انجذاب كهربي المستندة ميكروفلويديك للتحليل الكمي بناء على الطلب انواع معينة ايليجانس 'تنقل
مايو 2, 2013
وهناك طريقة الصغرى الكهربائية فلويديك شبه الآلي للحث تنقل على الطلب في انواع معينة ايليجانس يوصف. ويستند هذا الأسلوب على هذه الظاهرة الفيزيولوجية العصبية من الديدان الاستجابة لمجالات كهربائية خفيفة ("انجذاب كهربي") داخل قنوات ميكروفلويديك. يقدم ميكروفلويديك انجذاب كهربي باعتبارها وحساسة، تقنية السريع منخفضة التكلفة، وقابلة للكشف عن العوامل التي تؤثر على صحة الخلايا العصبية.
الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد التشوهات في الإشارات العصبية والعصبية العضلية في الكائن الحي النموذجي ل C Allergan بعد التعرض الكيميائي أو التلاعب الجيني. يتم تحقيق ذلك عن طريق تصميم وحفر نمط القناة الدقيقة أولا في رقاقة السيليكون. خلال الخطوة الثانية ، يتم استخدام قالب السيليكون لصب قناة صغيرة واحدة أو أكثر من PDMS.
ثم يتم إرفاق مكونات الملحقات بقالب PDMS. بعد ذلك ، يتم تسجيل سلوك الديدان أثناء تحفيزها على السباحة عبر القناة الدقيقة باستخدام كاميرا مثبتة على المجهر. في النهاية ، يتم استخدام الموائع الدقيقة الكهربائية لتحديد التغيرات في الديدان الخيطية والخلايا العصبية والجهاز العضلي بسبب التلاعب الكيميائي أو الجيني بالحركة كقراءة.
لذا فإن الميزة الرئيسية لهذه التقنية على التقنيات الحالية ، وخاصة المقايسات السلوكية القائمة على اللوحة ، هي أنه باستخدام هذه التقنية ، يمكن التحكم بإحكام في اتجاه حركة الدودة ، مما يسمح بالقياس الكمي الدقيق لسلوكيات القاطرة مثل تردد ثني الجسم ووقت الدوران وسرعة السباحة. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو علاج الاضطرابات التنكسية العصبية مثل مرض باركنسون والزهايمر لأنه يمكن استخدامها للكشف عن العوامل الكيميائية والوراثية ذات الخصائص الواقية من الأعصاب. خطرت لنا فكرة هذه التقنية لأول مرة عندما أدركنا أن هناك نقصا في طريقة تحليل سلوك حركة الطريقة بطريقة كمية.
الحركة طوعية وعشوائية ، ومن الصعب توصيفها. لذلك أردنا إنشاء طريقة سهلة يمكن للجميع تعلمها لجعل القالب الرئيسي يبدأ باستحمام رقاقة سيليكون مقاس ثلاث بوصات في الأسيتون ثم الميثانول لمدة 30 ثانية لكل منهما. ثم اشطف الرقاقة بالماء منزوع الأيونات لمدة خمس دقائق.
بعد ذلك ، استخدم مسدس نفخ النيتروجين لتجفيف سطح الرقائق ثم قم بتسخين الرقاقة على لوح ساخن عند 120 درجة مئوية بعد دقيقتين ، وأكسد البلازما سطح رقاقة السيليكون عند 50 واط لمدة دقيقة واحدة. الآن باستخدام ثلاثة ملليلتر من SU eight 100 photo resist spin ، قم بتغطية سطح الرقاقة عند 1 ، 750 دورة في الدقيقة لمدة 40 ثانية ، ثم اخبز الرقاقة المطلية مسبقا على طبق ساخن عند 65 درجة مئوية. بعد 10 دقائق ، ارفعي درجة الحرارة إلى 95 درجة مئوية على مدار دقيقتين واخبزي الويفر لمدة ساعة إضافية.
