وهناك طريقة للتحكم عالي الدقة Optogenetic من الخلايا العصبية الفردية الهرمية في الجسم الحي

الهدف العام من التجربة التالية هو تنشيط أو إسكات مجموعات الخلايا العصبية المحددة وراثيا بسرعة على نطاق زمني مناسب من الناحية الفسيولوجية. يتم تحقيق ذلك من خلال توصيل ناقل فيروسي يحمل الجينات المعدلة وراثيا التي تشفر الخلايا العصبية للضوء الأزرق التي تنشط قناة opsin أو الخلايا العصبية ذات الضوء الأخضر التي تسكت أوبسين القاعة إلى الخلايا العصبية المحددة وراثيا. كخطوة ثانية ، يتم إنشاء طريق مرجعي ينبعث منه الضوء يتكون من ألياف بصرية مثبتة على قطب تسجيل ، مما يسمح بتوصيل الضوء والتسجيل الكهربائي في وقت واحد.

بعد ذلك ، يتم وضع TRO وخفضه في منطقة الدماغ المنقولة Opsin. من أجل استحضار الاستجابات بوساطة قناة opsin و ha opsin ، يتم الحصول على نتائج تظهر التنشيط والتثبيط الناجم عن الضوء للقناة redsin و hahallin الخلايا العصبية المنقولة بناء على تقنية تسجيل الوحدة الواحدة التي تسمح بتسجيل الخلايا العصبية الفردية. تلبي هذه الطريقة حاجة أساسية في علم الأعصاب من خلال السماح لنا بتحديد مدى فعالية الضوء بالضبط في قيادة النشاط العصبي بدقة زمنية بالمللي ثانية وفي أنواع فرعية عصبية محددة وإثبات ذلك سيكون تشين ناكامورا.

باحث ما بعد الدكتوراه في مختبري تأكد من اتباع إجراءات السلامة البيولوجية من المستوى الأول أثناء إعداد الفيروس والتعامل معه ، ومراعاة جميع الإرشادات المحلية والحكومية المتعلقة بالحيوانات. قبل الحقن التجسيمي ، اسمح لكمية من الفيروس بالذوبان على الجليد ثم تدور لفترة وجيزة. في جهاز الطرد المركزي الذي يوضع على الطاولة ، قم بإعادة ملء حقنة وإبرة زجاجية من هاميلتون ببطء بكمية صغيرة من السيليكون أو الزيت المعدني.

تأكد من عدم وجود فقاعات هواء مرئية في برميل المحقنة. أدخل المحقنة في مضخة حاقن صغيرة وقم بتوصيل المضخة مباشرة بالذراع التجسيمي الرأسي. بعد ضبط أنبوب التحليل التجسيمي في وضع ثابت، اخفض الذراع التجسيمية حتى يلامس طرف الإبرة الجزء السفلي من أنبوب نقل الفيروس.

استخدم وحدة التحكم لمضخة الحاقن الصغيرة لسحب الحجم المطلوب من الفيروس. بعد تخدير الفئران بالكيتامين والزيلازين ، تحقق من الاستجابة الانعكاسية لقرصة إصبع القدم لضمان عمق التخدير الكافي باستخدام طرق معقمة قياسية. ضع في جهاز تجسيمي بعد عمل شق في خط الوسط عبر الجلد أعلى جمجمة بمقص جراحي صغير أو مشرط.

افصل النسيج الضام برفق ونظف الجزء العلوي من الجمجمة باستخدام مكشطة عظمية صغيرة. اخفض الإبرة وتحقق من أن إحداثيات Z ل bgma و lambda متساوية لإثبات أن الرأس مستوى. ثم حرك الذراع التجسيمية إلى الإحداثيات المقابلة لبنية الدماغ ذات الاهتمام.

ضع علامة على الموقع المقصود للحقن بقلم جراحي. استخدم مثقابا محمولا باليد لتخفيف الجمجمة بعناية فوق المنطقة المستهدفة. توقف عندما تصل لقمة الثقب إلى أسفل الجمجمة واستخدم زوجا من الملقط الدقيق للغاية لإزالة العظم الرقيق.

بعد انكشاف الجافية ، ضع إبرة المحقنة فوق المنطقة المستهدفة وقم بخفض الإبرة حتى تلامس الجافية. واستخدم هذه النقطة لحساب z. التنسيق الآن ببطء شديد ، قم بخفض إبرة الحقن في الدماغ حتى يتم الوصول إلى الموضع Z المناسب.

