إعداد الحويصلية عملاق التصوير والتصحيح، المشبك الكهربية

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحضير حويصلات صفائحية أحادية عملاقة بطريقة متوافقة مع السلامة الوظيفية لبروتينات الغشاء المدمجة في غشاء الحويصلة. يتم تحقيق ذلك عن طريق ترسيب الدهون أو الجسيمات الشحمية الصغيرة أولا على سطح موصل مثل شريحة زجاجية مطلية ب ITO. الخطوة الثانية هي تبخير المذيب بطريقة خاضعة للرقابة لتحقيق طبقة دهنية موحدة على السطح الموصل.

بعد ذلك ، قم بإعادة ترطيب الطبقة الدهنية بعناية في مخزن مؤقت مناسب وقم بإعداد غرفة التكوين الكهربائي. الخطوة الأخيرة هي تطبيق جهد متذبذب عبر الطبقة الدهنية لتوليد حويصلات ميلر العملاقة. في النهاية ، سيتم تصوير الحويصلات لتحديد حجمها وجودتها ومقارنتها بالحويصلات التي تشكلت باستخدام تقنية كلاسيكية.

العرض المرئي لهذا البروتوكول مفيدا لأن ترسب الدهون قد يكون من الصعب إتقانه ، ويعتمد على العديد من المتغيرات وهو أفضل اختبار عن طريق الفحص البصري. قبل البدء في هذا الإجراء ، قم بإزالة الدهون من التخزين عند 20 درجة مئوية تحت الصفر أو 80 درجة مئوية تحت الصفر ودفئتها إلى درجة حرارة الغرفة. إذا أمكن ، قم بإجراء التجربة في جو غاز خامل مثل صندوق القفازات.

بعد ذلك ، قم بتغطية الدهون بغاز الأرجون الجاف أو غاز النيتروجين وقلل في جميع الخطوات من التعرض للهواء. إذا لم يتم توفير الدهون في مذيب عضوي ، فقم بتعليق 0.3 ملليغرام من الدهون في الكلوروفورم أو سيكلو هين عند 10 ملليغرام لكل ملليلتر. لاحظ أن الشركات المصنعة ذكرت أن التركيزات عادة ما تكون اسمية فقط.

استخدم الإيثانول لتنظيف كلا الجانبين من شرائح زجاجية مطلية ب 2 25 ملم × 37.5 ملم ITO. ثم أضف 0.1 في المائة من Texas red DPPE إلى الدهون للتصوير الفلوري. قم بقياس مقاومة السطح بمقياس متعدد للتحقق من أن الجانب المطلي ب ITO من الشرائح الزجاجية متجها لأعلى ، وهو ما يشار إليه بمقاومة بضع مئات من الأوم.

استنشق الدهون في حقنة مقاومة للمذيبات مع إبرة المحقنة التي لا تلامس سطح ITO تماما. ضع الدهون ببطء عن طريق تحريك الإبرة ذهابا وإيابا عبر الشريحة. قم بتغطية السطح بالتساوي ، بحثا عن لمعان قوس قزح على السطح الزجاجي.

بعد ذلك ، ضع الشرائح بسرعة في فراغ يجفف وضخ الغرفة إلى أقل من فراغ واحد لمدة 0.5 إلى ساعة واحدة. لإزالة أي مذيب أثري. حرر الفراغ بغاز خامل.

ضع طبقة رقيقة من شحم السيليكون على جانبي حشية السيليكون ثم ضع الحشية على الشريحة. اترك ما لا يقل عن خمسة ملليمترات من الشريحة المكشوفة مكشوفة في أحد طرفي الشريحة. بعد ذلك ، قم بترطيب كل بئر بعناية عن طريق وضع إبرة حقنة قياس 27 على حافة الحشية وقم بتطبيق المخزن المؤقت ببطء ملء كل حشية جيدا بنسبة 10٪ تقريبا بثلاثة أكوام مللي مولار.

بمجرد ترطيب الدهون ، تابع بسرعة من خلال الخطوات المتبقية. نظرا لأن الأفلام الدهنية تبدأ في التفكك ، تحقق على الفور من الجانب الموصل للشريحة باستخدام المقياس المتعدد. ثم قم بتطبيق الوجه الموصل لشريحة ITO الثانية في الجزء العلوي من الحشية.

تأكد من وجود خمسة ملليمترات على الأقل من البروز خارج منطقة الحشية ومقابل الجزء المتدلي الأول ، واضغط برفق لضمان إحكام الغلق الجيد. نظف الأجزاء المتدلية باستخدام الإيثانول. الآن قم بتأمين شطيرة منزلق ITO على جهات الاتصال الكهربائية مثل قضبان النحاس أو رغوة الحشية.

يوضح هذا الرسم عرضا متفجرا للغرفة ومجموعة جهات الاتصال كمرجع. يمكن العثور على الخطط التفصيلية في بروتوكول النص باستخدام مقياس متعدد. تحقق من عدم وجود قصر كهربائي بين جهات الاتصال وأن جهات الاتصال تتصل بشكل صحيح بأسطح ITO.

