت الحصول على الصور بحيث يلتقط العدد الصحيح من الصور في الساعة. الآن احفظ خريطة التركيز تحت المسرح.

تابع بالنقر بزر الماوس الأيمن فوق الحصول على الصور على شريط الأدوات الأيمن. ثم احفظ إعدادات التصوير. اضغط على زر التسجيل لبدء عملية التصوير بعد ساعة ، وتحقق من تركيز الصور لمعرفة ما إذا كانت هناك حاجة إلى أي تعديل.

راقب التصوير المباشر واستمر فيه لمدة خمسة أيام عندما تصبح الخلايا ملتقية. من الأهمية بمكان مراقبة الصور الرقمية المكتسبة وضبط خريطة التركيز بشكل متكرر خلال ال 24 ساعة الأولى لأن الخلايا ستتصل باللوحة بعد ذلك مرتين يوميا على الأقل. تأكد من أن الخلايا في بؤرة التركيز وأن الثقافات ليست ملوثة.

لتحديد آلية تكوين المستعمرة الأولي ، ابدأ بمجموعة صور واحدة تمثل موقع تصوير واحد على اللوحة. في الإطارات الأولية ، ستكون الخلايا عائمة ، ويمكن تمييز الخلايا الظهارية والخلايا الليفية من خلال مورفولوجيا الخلية. الخلايا الظهارية لها شكل متوازي المستطيلات وتشكل مستعمرات خلايا.

الخلايا الليفية ، وهي نوع من الخلايا اللحمية لها مورفولوجيا ممدودة. اتبع الصور التسلسلية لتحديد متى تلتصق الخلية الظهارية الأولى باللوحة. في هذه الخطوة ، يمكن تحديد الخلايا الظهارية وتمييزها عن الخلايا الليفية من خلال مورفولوجيتها المستطيلة.

اتبع هذه الخلية الظهارية المفردة من خلال الصور التسلسلية واتبع مصيرها خلال ال 24 ساعة اللاحقة. لاحظ ، إذا أصبحت الخلية محاطة بخلايا ظهارية إضافية ، أو خضعت لانقسام الخلايا أو خضعت لموت الخلايا المبرمج إذا كانت محاطة بخلايا ظهارية ، فيمكن تحديد آلية تكوين المستعمرة من تراكم الخلايا المحيطة أو من انقسام الخلية. سجل عدد المستعمرات التي تشكلت عن طريق تراكم الخلايا مقابل انقسام الخلايا خلال ال 24 ساعة الأولى لتحديد عدد الخلايا الملتصقة في البداية التي تخضع لموت الخلايا المبرمج خلال فترة زمنية محددة.

اتبع الصور التسلسلية لظهور السمات الكلاسيكية لموت الخلايا المبرمج الذي يتطور في خلية كانت ملتصقة بمرور الوقت. تغير الخلايا الظهارية في الثقافة مورفولوجيتها من شكل متوازي للخلايا الأولية إلى مظهر أكثر استطالة. بما يتفق مع EMT.

اتبع الصور التسلسلية لتحديد اليوم والساعة بعد الطلاء عند حدوث ذلك ، ابدأ ببدء تشغيل برنامج TTT. حدد الأحرف الأولى من اسم المستخدم وانقر على متابعة. اضغط على تعيين NAS ، وحدد مجلد تصدير TTT الذي أنشأه المستخدم وانقر فوق موافق.

في المستعرض، حدد مجلد تجربة. حدد مجلد موضع، ثم اضغط على زر موضع التحميل. أرسل عامل العين إلى 10 مرات.

قم بتحميل عدد الصور المطلوبة ، والتي عادة ما تكون جميع الصور. عند استخدام هذا التحليل. لأول مرة في نافذة محرر الخلية، حدد مستعمرة جديدة ضمن قائمة الملف في نافذة الفيلم.

اضغط على زر خلية المسار أو اضغط على F اثنين. لبدء تعقب خلية. حدد خلية في نافذة الفيلم وضع المؤشر فوق الخلية.

يجب أن تظهر دائرة برقم الخلية بعد النقر فوق F اثنين. استخدم مفتاح الصفر على لوحة الأرقام لتتبع موضع الخلية والتقدم إلى الصورة التالية. حرك المؤشر لمتابعة موضع كل خلية خلال كل إطار.

لحذف مسار والعودة إلى الصورة السابقة، اضغط على حذف على لوحة الأرقام للتحرك للأمام في الإطارات دون تتبع الخلية، اضغط على ثلاثة. وللتحرك للخلف دون تتبع ، اضغط على واحد. لتمييز تقسيم خلية في نافذة الفيلم، انقر فوق زر التقسيم لتمييز موت الخلية في نافذة الفيلم، وانقر فوق موت الخلية.

بمجرد حدوث الانقسام ، يمكن تتبع الخلايا الوليدة في نفس خريطة مصير الخلية. للقيام بذلك ، انتقل إلى نافذة محرر الخلية وانقر بزر الماوس الأيمن على رمز الدائرة لخلية dotter المحددة. يبدأ هذا وضع التتبع تلقائيا الآن اضغط على F 10 لحفظ الشجرة.

سيتم حفظ كل شجرة في مجلد الإخراج المخصص. لبدء خريطة كبريتات جديدة في نافذة محرر الخلية، حدد القائمة المفتوحة، وانقر فوق ملف وانقر فوق. تم تقريب خلايا مستعمرة جديدة وطفوها في بداية التصوير.

قضبان الحجم تساوي 200 ميكرون بعد التعلق باللوحة ، أصبحت مسطحة وأظهرت مظهرا من النوع المستطيل المستطيل. بحلول أربعة أيام من الثقافة ، استطالت غالبية الخلايا الظهارية إلى مورفولوجيا تشبه EMT. حدث هذا التغيير بنفس التسلسل الزمني في جميع الأنماط الجينية التي تمت دراستها ، وتطورت الخلايا العائمة إلى مستعمرات خلايا ظهارية فردية محددة.

بحلول 24 ساعة بعد الطلاء ، كشف تحليل الصور التسلسلية أن هذه المستعمرات تم إنشاؤها عن طريق تجميع الخلايا بدلا من انقسام الخلايا. في حين أن تعطيل BRCA واحد في حد ذاته لم يغير عدد المستعمرات المتشكلة. أدت إضافة قصور TP 53 haplo إلى تقليل عدد المستعمرات المتكونة بشكل كبير.

وبالمثل ، أدت إضافة ER alpha على التعبير إلى زيادة عدد المستعمرات التي تشكلت بعد هذا الإجراء. يمكن إجراء طرق أخرى تستخدم استخدام التصوير بفاصل زمني جنبا إلى جنب مع تتبع الخلية المفردة من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل كيفية تغيير الأساليب العلاجية المحددة أو الآفات الجينية الإضافية لسلوك الخلية وقد تؤثر على الاستجابة العلاجية أو تطور السرطان.