في هذا البروتوكول ، يتم استهداف المنطقة قبل الحوفي من قشرة الفص الجبهي الإنسي. حقن الفيروس بمعدل 0.1 ميكرولتر في الدقيقة. بعد اكتمال الحقن ، انتظر 10 دقائق قبل سحب الإبرة لتجنب ارتجاع الفيروس إلى سطح الدماغ.

بعد استخدام خياطة خياطة بإبرة متصلة لإغلاق الجلد ، ضع المضادات الحيوية على الجرح. أولا ، قم بتوصيل قطب التنغستن واحد إلى 1.5 ميجا أوم بأنبوب شعري زجاجي باستخدام الغراء الفائق. ثم استخدم أداة تجريد الألياف لكشف الطرف العاري للألياف الضوئية متعددة الأوضاع وتنظيف طرف الألياف بالإيثانول برفق شديد.

قم بتقطيع طرف الألياف بسكين ماسي على شكل إسفين واستخدم ملقطا دقيقا لإزالة الألياف الزائدة بعناية. يجب أن تنشق الألياف بسهولة عند النتيجة. استخدم مقياس طاقة ضوئية لقياس شدة الليزر عند طرف الألياف البصرية.

بالنسبة للتسجيلات في الجسم الحي ، يمكن لشدة الضوء التي لا تقل عن 20 إلى 100 مللي واط لكل ملليمتر مربع أن تستحضر بشكل موثوق تنشيط قناة redsin أو Halin بوساطة أو إسكات النشاط العصبي على التوالي. بعد ذلك ، أدخل الألياف الضوئية في الأنبوب الشعري. ضع طرف الألياف حوالي 500 ميكرون فوق طرف قطب التنغستن واربط خيطا رفيعا مرتين في بضع نقاط بالقرب من الطرف بحيث يكون القطب الكهربائي والألياف مستقيمين.

تأكد من أن المسافة بين طرف القطب الكهربائي وأقرب عقدة طويلة بما يكفي لإدخالها في المنطقة المستهدفة كما هو موضح هنا. جهز للجراحة كما كان من قبل. ثم استخدم حج القحف الأولي كدليل لإنشاء نافذة صغيرة جديدة ونظيفة في الجمجمة.

لوضع tro. استخدم إبرة رفيعة لعمل شق صغير على الجافية. قم بخفض TRO بعناية من خلال نافذة الجمجمة إلى الدماغ إلى المنطقة المنقولة باستخدام مناور ميكروم.

ثم تقدم على الطرق الوعرة ببطء في خطوات من 10 إلى 50 ميكرون حتى ظهور خلية مستجيبة للضوء. هنا ، يتم استخدام واجهة مستخدم برمجية مخصصة مكتوبة في عرض المختبر للتحكم في ليزر الصمام الثنائي الفردي وتصور وتسجيل النشاط العصبي المستمر. يتم التقاط الإشارات المسجلة باستخدام تمرير نطاق مكبر للصوت AMP 20 K سابق تمت تصفيته بسرعة 0.3 إلى ثمانية كيلو هرتز ولوحة تناظرية إلى رقمية لأداة وطنية.

تسمح واجهة مستخدم neuro lux Pro باختيار المدخلات التناظرية والمخرجات الرقمية. اختر قناتين تناظريتين لمنطق الترانزستور العصبي والترانزستور أو إشارة TTL. اضبط معدل أخذ العينات على 20 كيلو هرتز ، وفترة ما قبل الضوء الأساسية إلى ثانيتين وفترة ما بعد الضوء على ثانيتين.

ثم اضبط عرض نبضة التحفيز بالليزر TTL والتردد وفترة التحفيز. هنا التردد 20 هرتز وفترة التحفيز 500 مللي ثانية ، مما يعني أنه يتم تسليم 10 نبضات ليزر بعرض نبضة محدد. يمكن للمستخدم اختيار إما توصيل الضوء المستمر أو للتسجيلات المتكررة.

يمكنهم اختيار الفاصل الزمني بين النبضات وعدد سلالات النبض. يمكن الحصول على البيانات مع أو بدون تسجيل على قرص بعد التسجيل. يتم التضحية بالحيوان وفقا للإجراءات المعتمدة وتتم معالجة أنسجة المخ للتحقق من وضع التآكل والتعبير عن opsin كما هو موضح هنا.