بعد إزالة الرقاقة من اللوحة الساخنة ، رتب قناع صور للتصميم المطلوب فوق الرقاقة. قم بتعريض مقاومة الصورة للأشعة فوق البنفسجية لمدة 95 ثانية. ثم اخبز الرقاقة على طبق ساخن باستخدام نفس تدرج درجة الحرارة المستخدم في الخبز المسبق بعد الخبز.
اغمر الرقاقة في SU ثمانية. ضع حلا لمدة 10 إلى 15 دقيقة. شطف الرقاقة مع الأيزوبروبانول لتأكيد الانتهاء من تطوير التصميم.
ثم اشطفها بالماء منزوع الأيونات لمدة 30 ثانية. أخيرا ، جفف الرقاقة بمسدس نيتروجين واخبزها لفترة وجيزة على حرارة 120 درجة مئوية. الآن ، ضع القالب الرئيسي المصنع بالإضافة إلى رقاقة سيليكون فارغة في طبقين منفصلين من بتري مبطنين بورق الألمنيوم.
صب 20 مل من البوليمر المسبق PDMS في القالب الرئيسي والطبق ، و 15 مل في طبق الويفر الفارغ. بعد ذلك ، اضغط برفق على الرقائق باستخدام قضيب خشبي يمكن التخلص منه للتخلص من أي جيوب هوائية أسفل الرقائق ، ثم قم بتغطية كلا الطبقين واتركهما جانبا لمدة يوم للشفاء. بعد أن تنضج الرقائق ، قم بإزالة ورق القصدير وقشر PDMS.
ثم استخدم وحيد القرن Harris مقاس 2.5 ملم لكمة منافذ الوصول إلى السوائل على طرفي القناة في PDMS من القالب الرئيسي. قم بقص كلا القرصين PDMS إلى شرائح متشابهة الحجم. ثم في غرفة نظيفة ، قم بتحميل القناة وشريط PDMS الفارغ والشريحة الزجاجية في مؤكسد البلازما.
قم بتعريض المواد لبلازما الأكسجين بقوة 40 واط لمدة 40 ثانية. ثم قم بلصق قطعة القناة والشريحة الزجاجية على جانبي الشريط الفارغ واترك المواد جانبا لإكمال الترابط. بعد ساعتين ، استخدم البوليمر المسبق PDMS لربط قطعتين من الأنابيب البلاستيكية بطول ست بوصات على الأقل بالخزانات المثقوبة على صفيحة ساخنة عند 120 درجة مئوية.
اسمح ل PDMS بالشفاء قبل المتابعة. ثم قم بتثبيت موصل بلاستيكي سائل على أحد الأنابيب للسماح بمرفقات المحاقن. الآن ، أدخل أطوال ثلاث بوصات من الأسلاك النحاسية المعزولة قياس 22 في كل خزان بين أنبوب المدخل والقناة التي تثبت الأسلاك بمزيد من البوليمر المسبق PDMS.
ابدأ هذه الخطوة بوضع القناة الدقيقة المجمعة للتو على مرحلة متحركة XY من المجهر مع كاميرا مثبتة متصلة بشاشة ، وقم بتوصيل مصدر الطاقة بأقطاب القنوات الدقيقة. بعد التأكد من أن مقاومة القناة الدقيقة تبلغ حوالي 0.6 ميجا أوم ، قم بتوصيل أنبوب الإخراج للقناة الدقيقة بحقنة يمكن التخلص منها. ثم اغمر فم أنبوب المدخل في محلول من الديدان الخيطية المعلقة في المخزن المؤقت الفسيولوجي M تسعة.
ضع ضغطا سلبيا داخل المحقنة لشفط السائل في القناة. عندما تمتلئ أنابيب المدخل والمخرج ، افصل المحقنة والهيدروستاتيكية. قم بمعالجة التدفق عن طريق ضبط الارتفاع النسبي للأنابيب لوضع دودة في وسط القناة.
