توليد الأنسجة الانحياز عضلة القلب من خلال طباعة وظيفية Microcontact

الهدف من التجربة التالية هو توليد أنسجة عضلة القلب الوظيفية المحاذاة من خلال طباعة التلامس الدقيق. يتم تحقيق ذلك عن طريق أول طباعة فيبرونيكتين بالاتصال الدقيق على ركائز بولي ثنائي ميثيل سيلوكسان. كخطوة ثانية ، مزدوجة معدل وراثيا.

يتم تمييز خطوط الخلايا الجذعية الجنينية في المختبر وعزلها عن طريق فرز الخلايا المنشطة بالفلورة ، مما يسمح بالحصول على مجموعات عالية النقاء من أسلاف القلب قوية. بعد ذلك ، يتم زرع أسلاف القلب المعزولة على ركائز PDMS ذات براءات اختراع صغيرة لجعلها خبيثة وتأخذ شكل الخلايا العضلية القلبية مثل شكل القضيب. تم الحصول على النتائج التي تظهر العزلة الناجحة والنمو المتناحي لأسلاف القلب بناء على الحقائق وتحليل التألق المناعي.

يمكن أن يساعد توليد نسيج عضلة القلب متناحي الخواص في التقدم في مجالات بيولوجيا الخلايا الجذعية والهندسة الحيوية للأنسجة من خلال زيادة إمكانية تطوير إعادة وصف الخلايا الخاصة بالمرض لتطوير الأدوية واكتشافها. ومن خلال إرساء الأساس للطب التجديدي للقلب. أول حارس IL ، 180 4 بولي ثنائي ميثيل آلان المطاط الصناعي بنسبة عامل التخمين 10 إلى واحد وتخلط جيدا.

قم بإزالة التجميع باستخدام مجفف للتخلص من أي فقاعات هواء. صب PDMS في سيد تم تصنيعه مسبقا بعرض 20 ميكرون وحواف أداة ميكرون مفصولة بتباعد 20 ميكرون ، ثم يعالج لمدة يومين في جافة في درجة حرارة الغرفة للحصول على طوابع PDMS ذات نسيج صغير. بعد جعل أسطح ختم PDMS محبة للماء باستخدام منظف البلازما.

عقم الطوابع بنسبة 70٪ من الإيثانول لمدة دقيقة واحدة. في خزانة السلامة البيولوجية ، جفف بسرعة بالهواء المضغوط. قم بتغطية أسطح الطوابع المعقمة بمحلول الفيبرونيكتين لامتصاصه لمدة 10 دقائق على الأقل بعد الامتصاص.

تخلص من محلول الفيبرونيكتين من الطوابع وجفف بسرعة بالهواء المضغوط. قم بإنشاء اتصال مطابق بين الختم وزلات الغطاء الزجاجي المطلي بنظام PDMS المعدة مسبقا كما هو موضح في بروتوكول النص لمدة دقيقتين واضغط بقوة. شطف ركائز النمط الصغير بالماء المقطر.

قم بتخزينها في ماء مقطر لمدة أسبوعين كحد أقصى أربع درجات مئوية ما لم يتم استخدامها على الفور. قم بتغطية ستة أطباق بئر بجيلاتين معقم 0.1٪ في الماء المقطر واتركه يمتص لمدة 15 دقيقة و 37 درجة مئوية خلال هذا الوقت ، قم بإعداد الخلايا الليفية الجنينية للفأر من ahor aliquot عن طريق إضافتها إلى 50 مل من PBS في أنبوب مخروطي الشكل. قم بالطرد المركزي للميثامفيتامين عند 1000 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق وأعد تعليقها في وسط الميثامفيتامين.

بمجرد انقضاء وقت الحضانة ، قم بشفط الجيلاتين الزائد وأضف الميس إلى الآبار. اسمح ل MES يوما ما بالمرفق. قم بإعداد الخلايا الجذعية الجنينية أو الخلايا الجذعية الجنينية من الفكرة عن طريق إضافتها إلى 50 مل من PBS في جهاز طرد مركزي أنبوبي مخروطي الشكل.

