انجذاب كهربي المستندة ميكروفلويديك للتحليل الكمي بناء على الطلب

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد التشوهات في الإشارات العصبية والعصبية العضلية في الكائن النموذجي الخاص بـ C Allergan بعد التعرض الكيميائي أو التلاعب الجيني. ويتم تحقيق ذلك عن طريق تصميم ونقش نمط قنوات دقيقة في رقاقة سيليكون أولاً، وفي الخطوة الثانية، يتم استخدام قالب السيليكون لصب قناة دقيقة واحدة أو أكثر من PDMS.

بعد ذلك، يتم تركيب المكونات الملحقة بقالب PDMS. ثم يتم تسجيل سلوك الديدان أثناء تحفيزها على السباحة عبر القناة الدقيقة باستخدام كاميرا مثبتة على مجهر. وفي النهاية، تُستخدم الموائع الدقيقة الكهربائية لتحديد التغييرات في الأنظمة العصبية والعضلية للديدان الخيطية نتيجة للتلاعب الكيميائي أو الجيني، مع استخدام الحركة كقيمة مقاسة.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالتقنيات الحالية، وخاصة الاختبارات السلوكية القائمة على الأطباق، في إمكانية التحكم الدقيق في اتجاه حركة الدودة، مما يسمح بالتقدير الكمي الدقيق لسلوكيات الحركة مثل تردد انثناء الجسم، ووقت الدوران، وسرعة السباحة. وتمتد تطبيقات هذه التقنية لتشمل علاج الاضطرابات التنكسية العصبية مثل مرض باركنسون ومرض الزهايمر، حيث يمكن استخدامها لفحص العوامل الكيميائية والجينية ذات الخصائص الواقية للأعصاب. وقد طرأت لنا فكرة هذه التقنية عندما أدركنا نقص الطرق المتاحة لتحليل سلوك حركة الدودة بطريقة كمية.

تكون الحركة إرادية وعشوائية، ومن الصعب توصيفها. لذا، أردنا وضع طريقة سهلة يمكن للجميع تعلمها. لصنع القالب الرئيسي، ابدأ بغمر رقاقة سيليكون مقاس 3 بوصات في الأسيتون ثم في الميثانول لمدة 30 ثانية لكل منهما. بعد ذلك، اشطف الرقاقة بالماء منزوع الأيونات لمدة خمس دقائق.

بعد ذلك، استخدم مسدس نفخ النيتروجين لتجفيف سطح الرقاقة، ثم قم بتسخين الرقاقة على لوح ساخن عند 120 درجة مئوية لمدة دقيقتين، ثم قم بأكسدة سطح رقاقة السيليكون بالبلازما بقدرة 50 وات لمدة دقيقة واحدة. الآن، باستخدام 3 مل من مادة SU-8 100 المقاومة للضوء، قم بطلاء سطح الرقاقة بالدوران بسرعة 1,750 RPM لمدة 40 ثانية، ثم قم بالخبز المسبق للرقاقة المطلية على لوح ساخن عند 65 درجة مئوية. بعد 10 دقائق، ارفع درجة الحرارة إلى 95 درجة مئوية على مدار دقيقتين، ثم اخبز الرقاقة لمدة ساعة إضافية.

بعد إزالة الرقاقة من الصفيحة الساخنة، ضع قناعاً ضوئياً بالتصميم المطلوب فوق الرقاقة. قم بتعريض المقاوم الضوئي للأشعة فوق البنفسجية لمدة 95 ثانية. ثم قم بإجراء عملية الخَبز اللاحق للرقاقة على صفيحة ساخنة باستخدام تدرج درجة الحرارة نفسه المستخدم في الخَبز المسبق.

اغمر الرقاقة في SU-8. ضعها في محلول التظهير لمدة تتراوح من 10 إلى 15 دقيقة. اشطف الرقاقة باستخدام الإيزوبروبانول للتأكد من اكتمال تظهير التصميم.

ثم اشطفها بالماء منزوع الأيونات لمدة 30 ثانية. وأخيرًا، جفف الرقاقة باستخدام مسدس النيتروجين واخبزها لفترة وجيزة عند 120 °C. الآن، ضع القالب الرئيسي المصنع بالإضافة إلى رقاقة سيليكون فارغة في طبقين منفصلين من أطباق بيتري المبطنة بورق الألومنيوم.

اسكب 20 milliliters من بوليمر PDMS الأولي في القالب الرئيسي والطبق، و15 milliliters في طبق الرقاقة الفارغ. بعد ذلك، اضغط برفق على الرقاقات باستخدام أداة تطبيق خشبية مخصصة للتخلص من أي جيوب هوائية تحت الرقاقات، ثم غطِ كلا الطبقين واتركهما جانباً لمدة يوم ليتم المعالجة. بعد معالجة الرقاقات، أزل الرقائق المعدنية وقشر طبقة PDMS.

بعد ذلك، استخدم مِخرم Harris unicorn بقطر 2.5 millimeter لعمل فتحات وصول للسوائل عند كلا طرفي القناة في الـ PDMS المستخرج من القالب الرئيسي. قم بقص قرصي الـ PDMS إلى شرائح ذات أحجام متماثلة. ثم في غرفة نظيفة، ضع القناة، وشريحة الـ PDMS الفارغة، وشريحة زجاجية في جهاز مؤكسد بالبلازما.