تظهر لقطة الشاشة هذه لواجهة برنامج Neuro LX Pro التي تم إعدادها لتوصيل الضوء المتزامن والتسجيل الفيزيولوجي الكهربي إسكات هول رود دوبسون الناجم عن إسكات النشاط التلقائي لخلية الراب شبه المعدنية قبل الحوفي استجابة ل 10 ثوان من توصيل الضوء المستمر 532 نانومتر. تظهر هذه الصورة تعبير هالو ريدسين التمثيلي في ulu الظهري. يمثل التخطيطي الموجود على اليمين الموقع الذي التقطت فيه الصورة.

يشير رأس السهم إلى موضع قطب التنغستن ويشير السهم إلى موضع الألياف الضوئية. تظهر هذه الصورة تعبير opsin للقناة التمثيلية في القشرة قبل الحوفية. مرة أخرى ، يمثل التخطيطي الموجود على اليمين الموقع الذي التقطت فيه الصورة.

يشير رأس السهم إلى موضع قطب التنغستن ويشير السهم إلى موضع الألياف الضوئية. يظهر هذا المثال الذي تم تسجيله من قشرة الفئران قبل الحوفي قناة redsin اثنين من إمكانات الفعل المحفزة استجابة لتوصيل 20 هرتز من 473 نانومتر الأزرق ، نبضات ضوئية لمدة 10 مللي ثانية لكل منها كما هو موضح في الشريط الأزرق. ادناه. تظهر المخطط النقطي قناة redsin الناجمة عن ارتفاع في ستة خلايا عصبية تمثيلية.

يتم رسم كل نشاط وحدة كنقطة. يوضح هذا المثال التتبع قمع النشاط التلقائي الناجم عن opsin في القاعة أثناء إضاءة الضوء الأخضر المستمر 532 نانومتر لمدة 10 ثوان كما هو موضح في الشريط الأخضر في نفس منطقة الدماغ. تظهر المخطط النقطي إسكات الهالر دوسين الناجم عن ستة خلايا عصبية تمثيلية.

يتم رسم كل نشاط وحدة كنقطة. تظهر هذه الصورة ارتفاعا متكررا بقوة 20 هرتز مدفوعا بقناة opsin لخلية عصبية شبه معدنية للفئران في الجسم الحي آثار الجهد للضوء المستحث ، والارتفاع ، المكتسبة في النقاط الزمنية 0 30 و 60 90 و 120 دقيقة بعد بداية التسجيلات يتم عرضها على الجانب الأيسر. على الجانب الأيمن ، تظهر المخطط النقطي جميع التكرارات البالغ عددها 61 للتنشيط الناجم عن الضوء.

يتم رسم كل نشاط وحدة كنقطة. هنا في الجسم الحي ، تظهر تسجيلات الفيزيولوجيا الكهربية من Haller Dossin الظهرية الظهرية للفئران في الأعلى. يوضح أثر المثال أن إضاءة 532 نانومتر متواصلة لمدة 10 ثوان مشار إليها بالشريط الأخضر للجزء الفرعي الظهري الذي يعبر عن هول دوبسون يزيل النشاط التلقائي.

فيما يلي متوسط الأشكال الموجية للوحدتين المسجلتين من التتبع أعلاه. تم استخدام عتبة السعة لتحديد خليتين عصبيتين متميزتين. أخيرا ، تظهر المخطط النقطي خمسة تكرارات لإسكات هذه الوحدات الناجم عن هالر دوسين.

يتم رسم كل نشاط وحدة كنقطة. أخيرا ، تظهر هذه الصورة ارتفاعا متكررا بقوة 20 هرتز مدفوعا بقناة opsin لخلية عصبية تحت الظهر للفئران في الجسم الحي آثار جهد الضوء المستحث ، والارتفاع ، المكتسبة في النقاط الزمنية 0 و 30 و 60 و 90 و 120 دقيقة. بعد عرض بداية التسجيلات على اليسار ، يظهر الجزء الداخلي أدناه نشاط الانفجار النموذجي لهذه الخلية.

تظهر المخطط النقطي على اليمين جميع التكرارات ال 61 للتنشيط الناجم عن الضوء. يتم رسم كل نشاط وحدة كنقطة. هذه التقنية مهمة لأنها توضح أنه يمكن تنشيط أنواع فرعية عصبية معينة أو إسكاتها لفترات طويلة من الزمن.

في الواقع ، لقد أثبتنا أنه يمكننا تنشيط الخلايا العصبية لأكثر من ساعتين وتطبيقها عليها. في النهاية ، سيكون الهدف هو تطبيق هذا على المتصرف في التي تؤدي مهام الانتباه أو الذاكرة حتى نتمكن من تنشيط دوائر معينة ومعرفة كيف يتحكم ذلك في وظائف الذاكرة المختلفة.