ثم ضع كلا الأنبوبين بشكل مسطح على نفس الارتفاع للحفاظ على التدفق الصفري داخل القناة الدقيقة. عند تبديل عينات الدودة أثناء تجربة سيارات الأجرة الكهربائية ، بعد تسوية كلا أنبوبي المدخل إلى نفس الارتفاع ، إذا كان لا يزال هناك تدفق ، فقم بإجراء تعديلات صغيرة على ارتفاع الأنبوب بالنسبة لبعضهما البعض. إذا لم نكن متأكدين مما إذا كان التدفق يساوي صفرا حقا ، فيمكننا إحداث انعكاس في حركة الدودة عن طريق تغيير قطبية المجال الكهربائي ثم تقييم السرعة الخطية للدودة أثناء دورانها.
الآن اضبط مصدر الطاقة على الجهد المناسب. قم بتنشيط الإشارة الكهربائية واترك دقيقة واحدة من التعرض المسبق للدودة للتأقلم مع الحقل ، وخلال هذه الفترة يجب أن تبدأ الدودة في التحرك نحو الكاثود عند مرور الدقيقة. ابدأ التسجيل.
عند الانتهاء من التجربة ، قم بإزالة كل السوائل والديدان من القناة. اشطف الغرفة بالماء منزوع الأيونات واترك الجهاز على لوح ساخن على حرارة 125 درجة مئوية حتى يجف. في هذا الفيديو التمثيلي ، يتم عرض محور كهربائي للديدان الخيطية البالغة من النوع البري ومخرجات موضعه وسرعته من برنامج تتبع الدودة.
يبدأ الفيديو بالكاثود على اليمين. يشير ظهور الماصة الزجاجية إلى الانعكاس الوشيك والإزالة اللاحقة لإشارات الماصة. لحظة الانعكاس هنا ، بيانات الموضع مقابل الوقت والسرعة اللحظية مقابل مخرجات الوقت لبرنامج تتبع الدودة المخصص للدودة في الفيديو ، قام البرنامج بحساب منحنى السرعة من منحنى وقت الموضع.
يعرض مخطط الصندوق هذا بيانات السرعة الكهربائية من مجموعة من البرية الخنادق. تعبر المعدلة وراثيا T عن جين ألفا سينوكلين البشري في عضلات جدار الجسم تحت سيطرة محفز الجينات ذات السلسلة الثقيلة الميوسين UNC 54 ، والذي يتسبب في تراكم البروتين ويتجلى على شكل استجابة تكتيكية كهربائية أبطأ من تلك الموجودة في البرية. بمجرد إتقانها ، يمكن فحص أكثر من 20 دودة كل ساعة إذا تم إجراء تجربة سيارات الأجرة الكهربائية بشكل صحيح.
أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن الطفرات والمواد الكيميائية التي تؤثر على الحركة أو الإحساس بالكهرباء فقط هي التي ستنتج أنماطا ظاهرية يمكن اكتشافها عن طريق فحص الضرائب الكهربائية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصميم السيليكون. قمنا بتجميع قناة الموائع الدقيقة وكيفية تحليل حركة طريقة N باستخدام اختبار axxis.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تصف هذه المقالة طريقة شبه آلية للميكرو-كهرومائعية لإحداث الحركة عند الطلب في الديدان الأسطوانية الرشيقة. تستفيد التقنية من ظاهرة الكهرومغناطيسية، مما يسمح بالفحص السريع للعوامل التي تؤثر على صحة الخلايا العصبية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- الميكرو-مائعات
- التحليل السلوكي
الخلفية
- الدودة الأسطوانية الرشيقة هي كائن حي نموذجي لدراسة الإشارة العصبية والعضلية العصبية.
- الكهرومغناطيسية هي استجابة نيوروفسيولوجية للحقول الكهربائية.
- تتيح القنوات المائعية الدقيقة إجراء تجارب خاضعة للرقابة على الكائنات الحية الصغيرة.
- يمكن أن يكشف فهم الحركة عن رؤى في صحة الخلايا العصبية.
غرض الدراسة
- لتحديد التشوهات في الإشارة العصبية والعضلية العصبية.
- لتقييم تأثيرات التعرض الكيميائي أو التلاعب الجيني.
- لاستخدام الحركة كمخرج لتغيرات الخلايا العصبية والعضلية.