عرّض المواد لبلازما الأكسجين بقدرة 40 watts لمدة 40 seconds. ثم ثبّت قطعة القناة والشريحة الزجاجية على جانبين متقابلين من الشريط الفارغ، واترك المواد جانباً لإتمام عملية الربط. بعد مرور ساعتين، استخدم البوليمر المسبق PDMS لتوصيل قطعتين من الأنابيب البلاستيكية بطول ست بوصات على الأقل بالخزانات المثقوبة فوق لوح تسخين عند درجة حرارة 120 °C.

اترك الـ PDMS ليتصلب قبل المتابعة. بعد ذلك، قم بتثبيت موصل بلاستيكي للسوائل في أحد الأنابيب للسماح بتوصيل المحاقن. الآن، أدخل أسلاكاً نحاسية معزولة قياس 22 gauge بطول ثلاث بوصات في كل خزان بين أنبوب الإدخال والقناة، مع تثبيت الأسلاك باستخدام المزيد من بادئ بوليمر PDMS.

ابدأ هذه الخطوة بوضع القناة الدقيقة التي تم تجميعها للتو على منصة مجهر متحركة في محوري XY مزودة بكاميرا متصلة بشاشة، ثم قم بتوصيل مصدر الطاقة بأقطاب القناة الدقيقة. وبعد التأكد من أن مقاومة القناة الدقيقة تبلغ حوالي 0.6 mega ohms، قم بتوصيل أنبوب المخرج الخاص بالقناة الدقيقة بمحقنة تستخدم لمرة واحدة. ثم اغمر فوهة أنبوب المدخل في محلول من الديدان الخيطية المعلقة في محلول M nine المنظم الفسيولوجي.

قم بتطبيق ضغط سلبي داخل المحقنة لسحب السائل إلى القناة. عندما يمتلئ أنبوبا الدخول والخروج، افصل المحقنة والضاغط الهيدروستاتيكي. تحكم في التدفق عن طريق ضبط الارتفاع النسبي للأنابيب لوضع دودة في مركز القناة.

بعد ذلك، ضع كلا الأنبوبين بشكل مسطح وعلى نفس المستوى للحفاظ على تدفق صفري داخل القناة الدقيقة. عند تبديل عينات الديدان أثناء تجربة التaksi الكهربائي، وبعد تسوية كلا أنبوبي الإدخال على نفس المستوى، إذا استمر التدفق، قم بإجراء تعديلات طفيفة على ارتفاع الأنابيب بالنسبة لبعضها البعض. وإذا ساورنا الشك في كون التدفق صفرياً حقاً، يمكننا تحفيز عكس في حركة الدودة عن طريق تغيير قطبية المجال الكهربائي، ثم تقييم السرعة الخطية للدودة أثناء استدارتها.

الآن، اضبط مزود الطاقة على الجهد الكهربائي المناسب. قم بتفعيل الإشارة الكهربائية واترك دقيقة واحدة من التعرض المسبق ليتأقلم الدود مع المجال، وخلال هذا الوقت يجب أن يبدأ الدود في التحرك نحو الكاثود عند مرور الدقيقة. ابدأ التسجيل.

عند الانتهاء من التجربة، قم بإزالة جميع السوائل والديدان من القناة. اشطف الغرفة بالماء منزوع الأيونات واترك الجهاز على لوح تسخين عند 125 درجة مئوية ليجف. في هذا الفيديو التمثيلي، تظهر ديدان نيماتودا بالغة شابة من النوع البري على محور كهربائي، بالإضافة إلى مخرجات الموقع والسرعة من برنامج تتبع الديدان.

يبدأ الفيديو بوجود الكاثود على اليمين. يشير ظهور الماصة الزجاجية إلى عكس الاتجاه الوشيك، ومن ثم فإن إزالة الماصة تعطي الإشارة البدء. في لحظة العكس هنا، تُعرض بيانات الموضع مقابل الزمن والسرعة اللحظية مقابل الزمن الناتجة عن برنامج تتبع الديدان المخصص للدودة الموجودة في الفيديو؛ حيث قام البرنامج بحساب منحنى السرعة بناءً على منحنى الموضع والزمن.

يعرض مخطط الصندوق هذا بيانات السرعة الكهربائية لمجموعة من الحيوانات من النوع البري والحيوانات المعدلة وراثياً. تعبر الحيوانات المعدلة وراثياً T عن جين alpha-synuclein البشري في عضلات جدار الجسم تحت تحكم محفز جين UNC 54 لسلسلة الميوزين الثقيلة، مما يؤدي إلى تجمع البروتين ويظهر في شكل استجابة تكتيكية كهربائية أبطأ من استجابة حيوانات النوع البري. بمجرد إتقان هذه الطريقة، يمكن فحص أكثر من 20 دودة كل ساعة إذا تم إجراء تجربة التوجه الكهربائي بشكل صحيح.

أثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر أن الطفرات والمواد الكيميائية التي تؤثر على الحركة أو الاستشعار الكهربائي فقط هي التي ستنتج أنماطاً ظاهرية يمكن اكتشافها بواسطة مقايسة الانجذاب الكهربائي. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تشكيل السيليكون، وتجميع قناة الموائع الدقيقة، وكيفية تحليل حركة N method باستخدام مقايسة axxis.