تقوم الخلايا ES ب 1000 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق وتعليقها في وسط ESC. أضف خلايا E ES إلى الآبار التي تحتوي على الأساطير واحتفظ بها في وسط ESC حتى يتم الوصول إلى التقاء لتدليك خلايا ES المتزامنة. قم أولا بشفط وسط ESC واغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام PBS المعقم.

ثم استنشق PBS وأضف 500 ميكرولتر من الرحلات إلى البئر. احتضن الطبق لمدة ثلاث دقائق ونصف عند 37 درجة مئوية. ماصة محلول TRIPSIN لأعلى ولأسفل عدة مرات.

أول من قام بتفكيك مستعمرات الخلايا E es. ثم قم بتحييد محلول tripsin عن طريق إضافة 500 ميكرولتر من وسط ESC إلى البئر. قم بتدليك الخلايا الجذعية الجنينية وفقا للنسبة المطلوبة هنا يتم تمرير خلايا E ES بنسبة واحد إلى 30 ، مما يسمح لها بالوصول إلى التقاء في غضون ثلاثة أيام.

ابدأ التمايز في المختبر عندما تصل الخلايا الجذعية الجنينية إلى التقاء. قم أولا بتغطية أطباق الاستزراع 10 سم بجيلاتين معقم 0.1٪ في الماء المقطر واتركه يمتص لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. خلال هذا الوقت ، قم بحصاد الخلايا الجذعية الجنينية كما كان من قبل.

بمجرد انقضاء 15 دقيقة ، استنشق أي جيلاتين زائد وأضف ما يقرب من ثلث إلى نصف معلق الخلية E ES في أطباق مستنبتة تحتوي على وسط تكيف. بعد زراعة الخلايا في وسط التكيف لمدة يومين ، قم بحصاد الخلايا الجذعية الجنينية المعدلة في أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر يحتوي على PBS باستخدام 1.5 مل من التربسين. قم بالطرد المركزي عند 1000 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق وأعد تعليقها في وسط التمايز.

اصنع أجساما جنينية أو EBS من حوالي 1000 خلية لكل قطرة 10 ميكرولتر من وسط التمايز في أطباق استزراع 15 سم. باستخدام ماصة متعددة القنوات، اقلب الألواح والثقافة. يقوم EBS بتعليق القطرات لمدة يومين ونصف عند 37 درجة مئوية.

بعد يومين ونصف ، اسحب EBS من ستة إلى ثمانية أطباق بطول 15 سم إلى واحد باستخدام وسيط التمايز وزرعها لمدة ثلاثة أيام ونصف أخرى. بعد ثلاثة أيام ونصف أخرى ، اجمع EBS في أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر واغسل اللوحة مرة واحدة باستخدام PBS معقم لجمع كل ebs. ثم دعهم يغرقون في القاع لمدة خمس دقائق تقريبا.

ثم قم بإزالة supinate وغسل EBS باستخدام PBS معقم. دع EBS يغرق في القاع مرة أخرى لمدة خمس دقائق تقريبا. قم بفصل EBS عن طريق إضافة 2.5 مل من التربسين ورج الأنبوب برفق في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لمدة دقيقتين.

ثم أضف 2.5 مل من PBS المعقم إلى محلول tripsin والماصة لأعلى ولأسفل باستخدام الماصة المصلية سعة 10 ملليلتر تقريبا من ثماني إلى 10 مرات لتكسير مجموعات الخلايا. قم بتحييد التربسين باستخدام 10 ملليلتر من المخزن المؤقت للفاكس الذي يحتوي على 7.5٪ E ES أو خلية FBS بدرجة تمايز و 0.01٪ DPI في جهاز الطرد المركزي PBS ، EBS المنفصل عند 1000 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق. ثم قم بإزالة السوبينات وأضف ما يقرب من ملليلتر واحد من ماصة الفاكس العازلة لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة سعة مليلتر واحد حوالي ثماني إلى 10 مرات لتفكيك مجموعات الخلايا.

