بعد تضمين التعريف Immunogold من البروتينات متشابك في الثقافات شريحة الحصين

الهدف العام من هذا الإجراء هو إجراء وضع العلامات على ImmunoGold لتحديد التوطين الهيكلي الفائق للبروتينات المشبكية في الحصين الفئران CA الخلايا العصبية البارافلزية. يتم تحقيق ذلك عن طريق إزالة منطقة CA الأولى من شريحة النمط العضوي ، وتقليم الزاوية العلوية لتذكر الاتجاه الصحيح واحتضانها في مثبت خال من الأوزميوم على الجليد. الخطوة الثانية هي تجفيف الأنسجة الثابتة والسماح لها بالتصلب عن طريق التسلل إليها بالراتنج.

بعد ذلك ، يتم قطع الأقسام الرقيقة جدا من الأنسجة المضمنة في الراتنج ، ويتم وضعها على شبكات النيكل. الخطوة الأخيرة هي إجراء الكيمياء المناعية على أنسجة المقطع. في النهاية ، يتم استخدام المجهر الإلكتروني المناعي لتحديد توطين البروتينات في المشبب. حسنًا.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال اللدونة المشبكية ، مثل كيف يمكن أن تساعد توطين البروتينات داخل العمود الفقري المتغصني في فهم دورها في الوظيفة المتشابكة. على الرغم من أن هذه الطريقة محسنة لشرائح الحصين العضوية ، إلا أنها يمكن أن تكون ذات قيمة كبيرة للمستحضرات العصبية الأخرى ، بما في ذلك شرائح الدماغ الحادة والثقافات العصبية الأولية. ابدأ هذا الإجراء بوضع شريحة الحصين العضوية في طبق بتري من البوليسترين يحتوي على عازلة الفوسفات الطازجة المثلجة المثلجة.

أضف ملليلترا إلى ملليلترين إضافيين من المخزن المؤقت المثلج مباشرة فوق الشرائح. من أجل عزل الحقل الفرعي للشريحة CA ، استخدم مشرطا يمكن التخلص منه لقطع الشريحة بلطف بجوار التلفيف المسنن ، والذي يكون موازيا لطبقة الخلية الواحدة CA. ثم قم بقص الشريحة المتبقية عموديا لإزالة الحقل الفرعي CA الثلاثة والسولو.

بعد ذلك ، قم بقص زاوية من CA شريحة واحدة للمساعدة في تحديد السطح العلوي للأنسجة وإزالة الأنسجة بعناية من الغشاء باستخدام الجانب الخلفي من المشرط. انقل الأنسجة برفق إلى صفيحة 12 بئر تحتوي على عازلة سورينسن المثلجة. قم بإزالة المخزن المؤقت وأضف 0.5 إلى مليلتر واحد من المثبت المثلج البارد عند درجة الحموضة 7.3 المخفف في عازلة سورينسن بحيث يغطي العينة بشكل كاف.

ثم احتضن لمدة ساعتين عند أربع درجات مئوية. بعد الحضانة ، قم بإزالة المثبت من البئر وغسل العينات ثلاث مرات لمدة 20 دقيقة في محلول سورينسن المثلج. ثم احتضان العينة بوزن حمض التانيك 1٪ لكل حجم في محلول مالات 0.1 مولار عند درجة حموضة 6.0.

بعد 40 دقيقة ، اشطف حمض التانيك عن طريق غسل العينة مرتين لمدة 20 دقيقة في مخزن مالات. بعد ذلك ، احتضان العينة لمدة 40 دقيقة في أسيتات المبولة 1٪ في أسيتات المبولة العازلة مالات حساسة للضوء ومشعة. لذا تعامل بحذر وضع العينة في الظلام عند أربع درجات مئوية أثناء الحضانة.

