الإنتاجية العالية فحص وظيفية باستخدام محلية الصنع ثنائي توهج luciferase الفحص

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد منظمات النسخ لأي جين ذي أهمية باستخدام بروتوكول تعداء بسيط عالي الإنتاجية ومقايسة لوسيفيراز مزدوج التوهج محلي الصنع. يتم تحقيق ذلك من خلال تصميم واستنساخ مجموعة فريدة من البلازميدات المزدوجة لوسيفيراز المراسلة. يتم نقل هذه البلازميدات إلى 2 9 3 خلايا T في صفيحة دقيقة مع بلازميدات من مكتبة تعبير الحمض النووي ، بحيث يتم نقل كل بئر ببلازميد مكتبة واحد.

بعد 48 ساعة ، يتم فحص نشاط لوسيفيراز Firefly ، متبوعا بفحص نشاط لوسيفيراز الفانيليا. الخطوة الأخيرة هي حساب نسب نشاط اليراع إلى الفانيليا لوسيفيراز. في النهاية ، التحريض النسبي للجين المعني استجابة لكل مكتبة.

يتم الاستدلال على الجين من خلال نسبة نشاط اليراع إلى نشاط لوسيفيراز الفانيليا في كل بئر بعد التطبيع القائم على اللوحة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على بروتوكولات فحص المراسل الحالية هي قدرتها على توليد البيانات الوظيفية بسرعة لعدد كبير من الجينات بأقل قدر من القوى العاملة والتكلفة. قبل يوم واحد من التعدي المحدد كيوم واحد من الشاشة ، يتم وضع 2 9 3 خلايا T في 96.

يتم تحديد حجم خلايا ألواح البئر وعدها وإعادة تعليقها إلى تركيز 1.5 في 10 إلى الخلايا الخامسة لكل مليلتر. في DMEM الذي يحتوي على 14٪ FBS ، صب الخلايا في خزان معقم. ضع الخزان بستة ألواح قاع شفافة و 96 لوحة بئر وصندوق من أطراف ماصة المرشح على سطح الروبوت لمعالج السوائل الآلي.

يجب وضع طبقتين من الخلايا لكل لوحة مكتبة ليتم فحصها. قم بتوزيع 100 ميكرولتر من الخلايا في كل بئر من كل صفيحة بكثافة 1.5 في 10 إلى الخلايا الرابعة لكل بئر. سيتم عرض ثلاث لوحات مكتبة في هذا العرض التوضيحي.

ومن ثم يتم تحضير ست ألواح من الخلايا لأجهزة الطرد المركزي لألواح الخلايا عند 50 مرة G لمدة دقيقتين باستخدام سرعات منحدر منخفضة لضمان كثافة الخلايا المتساوية في جميع أنحاء كل بئر. توضح هذه الصورة كيف يجب أن تعتني الخلايا المطلية بالطرد المركزي. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 10٪ ثاني أكسيد الكربون بين عشية وضحاها.

لتحضير بلازميدات اليراع والفانيليا ، قم بتخفيف كل منها إلى خمسة نانوغرام لكل ميكرولتر في الماء الخالي من السموم الداخلية في أنبوب مخروطي سعة 15 مل. امزج التخفيفات بنسبة خمسة إلى ثلاثة اليراع إلى بلازميد الفانيليا من حيث الحجم. يتم نقل البلازميدات المجمعة في كل بئر من لوحة بئر 96 بئر توزع 17 ميكرولترا لكل لوحة مكتبة ، بالإضافة إلى اثنين إلى 10 ميكرولتر زائدة في كل خلايا بئر في اليوم الثاني من الشاشة.

لبدء هذا الإجراء لكل لوحة مكتبة ، امزج 107.5 ميكرولتر من عيب في درجة حرارة الغرفة مع 4.3 مل من الوسائط الخالية من المصل ، وتخفيف واحد إلى 40 في أنبوب البوليسترين يحتضن لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة ، وقم بتوزيع 44 ميكرولتر لكل لوحة مكتبة في كل بئر من 96 بئر البوليسترين v صفيحة القاع. ضع لوحة الحمض النووي للمكتبة ، ولوحة تأثير الاختيار المخففة ، ولوحة البلازميد للمراسل ، وصندوق من أطراف الماصة على شفط سطح الروبوت. 17 ميكرولترا من البلازميدات المراسلة ، و 43 ميكرولترا من تأثير opt المخفف و 26 ميكرولترا من الحمض النووي للمكتبة ، مما يؤدي إلى إدخال فجوة هوائية تبلغ خمسة ميكرولتر بين كل شفط.

