مقدمة عن قارئ الأطباق الدقيقة
يعد قارئ الأطباق الدقيقة (microplate reader) جهازاً متعدد الأنماط يسمح بإجراء وقياس مجموعة متنوعة من التجارب في آن واحد. ويمكن لقارئات الأطباق الدقيقة…
يعتبر قارئ الأطباق الدقيقة جهازاً واسع الاستخدام يتيح قياس العديد من العينات في وقت واحد، كما لو كانت هناك العديد من التجارب المتناهية الصغر تُجرى في آن واحد.
يُستخدم هذا الجهاز بالتزامن مع الأطباق متعددة الآبار، مثل الطبق المكون من 96 بئراً.
وبغض النظر عن نوع التجربة التي يتم إجراؤها باستخدام قارئ الأطباق الدقيقة، غالباً ما تُستخدم منحنيات القياس لتحديد قيمة العينات التجريبية، بالإضافة إلى ضوابط إيجابية وسلبية.
تتوفر أجهزة قراءة الأطباق الدقيقة (Microplate readers) بأشكال وأحجام وتكوينات مختلفة. وتتمتع العديد من هذه الأجهزة بقدرات متعددة الأنماط تتيح إجراء العديد من المقايسات المختلفة. وتشمل هذه الأنماط القدرة على إجراء أنواع مختلفة من القياسات، مثل قياسات الامتصاص والفلورية والتلألؤ البيولوجي.
تُعد الأطباق متعددة الآبار مكونات أساسية لجهاز قراءة الأطباق الدقيقة، وتُستخدم لحفظ العينات التي يتم قياسها بواسطة الجهاز. ويمكن أن تختلف هذه الأطباق في أحجامها، وأنواع قواعد الآبار، وعدد الآبار. ويعتمد نوع الطبق المستخدم على نوع المقايسة.
تُستخدم صينية التحميل لإدخال الطبق ذو الـ 96 بئرًا إلى داخل الجهاز.
تُستخدم عادةً واجهة حاسوبية لتشغيل قارئ الأطباق والتحكم في إعداداته ومعاييره، مثل الطول الموجي والنمط. ويتضمن برنامج قارئ الأطباق واجهة مستخدم رسومية للطبق تتيح لك تحديد الآبار التي تم تحميلها بالعينات.
غالبًا ما تُستخدم الماصات متعددة القنوات لتعبئة الأطباق متعددة الآبار. وتحتفظ الخزانات بالمحاليل المخصصة للماصة متعددة القنوات.
يمكن أحيانًا تعبئة الآبار باستخدام ماصة قياسية أحادية القناة.
يتم تحميل العينات والمعايير إما في مكررات ثنائية أو ثلاثية لتعويض أي أخطاء في عملية الماصة. تظهر هنا لوحة تم تحميلها في مكررات ثلاثية.
يستخدم منحنى المعايرة عينات ذات تركيزات معروفة، والتي تعطي قيم امتصاص مختلفة. تُستخدم هذه البيانات بعد ذلك لإنشاء رسم بياني يتم من خلاله توليد خط أفضل مطابقة.
تُستخدم العينة الفارغة (blank) لتحديد مدى القياس غير ذي الصلة تجريبيًا والذي يعود إلى المحاليل المنظمة التي تم تخفيف العينة فيها أو الكواشف التي تعرضت لها العينة. وتسمى القيم التي يتم الحصول عليها من هذه القياسات بـ "الخلفية" (background). ولا تحتوي العينة الفارغة على أي عينة.
يشير الضابط الموجب إلى ما إذا كان المقايسة قد عملت بشكل صحيح، حيث يعطي نتيجة جيدة. أما الضابط السالب فهو متغير ضابط لا يُتوقع ملاحظة أي قياس أو تأثير عنده، ولا ينبغي أن يعطي أي نتيجة.
بمجرد إعداد الطبق، يحين وقت تحميل العينات. ولمنع قياس عينات خاطئة أو تحميل الطبق بطريقة غير صحيحة، من الضروري توجيه الطبق بشكل صحيح في صينية التحميل. تذكر توخي الحذر عند تحميل العينات في الصينية، حتى لا يتم دفع الصينية بقوة داخل الجهاز أو تعلق الأطراف داخل الجهاز.
بمجرد تحميل الصينية، يتم ضبط المعلمات مثل الوضع، والطول الموجي، وترتيب تحميل الآبار في البرنامج قبل قراءة الطبق.
بعد ضبط المعلمات، يتم قراءة الطبق، ويقوم القارئ بتوليد مخرجات للقيم داخل البرنامج.
بمجرد قراءة الطبق، استخدم القيمة المتوسطة للعينات الفارغة لطرح الخلفية من جميع العينات، بما في ذلك منحنى المعايرة.