بعد الحضانة ، اشطف العينات مرتين لمدة 20 دقيقة لكل منها في محلول مالات مثلج بارد ، ثم احتضانه لمدة 20 دقيقة في 0.5٪ كلوريد البلاتين في عازلة النزلاء. أخيرا ، اشطف أي بقايا من كلوريد البلاتين عن طريق الغسيل مرتين لمدة 20 دقيقة. يقوم كل سجين بتخزين العينات في مخزن مؤقت مالات عند أربع درجات مئوية حتى تصبح جاهزة لمزيد من المعالجة.

لبدء الكيمياء المناعية ، يتم أولا تضمين الراتنج المجفف في مناطق CA one للحصول على أقسام رقيقة للغاية 60 نانومتر على شبكات النيكل كما هو موضح في بروتوكول النص لهذا الفيديو. بعد ذلك ، ضع قطرة من 1٪ من المخزن المؤقت للفوسفات 20 عند درجة الحموضة 7.5 على قطعة من الطفيلي النظيف. ثم التقط الشبكة برفق باستخدام ملقط نظيف وقم بتعويمها على المخزن المؤقت مع احتضان القسم لأسفل مثل هذا لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة بعد الحضانة ، واستنزاف السائل الزائد من الشبكة عن طريق وضع جانب القسم لأعلى على ورق الترشيح.

أيضا ، قم بإزالة أي محلول محاصر بين أذرع ملقط EM عن طريق فتل برفق بشظية من ورق الترشيح مع ضمان عدم جفاف الأقسام تماما. ثم ضع قطرة من 50 مللي مولار جلايسين على الفيلم الجزئي وقم بتعويم جانب قسم الشبكة لأسفل على محلول الجلايسين في درجة حرارة الغرفة. أثناء احتضان العينة لمدة 15 دقيقة ، أضف 2.5٪ مصل من الجسم المضاد الثانوي إلى محلول 2.5٪ من BSA وضع قطرة من هذا الخليط على الفيلم البارا.

بعد الحضانة لمدة 15 دقيقة ، جفف الشبكة بورق الترشيح والطفو على محلول الحجب لمدة 30 دقيقة. في درجة حرارة الغرفة ، قم بإعداد غرفة الحضانة عن طريق وضع مناديل كيم الملفوفة على طول طبق بتري بلاستيكي نظيف من الداخل. ضع قطعة من البارم النظيف في وسط طبق بتري ثم أضف الماء المصفى إلى مناديل كيم.

بعد ذلك ، ضع قطرة من محلول الجسم المضاد الأساسي على الشكل وقم بتعويم العينة عليه في درجة حرارة الغرفة أو طوال الليل عند أربع درجات مئوية ، يجب تحديد الوقت ودرجة الحرارة المثلى للحضانة بالإضافة إلى تركيز الجسم المضاد تجريبيا. بعد الحضانة بالجسم المضاد الأساسي ، اغسل الشبكة ثلاث مرات لمدة دقيقتين لكل منهما بمحلول فوسفات 1٪ من 20 فوسفات. ثم احتضن بجسم مضاد ثانوي باستخدام واحد إلى 20 مضادا للأرانب أو مناهضا للولايات المتحدة ، إلى جانب 10 نانومتر من الذهب بعد ساعة واحدة.

في درجة حرارة الغرفة ، اغسل ثلاث مرات لمدة دقيقتين لكل منهما بمحلول فوسفات 1٪ من 20 فوسفات. ثم بعد تثبيت العينة في 2٪ جلوتارالديهايد مخزن لمدة خمس دقائق. قم بإزالة الألدهيد الغليور الزائد عن طريق الشطف ثلاث مرات باستخدام 1٪ توين ، 20 مخزن فوسفات ، ثم ثلاث مرات بالشطف بالماء المصفى لمدة دقيقتين في كل مرة.