يجب استنشاق الحمض النووي للمكتبة أخيرا لمنع انتقال التلوث. قم بتوزيع محتويات الأطراف في غطاء مزيج جديد من البوليسترين V ذو القاع واتركه جانبا لمدة 20 دقيقة للسماح بتكوين مجمعات الحمض النووي الدهني. في حالة نقل لوحات مكتبة متعددة، استبدل أطراف الماصة ولوحة المكتبة وكرر ذلك بعد 20 دقيقة، واكشف عن لوحة خليط الحمض النووي ذات التأثير الاختياري وضعها على سطح الروبوت مع لوحين من خلايا 2 9 3 T باستخدام صندوق واحد من أطراف الماصة.

استنشق 80 ميكرولترا من خليط الحمض النووي لتأثير opt وقم بتوزيع 40 ميكرولتر ببطء لكل بئر لكل لوحة من الخلايا. قم بتغطية الخلايا بعد إضافة خليط الحمض النووي لتأثير opt إلى الخلايا في جميع الألواح. الطرد المركزي الألواح عند 1 ، 200 مرة G لمدة 30 دقيقة.

أعد الألواح إلى الحاضنة واحتضان الخلايا لمدة أربع إلى ست ساعات. خلال هذه الحضانة ، قم بإعداد وسائط جديدة عن طريق خلط 12 مل من DMEM التي تحتوي على 10٪ FBS و 10 ميكروغرام لكل مليلتر من السيبروفلوكسين. لكل لوحة مكتبة منقولة ، صب وسائط جديدة في خزان معقم.

بعد ذلك ، ضع صندوقين من أطراف الروبوت ، ولوحة واحدة من الخلايا ، والخزان الذي يحتوي على وسائط جديدة وخزان نفايات على سطح الروبوت. ثم استنشق 100 ميكرولتر من الوسائط من الخلايا وقم بتوزيعها في خزان النفايات ، مملوءة جزئيا بنسبة 70٪ من الإيثانول. باستخدام أطراف جديدة ، استنشق 100 ميكرولتر من الوسائط الطازجة وقم بتوزيعها ببطء على الخلايا.

أعد الأطباق إلى الحاضنة لمدة 48 ساعة. يتم إجراء فحوصات اليراع والفانيليا لوسيفيراز. بعد 48 ساعة من التحويل في اليوم الرابع من الشاشة لكل لوحة مكتبة ، قم بإعداد ثمانية ملليلتر من ثلاثة × مخزن فحص اليراع و 12 مل من ثلاثة × مخزن فحص الفانيليا من حلول المخزون الخاصة بهم ، وقم بتوزيع 82 ميكرولترا من المخزن المؤقت لفحص اليراع في كل بئر من لوحة ذات قاع 96 بئر V لكل لوحة مكتبة ليتم فحصها.

وبالمثل ، قم بتوزيع 122 ميكرولترا من المخزن المؤقت لفحص الفانيليا في كل بئر من صفيحة أخرى ذات قاع 96 بئر V. لكي يتم فحص كل لوحة ، ضع جانبا كلا المخازن المؤقتة للفحص. ضع صندوقا من أطراف الماصة وخزان نفايات وصفيحتين من الخلايا المنقولة من نفس لوحة المكتبة على سطح الروبوت ، واستنشق 60 ميكرولترا من الوسائط من كل لوحة وتخلص منها في خزان النفايات المملوء جزئيا بألواح غطاء الإيثانول بنسبة 70٪ واتركها جانبا.

بعد ذلك ضع صندوقين من أطراف الماصة. لوحة من ثلاثة × مخزن مؤقت لفحص اليراع ومجموعة من لوحات الخلايا على سطح الروبوت. استنشق 40 ميكرولترا من ثلاثة × المخزن المؤقت لفحص اليراع وأضفه إلى اللوحة الأولى من الخلايا ، واخلطه جيدا.