بعد ذلك ، ضع حجرة التكوين الكهربائي في فرن وقم بتسخين الغرفة 10 درجات مئوية فوق أعلى درجة حرارة انصهار لأي من الدهون الموجودة. قم بقياس الفجوة بين السطحين المطليين ب ITO لتحديد سعة الموجة الجيبية. يجب أن يكون سعة الموجة الجيبية حوالي 0.7 فولت RMS لكل فجوة ملليمترية بين أسطح ITO ، قم بتطبيق موجة جيبية 10 هرتز لمدة 60 إلى 90 دقيقة.

قم بتوصيل المولد بغرفة التكوين الكهربائي وقم بتأكيد الجهد بمقياس متعدد. بعد 60 إلى 90 دقيقة من التكوين الكهربائي ، يجب أن تتشكل حويصلات عملاقة مفردة. استخدم مجهرا مقلوبا مزودا بمكعب مرشح لصبغة تكساس الحمراء لتصوير الجسيمات الشحمية.

يجب أن يكون الجسيم الشحمي كرويا ، في الغالب إيلا بالعين وخاليا من العيوب مثل الخيوط المتدلية من الجسيم الشحمي. غطت الخطوات السابقة التحضير الكلاسيكي للجسيمات الشحمية العملاقة من الدهون النقية. يظهر تحضير أكثر تحديا باستخدام الجسيمات الشحمية الصغيرة.

بعد ذلك أولا ، قم بإعداد محلول كربونات البوتاسيوم المشبع بنسبة 44٪ رطوبة نسبية عند 20 درجة مئوية. استخدم وعاء بلاستيكي من الزبادي والجرانولا مع كوب علوي متداخل تم تعديله بثقوب في الكوب العلوي. ضع محلول الملح المشبع والملح الزائد في وعاء قابل للغلق بإحكام مع رف داخلي.

استبدل الرف بعد التعبئة وتأكد من أن السائل من خمسة إلى 10 ملليمترات أسفل الرف. ضع مستشعر الرطوبة في شق في جانب الحاوية. نظف جانبي الشرائح الزجاجية المطلية ب ITO بالإيثانول.

استخدم جهاز القياس المتعدد لتحديد الجانب الموصل وقم بتسمية الجانب غير الموصل باسم العينة. بعد ذلك ، قم بتشحيم جانبي حشية سيليكون واحدة أو متعددة. ضع الشريحة الموصلة ، وقم بوضع على المقعد وقم بتطبيق حشوات السيليكون على كل شريحة سيتم تطبيق الدهون عليها.

التأكد من وجود ما لا يقل عن خمسة ملليمترات من الشريحة المكشوفة في أحد طرفيها للاتصال بجهاز التكوين الكهربائي. قم بتنعيم الحشية لضمان إحكام جيد ، وقم بتخفيف مستحضر الحويصلة في المخزن المؤقت منخفض الملح إلى ما يقرب من ملليغرام إلى ملليغرامين لكل ملليلتر. ضع الدهون على الشريحة في قطرة واحدة إلى 10 ميكرولتر.

ضع الشريحة على الرف الداخلي فوق محلول الملح المشبع وأغلق الحاوية بإحكام. اتركيه في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث ساعات إلى ليلة كاملة. يمكن الآن استخدام الشريحة للتكوين الكهربائي للجسيمات الشحمية العملاقة كما هو موضح سابقا في البروتوكول الكلاسيكي.

لاحظ مظهر قوس قزح للرواسب الفردية. تظهر هذه الصورة الجسيمات الشحمية الكهربائية المتكونة من الدهون المترسبة من الكلوروفورم ، وتشير الأسهم إلى الجسيمات الشحمية العملاقة. تحتوي هذه الصورة على عدد قليل جدا من المناطق الضبابية وبالتالي تشير إلى إعداد جيد.

تحتوي هذه الصورة التالية على العديد من المناطق الغامضة وبالتالي تشير إلى سوء التحضير بشكل عام. لاحظ أن السهم الثاني يشير إلى منطقة بها جسيمات شحمية سيئة التمييز وأنه لا يمكن التركيز على الجسيمات الشحمية في المنطقة المشار إليها بالسهم الثالث. يظهر هنا تكبير 10 × للجسيمات الشحمية التي تشكلت بنجاح من الدهون المترسبة عن طريق جفاف الجسيمات الشحمية الصغيرة.

تشير الأسهم إلى ثلاثة جسيمات شحمية عالية الجودة يتراوح حجمها من حوالي خمسة إلى 20 ميكرومتر بتكبير 40 ×. يمكن رؤية حلقة واضحة على حافة الجسيم الشحمي ، مما يشير إلى وجود جسيم شحمي أحادي أو شبه قطني. يتم تصوير الكابسيسين المنشط TR PV واحد التيارات الأيونية المسجلة في بقع الغشاء الدهني المستقاة من الجسيمات الشحمية العملاقة المتشكلة.

أشار تيار التسرب إلى مقاومة ختم 500 ميجا قبل إضافة الكابسيسين. تشبع الكابسيسين تنشيط كبير T RRP V واحد التيار. يتم غسل العودة الحالية إلى خط الأساس القريب ككابسيسين من التصحيح أثناء محاولة هذا الإجراء.

من المهم أن تظل مرنا لأن العديد من العوامل تؤثر على كيفية جفاف الدهون وتشكيل طبقة متساوية على الركيزة الزجاجية. استشر قسم استكشاف الأخطاء وإصلاحها عبر الإنترنت وقم بتغيير درجة الحرارة والرطوبة وتركيز الدهون وحجم القطرات لتحقيق أفضل النتائج.