بمجرد شطفها ، احتضن الشبكة في أسيتات المبولة بنسبة 2٪ لمدة 10 دقائق. أثناء الحضانة ، قم بإعداد غرفة خالية من ثاني أكسيد الكربون عن طريق وضع قطعة من الطفيلي في وسط طبق بتري زجاجي. ثم ضع 10 إلى 15 حبة من هيدروكسيد الصوديوم في الطبق حول الطفيلي لامتصاص ثاني أكسيد الكربون2 في الهواء.

احتفظ بالجزء العلوي مغلقا لبضع دقائق. بعد ذلك ، استخدم ماصة المراعي وانقل بسرعة كمية صغيرة من محلول سترات رينولدز المحضر حديثا إلى الطفيلي. افتح الجزء العلوي بما يكفي لإدخال ماصة المراعي لتقليل إعادة إدخال ثاني أكسيد الكربون إلى الغرفة.

في ثلاث أكواب صغيرة ، قم بإعداد الماء الدافئ المغلي الطازج منزوع الأيونات ، واغسل أسيتات المبولة عن طريق غمس الشبكة في المنقار الأول وقم بتدويرها برفق لمدة 30 ثانية. كرر هذه الخطوة في الكأسين الآخرين. بمجرد شطفه ، افتح الجزء العلوي من طبق بتري الزجاجي بما يكفي لوضع الشبكة على قطرة محلول سترات رينولدز.

إذا أمكن ، ارتد قناعا أثناء القيام بذلك لتجنب استنشاق سترات الرصاص ولمنع تكون الرواسب. بعد 10 دقائق ، افتح الجزء العلوي قليلا وقم بإزالة الشبكة. اغسلها ثلاث مرات عن طريق غمسها بالتتابع في ثلاث أكواب طازجة من الماء المقطر الدافئ.

ثم اترك الشبكة تجف على قطعة من ورق الترشيح لأعلى. العينة جاهزة الآن للعرض باستخدام المجهر الإلكتروني ، أقسام الأنسجة الرقيقة للغاية في منطقة كاليفورنيا واحدة من الحصين الموضحة هنا كصورة مجهرية إلكترونية للإرسال تحتوي على تشعبات وأشواك يمكن تمييزها بسهولة من الخلايا العصبية شبه المعدنية. يتم تسهيل تحديد المشابك غير المتكافئة بين الطرف المحوري المعين ب T والعمود الفقري الشجيري المعين ب S من خلال وجود كثافة ما بعد التشابك وغشاء البلازما المحدد جيدا.

يمكن رؤية توزيع Grandin العصبي في العمود الفقري الشجيري بمساعدة وضع العلامات ImmunoGold EM ويتم التأكيد عليه في صور TEM هذه بواسطة الأسهم. يمكن قياس المسافة الشعاعية للجراندين العصبي من مركز العمود الفقري إلى غشاء البلازما للعمود الفقري على أنها المسافة الشعاعية الطبيعية. تتوافق المسافة التي تساوي صفرا مع جسيم يقع على الغشاء ، وتمثل قيمة المسافة التي تساوي واحدا جسيما في مركز العمود الفقري.

يمكن بعد ذلك إظهار مسافة الغراندين العصبي إلى العمود الفقري الشجيري بيانيا. هنا يظهر توزيعه كمسافة شعاعية طبيعية باللون الأزرق ، ومقارنة بالتوزيع العشوائي الموضح باللون الوردي ، يظهر هذا الرسم البياني أن العصبي Grandin يقع بالقرب من غشاء البلازما. مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين الذين يدرسون الجهاز العصبي لاستكشاف توطين وتوزيع مستقبلات البروتينات المتفاعلة مع المستقبلات والناقلات والقنوات الأيونية ، والعديد من الأنواع الأخرى في أنسجة المخ المختلفة ، بما في ذلك القشرة والمهاد والبصلة الشمية والمخيخ.

لا تنس أن العمل مع المثبتات يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء القفازات ومعطف المختبر والتعامل مع المثبتات في غطاء الفيلم أثناء تنفيذ هذا الإجراء.