التبديل إلى أطراف ماصة جديدة. كرر مع لوحة الخلية الثانية. ضع الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق لإكمال التحلل.

سجل اللمعان من كل بئر من كل لوحة خلية على تسجيل مقياس الإضاءة لمدة ثانية واحدة لكل بئر. أعد اللوحات إلى سطح الروبوت. ضع صندوقين من أطراف الماصة ، ولوحة المخزن المؤقت للفحص الثلاثة x ومجموعة من ألواح الخلايا على سطح الروبوت.

استنشق 60 ميكرولترا من ثلاثة × مخزن مؤقت لفحص الفانيليا وأضفه إلى اللوحة الأولى من الخلايا. الخلط جيدا. التبديل إلى صندوق جديد من أطراف الماصة.

كرر مع لوحة الخلية الثانية. سجل اللمعان من جميع الألواح على مقياس الإضواع. تسجيل كل بئر لمدة ثانية واحدة.

عرض قيم لوسيفيراز نموذجية لنصف لوحة واحدة في هذه الجداول. يتم حساب نسبة اليراع إلى التلألؤ المتجدد أو نسبة F اثنين R لكل بئر بقسمة عدد إشارة اليراع على عدد إشارة تجديد ran والنتائج موضحة في اللوحة C. توضح اللوحة D قيمة الحث لكل بئر محسوبة بقسمة نسبة F اثنين R للبئر على متوسط نسبة F اثنين R للوحة ، باستثناء أعلى وأدنى 25٪ من الآبار. يجب حساب متوسط قيم الحث عبر النسخ المتماثلة للوحة مكتبة واحدة منقولة.

وتعتبر الجينات التي تحفز أو تقمع ألفا سينوكلين أكثر من ثلاثة أضعاف من الضربات. لاحظ أن المحفز 32 ضعفا في البئر H اثنين في هذه النتيجة التمثيلية الموضحة هنا هو تمثيل رسومي لقيم الحث للوحة المفردة مع بئر H اثنين مميزين باللون الأزرق. Hi.H two هو عامل نسخ عصبي لم يرتبط سابقا بتعبير ألفا سينوكلين.

من المهم التحقق من أن الشاشة يتم إجراؤها ضمن النطاق الخطي لمقايسات المراسل بحيث يتم قياس المستنسخة التي تسبب زيادة التعبير حيث تم نقل نشاط لوسيفيراز المتزايد إلى هذه الخلايا الطرفية بكميات متزايدة من بلازميدات اليراع والفانيليا لوسيفيراز تحت سيطرة المحفز والمقايسة القوية H-C-M-V-I-E. باستخدام هذا البروتوكول ، لوحظ أن نشاط اليراع يظل خطيا من خلال مجموعة واسعة من القيم. بينما يتسطح منحنى نشاط الفانيليا فوق 15 نانوغراما لكل بئر.

من المهم أيضا إجراء المقايسات على الفور بعد خطوة الحضانة لتجنب عدم الخطية بسبب استنفاد الركيزة. كشفت المسار الزمني لإشارة الاضمحلال لمقايسة لوسيفيراز اليراع عن نشاط كبير لوسيفيراز اليراع بعد ساعة واحدة من إضافة الكواشف باستخدام هذا البروتوكول ، وتم فحص 7،670 جينا بشريا وتم تحديد 68 منظما جديدا لألفا سينوكلين في النهاية في النتائج التمثيلية الموضحة هنا. يمثل كل خط أفقي نسبة الحث لضربة جين واحد مقارنة بمحفز GFP المحايد المتحكم فيه.

تمثل الخطوط الزرقاء محفزات إيجابية بينما يمثل الخط الأحمر الوحيد قيم تحريض مثبطة يتم حسابها كنسبة محفز ألفا سينوكلين الذي يقود نشاط لوسيفيراز اليراع إلى محفز CMV الذي يقود نشاط لوسيفيراز لكل ضربة تم تطبيعها إلى نفس مقايسة تركيبات لوسيفيراز باستخدام محفز GFP باتباع هذا الإجراء. يمكن إجراء طرق أخرى مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي جنبا إلى جنب مع المزيد من الإفراط في التعبير ومقايسات الضربة القاضية من أجل التأكد من أن الضربات المحددة تنظم الهدف الداخلي.