انقل الخلايا إلى أنبوب سفلي دائري معقم بمصفاة خلية 35 ميكرون للحصول على معلق خلية واحدة. قم بفرز الخلايا الجذعية الجنينية المتمايزة باستخدام مقياس تدفق الأريا الخلوي واحصل على مجموعات منقاة من أسلاف البطين الملتزمة. راجع الجزء النصي من البروتوكول للحصول على استراتيجية البوابات التفصيلية.

أكلت ركائز النمط الصغير مع 1٪ onic F1 27 في الماء المقطر لمدة 10 دقائق. ثم اغسلها ثلاث مرات باستخدام PBS معقم. قم بتوصيل حشوات PDMS حول منطقة النمط واضغط بقوة.

ثم بذر أسلاف القلب على ركائز نمط الفيبرونيكتين الدقيقة. الصور التالية مأخوذة من مخطط قياس التدفق الخلوي التمثيلي لليوم السادس في خلايا ES المتمايزة في المختبر. تظهر هذه الصورة البوابات على سعة الانتثار الأمامي FSCA وسعة الانتثار الجانبي SSCA.

هذا يسمح بفصل الخلايا بأكملها عن الحطام الخلوي. هنا تظهر البوابات على FSCA وعرض المبعثر الأمامي FSCW. هذا يسمح بعزل المفردات الخلوية عن الزوجيات والمجاميع الخلوية الأخرى.

تظهر هذه الصورة البوابات على SSCA والمبعثر باستخدام SSCW. هذا يزيد من نقاء الخلايا المفردة. تظهر هذه الصورة بوابة على تلطيخ FSCA و DPI الذي يسمح بعزل الخلايا السالبة DPI القابلة للحياة عن الخلايا غير القابلة للحياة.

هنا ينظر إلى بوابات fico و rine و PE و PE السماوي في DI سبعة PE SI seven. يسمح ذلك بالحصول على الخلايا السالبة الحمراء الحمراء الحقيقية والسالبة الحمراء الحقيقية واستبعاد الخلايا السالبة الحمراء ذاتية الفلورسنت. تظهر هذه الصور بوابة لسعة الفلوريسين إيزوثيوسيانات تناسب CA و PEA التي تسمح بفرز الخلايا السالبة الخضراء الحقيقية والموجبة والخضراء الحقيقية داخل المجموعات السكانية الحمراء الموجبة والحمراء السلبية.

يكشف تنقية الفاكس لخلايا ES المتمايزة في المختبر عن أربعة مجموعات متميزة من الأسلاف كما يتضح من مخطط قياس التدفق الخلوي هذا. المجموعات الأربعة المتميزة للأسلاف هي الأحمر والأخضر الإيجابي والأحمر الإيجابي والأخضر الإيجابي والأحمر السلبي والأخضر السلبي. تظهر صورة الفحص المجهري المناعي التمثيلي هذه ركائز فيبرونيكتين منقوشة دقيقة.

يمثل شريط المقياس 80 ميكرون. تظهر هذه الصورة الفحص المجهري المناعي التمثيلي للحقائق المشتقة من الجنين ، والأسلاف المعزولة في الألواح العلوية والحقائق المشتقة من ESL ، وأسلاف معزولة في الألواح السفلية بعد خمسة أيام إضافية من الثقافة على نوى أنماط الفبرونيكتين الدقيقة الملطخة باللون الأزرق. S-M-M-H-C-A الملون باللون الأحمر ألفا أكتينين يظهر باللون الأخضر.

شريط المقياس 40 ميكرون. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية توليد أنسجة عضلة القلب الوظيفية متباينة الخواص من مصدر خلوي متجدد من بروتوس القلب.