الطرق المستخدمة
- تصميم ونحت أنماط القنوات المصغرة في أشباه الموصلات السليكونية.
- صب القنوات المصغرة من PDMS باستخدام قوالب سيليكونية.
- ربط مكونات إضافية بقالب PDMS.
- تسجيل سلوك الديدان باستخدام كاميرا مثبتة على المجهر.
النتائج الرئيسية
- الاستحثاث الناجح للحركة في C. elegans باستخدام الكهرومغناطيسية.
- تحديد التغييرات في الأنظمة العصبية والعضلية.
- تبيان الكهرومغناطيسية المائعية الدقيقة كطريقة فحص قابلة للتوسيع.
- رؤى حول تأثيرات التلاعبات الجينية والكيميائية.
الاستنتاجات
- الكهرومغناطيسية المائعية الدقيقة هي أداة قيّمة لأبحاث علم الأعصاب.
- توفر هذه الطريقة نهجًا منخفض التكلفة وحساسًا لدراسة صحة الخلايا العصبية.
- قد تعزز التطبيقات الإضافية فهم الاضطرابات العصبية العضلية.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Quantitative locomotion analysis in C. elegans enables high-throughput screening for neuroprotective compounds and genetic modifiers in neurodegenerative disease models. By converting neuronal signaling defects into measurable electrotactic responses, this method supports early target validation and mechanistic de-risking in discovery pipelines. The microfluidic format provides scalable, reproducible phenotypic readouts that improve predictive confidence in lead identification campaigns.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by linking dopaminergic neuron function to quantifiable locomotion phenotypes.
- Operational Value: Enables rapid assessment of genetic and chemical manipulations affecting neuronal signaling with on-demand electrotaxis stimulation.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying compounds that rescue movement defects in PD models before costly mammalian studies.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, quantitative outputs such as swimming speed and body bend frequency for assay readiness.
- Operational Value: Facilitates automation potential with microfluidic control of worm positioning and field polarity reversal for reversal time measurements.
- Scalability: Permits screening of over 20 worms per hour, enabling efficient primary screens for neuroprotective factors.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Uses locomotion as a disease-relevant functional readout that correlates with dopaminergic neurodegeneration in C. elegans PD models.
- Mechanistic De-risking: Distinguishes neurotoxic effects from general toxicity by isolating neuronal signaling defects via electrotactic response alterations.
- Biomarker Alignment: Supports translational biomarker development by quantifying age-dependent electrotactic variability in young adults versus larvae.
Pipeline & Workflow Integration
The microfluidic electrotaxis assay integrates into discovery workflows as a phenotypic screening platform between target hit confirmation and lead optimization, providing mechanistic insights on neuronal viability.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of neuroprotective genes and compounds by quantifying locomotor recovery in disease models.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative locomotion metrics that enable Z'-factor assessment and assay robustness evaluation.
- Analytics: Provides time-resolved position and velocity outputs for kinetic analysis of electrotactic response dynamics.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling age-dependent response variations relevant to late-onset neurodegeneration.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for cross-project screening of neuronal modulators across diverse genetic backgrounds and strain backgrounds like C. briggsae.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in neuronal screening by isolating locomotion as a specific readout for neuromuscular function.
- Operational Value: Standardizes worm handling and stimulus delivery, minimizing variability from manual assays and enabling cross-site reproducibility.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by accelerating go/no-go decisions through early phenotypic profiling of neuroprotective candidates.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of hits based on dose-responsive electrotactic recovery in transgenic models expressing human disease proteins.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic device fabrication, including photolithography and PDMS bonding techniques.
- Depends on access to microscope-mounted camera systems and programmable power supplies for precise electric field control.
- Necessitates standardization of worm preparation protocols, including age synchronization and M9 buffer conditioning.
- Involves adaptation considerations when extending the assay to other nematode species or varying channel geometries.
- Limited to detecting phenotypes that affect locomotion or electro-sensation, as confirmed by source material noting that only such mutations or chemicals yield detectable responses.