بعد القراءة، يتم رسم قيم التركيز المعروفة للمعايير مقابل القيم المقاسة المقابلة لها، وهي الامتصاص في هذه الحالة.
عند رسم القيم، يمكن حساب خط أفضل مطابقة باستخدام الانحدار الخطي. ويمكن القيام بذلك بسهولة باستخدام برنامج جداول البيانات.
يجب أن يكون معامل التحديد، وهو مقياس إحصائي لمدى قدرة الخط على التنبؤ بنقاط البيانات الفعلية، بين 0.90-0.99، حيث تُعتبر القيمة 0.99 هي القيمة الأفضل وتشير إلى أن الخط يطابق البيانات تمامًا.
باستخدام خط أفضل مطابقة، يمكننا حساب قيم التركيز للعينات التجريبية أو الضوابط في كل بئر عن طريق تعويض قيمة الامتصاص في Y ثم حل المعادلة لإيجاد X. يمكن أيضًا تقدير قيم التركيز عن طريق رسم خط من قيمة الامتصاص على محور Y إلى خط أفضل مطابقة ثم نزولاً إلى محور X.
تقيس أنواع عديدة من أجهزة قراءة الأطباق الدقيقة الامتصاصية، والتي تُعرف بأنها النسبة اللوغاريتمية للضوء الساقط على جسم ما إلى الضوء النافذ من خلاله.
ويعد مقايسة برادفورد (Bradford assay) مثالاً على المقايسات القائمة على قياس الامتصاص باستخدام أجهزة قراءة الأطباق الدقيقة، حيث تُضاف عينات البروتين إلى الطبق مع كاشف "Bradford". ويرتبط هذا المركب بالبروتينات الموجودة في العينة، مما يسبب إزاحة في امتصاصيتها.
وفي المقايسات القائمة على الفلورة، يتم تنشيط الفلوركروم بواسطة طول موجي معين من الضوء، مما يؤدي بدوره إلى استثارة الفلوركروم الذي يبعث ضوءاً بطول موجي مختلف.
عند العمل مع الكواشف الحساسة للضوء، تأكد من إبقائها مغطاة لمنع التبييض الضوئي وإتلاف التجربة.
أما المقايسات اللومينية فتبعث الضوء عبر تفاعل كيميائي وغالباً ما تستخدم إنزيم اللوسيفيراز (luciferase). ويأتي اللوسيفيراز من مصادر متعددة مثل اليراعات. وفي تفاعل اللوسيفيراز، ينبعث الضوء عندما يلتقي اللوسيفيراز مع الأكسجين وATP والمغنيسيوم في سلسلة من التفاعلات.
وللمقايسات اللومينية تطبيقات متنوعة عديدة، ومن الأمثلة على ذلك قياس إنتاج والكشف عن أنواع الأكسجين التفاعلية في السرطانات.
وتشمل التطبيقات الأخرى التي تستخدم أجهزة قراءة الأطباق الدقيقة المقايسات عالية الإنتاجية التي تستخدم أطباقاً ذات 384 و1536 بئراً. وفي هذه المقايسات، يتم تحميل الأطباق بواسطة روبوت؛ والمقصود هنا هو روبوت قابل للبرمجة يقوم بأتمتة مناولة العينات بدقة فائقة.
لقد شاهدت للتو مقدمة JoVE عن قارئ الأطباق الدقيقة. في هذا الفيديو، عرضنا ما هو قارئ الأطباق الدقيقة(A)، وكيفية استخدامه(B)، وكيفية تشغيل هذا الجهاز(C)، وكيفية تفسير بيانات قارئ الأطباق الدقيقة، وبعض التطبيقات التي تستخدم قارئ الأطباق الدقيقة(D). شكرًا للمشاهدة.
تسجيل الدخول أو للوصول إلى المحتوى الكامل. تعرّف على المزيد حول وصول مؤسستك إلى محتوى JoVE هنا
يعتبر قارئ الأطباق الدقيقة جهازاً واسع الاستخدام يتيح قياس العديد من العينات في وقت واحد، كما لو كانت هناك العديد من التجارب المتناهية الصغر تُجرى في آن واحد.
يُستخدم هذا الجهاز بالتزامن مع الأطباق متعددة الآبار، مثل الطبق المكون من 96 بئراً.
وبغض النظر عن نوع التجربة التي يتم إجراؤها باستخدام قارئ الأطباق الدقيقة، غالباً ما تُستخدم منحنيات القياس لتحديد قيمة العينات التجريبية، بالإضافة إلى ضوابط إيجابية وسلبية.
تتوفر أجهزة قراءة الأطباق الدقيقة (Microplate readers) بأشكال وأحجام وتكوينات مختلفة. وتتمتع العديد من هذه الأجهزة بقدرات متعددة الأنماط تتيح إجراء العديد من المقايسات المختلفة. وتشمل هذه الأنماط القدرة على إجراء أنواع مختلفة من القياسات، مثل قياسات الامتصاص والفلورية والتلألؤ البيولوجي.
تُعد الأطباق متعددة الآبار مكونات أساسية لجهاز قراءة الأطباق الدقيقة، وتُستخدم لحفظ العينات التي يتم قياسها بواسطة الجهاز. ويمكن أن تختلف هذه الأطباق في أحجامها، وأنواع قواعد الآبار، وعدد الآبار. ويعتمد نوع الطبق المستخدم على نوع المقايسة.
تُستخدم صينية التحميل لإدخال الطبق ذو الـ 96 بئرًا إلى داخل الجهاز.
تُستخدم عادةً واجهة حاسوبية لتشغيل قارئ الأطباق والتحكم في إعداداته ومعاييره، مثل الطول الموجي والنمط. ويتضمن برنامج قارئ الأطباق واجهة مستخدم رسومية للطبق تتيح لك تحديد الآبار التي تم تحميلها بالعينات.
غالبًا ما تُستخدم الماصات متعددة القنوات لتعبئة الأطباق متعددة الآبار. وتحتفظ الخزانات بالمحاليل المخصصة للماصة متعددة القنوات.
يمكن أحيانًا تعبئة الآبار باستخدام ماصة قياسية أحادية القناة.
يتم تحميل العينات والمعايير إما في مكررات ثنائية أو ثلاثية لتعويض أي أخطاء في عملية الماصة. تظهر هنا لوحة تم تحميلها في مكررات ثلاثية.
يستخدم منحنى المعايرة عينات ذات تركيزات معروفة، والتي تعطي قيم امتصاص مختلفة. تُستخدم هذه البيانات بعد ذلك لإنشاء رسم بياني يتم من خلاله توليد خط أفضل مطابقة.
تُستخدم العينة الفارغة (blank) لتحديد مدى القياس غير ذي الصلة تجريبيًا والذي يعود إلى المحاليل المنظمة التي تم تخفيف العينة فيها أو الكواشف التي تعرضت لها العينة. وتسمى القيم التي يتم الحصول عليها من هذه القياسات بـ "الخلفية" (background). ولا تحتوي العينة الفارغة على أي عينة.
يشير الضابط الموجب إلى ما إذا كان المقايسة قد عملت بشكل صحيح، حيث يعطي نتيجة جيدة. أما الضابط السالب فهو متغير ضابط لا يُتوقع ملاحظة أي قياس أو تأثير عنده، ولا ينبغي أن يعطي أي نتيجة.
بمجرد إعداد الطبق، يحين وقت تحميل العينات. ولمنع قياس عينات خاطئة أو تحميل الطبق بطريقة غير صحيحة، من الضروري توجيه الطبق بشكل صحيح في صينية التحميل. تذكر توخي الحذر عند تحميل العينات في الصينية، حتى لا يتم دفع الصينية بقوة داخل الجهاز أو تعلق الأطراف داخل الجهاز.
بمجرد تحميل الصينية، يتم ضبط المعلمات مثل الوضع، والطول الموجي، وترتيب تحميل الآبار في البرنامج قبل قراءة الطبق.
بعد ضبط المعلمات، يتم قراءة الطبق، ويقوم القارئ بتوليد مخرجات للقيم داخل البرنامج.
بمجرد قراءة الطبق، استخدم القيمة المتوسطة للعينات الفارغة لطرح الخلفية من جميع العينات، بما في ذلك منحنى المعايرة.
بعد القراءة، يتم رسم قيم التركيز المعروفة للمعايير مقابل القيم المقاسة المقابلة لها، وهي الامتصاص في هذه الحالة.
عند رسم القيم، يمكن حساب خط أفضل مطابقة باستخدام الانحدار الخطي. ويمكن القيام بذلك بسهولة باستخدام برنامج جداول البيانات.
يجب أن يكون معامل التحديد، وهو مقياس إحصائي لمدى قدرة الخط على التنبؤ بنقاط البيانات الفعلية، بين 0.90-0.99، حيث تُعتبر القيمة 0.99 هي القيمة الأفضل وتشير إلى أن الخط يطابق البيانات تمامًا.
باستخدام خط أفضل مطابقة، يمكننا حساب قيم التركيز للعينات التجريبية أو الضوابط في كل بئر عن طريق تعويض قيمة الامتصاص في Y ثم حل المعادلة لإيجاد X. يمكن أيضًا تقدير قيم التركيز عن طريق رسم خط من قيمة الامتصاص على محور Y إلى خط أفضل مطابقة ثم نزولاً إلى محور X.
تقيس أنواع عديدة من أجهزة قراءة الأطباق الدقيقة الامتصاصية، والتي تُعرف بأنها النسبة اللوغاريتمية للضوء الساقط على جسم ما إلى الضوء النافذ من خلاله.
ويعد مقايسة برادفورد (Bradford assay) مثالاً على المقايسات القائمة على قياس الامتصاص باستخدام أجهزة قراءة الأطباق الدقيقة، حيث تُضاف عينات البروتين إلى الطبق مع كاشف "Bradford". ويرتبط هذا المركب بالبروتينات الموجودة في العينة، مما يسبب إزاحة في امتصاصيتها.
وفي المقايسات القائمة على الفلورة، يتم تنشيط الفلوركروم بواسطة طول موجي معين من الضوء، مما يؤدي بدوره إلى استثارة الفلوركروم الذي يبعث ضوءاً بطول موجي مختلف.
عند العمل مع الكواشف الحساسة للضوء، تأكد من إبقائها مغطاة لمنع التبييض الضوئي وإتلاف التجربة.
أما المقايسات اللومينية فتبعث الضوء عبر تفاعل كيميائي وغالباً ما تستخدم إنزيم اللوسيفيراز (luciferase). ويأتي اللوسيفيراز من مصادر متعددة مثل اليراعات. وفي تفاعل اللوسيفيراز، ينبعث الضوء عندما يلتقي اللوسيفيراز مع الأكسجين وATP والمغنيسيوم في سلسلة من التفاعلات.
وللمقايسات اللومينية تطبيقات متنوعة عديدة، ومن الأمثلة على ذلك قياس إنتاج والكشف عن أنواع الأكسجين التفاعلية في السرطانات.
وتشمل التطبيقات الأخرى التي تستخدم أجهزة قراءة الأطباق الدقيقة المقايسات عالية الإنتاجية التي تستخدم أطباقاً ذات 384 و1536 بئراً. وفي هذه المقايسات، يتم تحميل الأطباق بواسطة روبوت؛ والمقصود هنا هو روبوت قابل للبرمجة يقوم بأتمتة مناولة العينات بدقة فائقة.
لقد شاهدت للتو مقدمة JoVE عن قارئ الأطباق الدقيقة. في هذا الفيديو، عرضنا ما هو قارئ الأطباق الدقيقة(A)، وكيفية استخدامه(B)، وكيفية تشغيل هذا الجهاز(C)، وكيفية تفسير بيانات قارئ الأطباق الدقيقة، وبعض التطبيقات التي تستخدم قارئ الأطباق الدقيقة(D). شكرًا للمشاهدة.
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is a microplate reader and how does it work?
A microplate reader is an instrument that simultaneously measures many samples using multiwell plates, such as 96-well plates. It performs multiple miniature experiments at once by detecting different types of measurements including absorbance, fluorescence, and luminescence. The computer interface controls settings like wavelength and mode to automate sample analysis across all wells.
Q2: Why are standard curves used in microplate reader assays?
Standard curves determine experimental sample values by using samples with known concentrations that yield different absorbance values. A line of best fit is generated from this data, allowing unknown sample concentrations to be calculated or estimated. The coefficient of determination should be between 0.90-0.99 to ensure the line accurately predicts actual data points.
Q3: What role do controls play in microplate reader experiments?
Blanks determine background measurement not related to the experiment, using buffers or reagents without samples. Positive controls confirm the assay worked properly by yielding expected results. Negative controls show no measurement or effect should occur. Together, these controls validate assay accuracy and identify any experimental errors or contamination.
Q4: How should samples be loaded into a microplate for accurate results?
Samples and standards are loaded in duplicate or triplicate to account for pipetting errors. Multichannel pipettes are often used for efficient loading, though single-channel pipettes work for individual wells. Proper plate orientation in the loading tray is critical to prevent measuring wrong samples. Exercise caution when loading to avoid forcing the tray or catching extremities in the instrument.
Q5: What are the different measurement types available on multimodal microplate readers?
Multimodal microplate readers can perform absorbance measurements, which detect light transmitted through samples; fluorescence measurements, where a fluorochrome is excited by light and emits at a different wavelength; and luminescence measurements, which detect light from chemical reactions like luciferase. Light-sensitive reagents must be kept covered to prevent photobleaching and preserve experiment integrity.
Q6: How is background subtraction performed after reading a microplate?
After the plate is read, the average value of blank samples is calculated and subtracted from all sample measurements, including the standard curve. This removes background noise caused by buffers or reagents not related to the experiment. Background subtraction ensures that measured values reflect only the experimental signal of interest.
Q7: What are common applications of microplate readers in research?
Microplate readers quantify protein levels, measure gene expression, and detect metabolic processes such as reactive oxygen species production in cancer research and calcium flux. High-throughput assays using 384- and 1536-well plates employ programmable robots for automated, precise sample handling. These applications enable rapid analysis of thousands of samples simultaneously.