تنقية الرنا الميكروي والتنميط من Exosomes المشتقة من الدم والثقافة وسائل الإعلام

وقد ولدت وجود microRNAs مستقرة (miRNAs) في exosomes مصلحة هائلة كوسيلة للاتصال بين الخلايا الرواية، لفائدتها المحتملة والمؤشرات الحيوية وكطريق للتدخل العلاجي. نحن هنا لشرح تنقية exosome من الدم والثقافة وسائل الإعلام تليها الكمية PCR لتحديد miRNAs التي يجري نقلها.

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد وقياس الحمض النووي الريبي الصغير الموجود في الإكسوسومات التي تم الحصول عليها من وسط زراعة الدم أو الخلايا. يتم تحقيق ذلك عن طريق تنقية الإكسوسومات أولا من الدم أو وسائط زراعة الخلايا باستخدام الطرد المركزي التفاضلي. الخطوة الثانية هي تنقية الحمض النووي الريبي الخارجي الكلي ، باستخدام مجموعة عزل الحمض النووي الريبي الصغير من النيرفانا

بعد التأكد من سلامة وتركيز الحمض النووي الريبي المنقى ، يتم تحويله إلى CDNA باستخدام الكواشف في مجموعة تفاعل النسخ العكسي Megaplex. بعد ذلك ، يتم تنفيذ خطوة التضخيم المسبق باستخدام بادئات Megaplex preamp ومزيج رئيسي استباقي لرجل الهجوم. لتضخيم microRNAs ، تتمثل الخطوة الأخيرة في تشغيل تفاعل PCR في الوقت الفعلي باستخدام 2 384 بطاقة موائع دقيقة أو بطاقات مصفوفة منخفضة الكثافة TAC man تحتوي على مجسات تمهيدية TAC MAN المجففة.

في النهاية ، سيمكن هذا الإجراء من اكتشاف ما يصل إلى 758 microRNAs معروفة. تقيس هذه التقنية الاختلافات في محتوى الحمض النووي الريبي الصغير الخارجي الذي يعتمد على المصدر والظروف الفسيولوجية التي يتم إفرازها في ظلها. تمتد الآثار المترتبة على تحديد هذه التوقيعات الفريدة نحو تطوير المؤشرات الحيوية والتدخلات العلاجية الجديدة. استراتيجيات.

لبدء هذا الإجراء ، قم بقلب أنبوب مطلي ب EDTA يحتوي على 10 ملليلتر من الدم الكامل خمس مرات لضمان خلط العامل المضاد للتخثر ووضعه في وضع مستقيم في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 إلى 60 دقيقة ، ثم الطرد المركزي للعينة عند 2000 مرة جم وأربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة لفصل الدم. بعد 15 دقيقة ، قم بإزالة الأنبوب من جهاز الطرد المركزي واجمع البلازما في أنبوب جديد سعة 15 مل. ضع البلازما على الثلج وقم بتخفيفها بحجم متساو من PBS.

ثم امزج العينة برفق وضعها في جهاز الطرد المركزي عند 2000 مرة درجة مئوية وأربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، قم بإزالة العينة من جهاز الطرد المركزي. انقل إلى أنبوب طرد مركزي جديد.

أضف XPBS واحد إلى 24 مل وجهاز طرد مركزي عند 12،000 مرة G وأربع درجات مئوية لمدة 45 دقيقة. ثم انقل المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي فائق وجهاز طرد مركزي عند 110،000 مرة من G وأربع درجات مئوية لمدة ساعتين. بعد ساعتين.

قم بإزالة العينة من الترا وقم بإزالة المادة الطافية بعناية باستخدام ماصة. أعد تعليق الحنك في PBS المبرد وضع العينة مرة أخرى في جهاز الطرد المركزي الفائق. تدور عند 100 ، 000 مرة G وأربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة بعد الطرد المركزي.

قم بإزالة المادة الطافية بعناية باستخدام ماصة وأعد تعليق الحنك في 300 ميكرولتر من محلول تحلل الحمض النووي الريبي. بدلا من ذلك، يمكن تعليق العينة في المخزن المؤقت PBS أو RIPPA. للفحص المجهري الإلكتروني وتحليل اللطخة الغربية على التوالي ، قم بإعداد المنطقة لعزل الحمض النووي الريبي عن طريق ارتداء معدات الحماية الشخصية ، ومسح الأسطح والماصات باستخدام انطلاق R a واستخدام أطراف وأنابيب مرشح معقمة.

ثم حدد ما إذا كان التضخيم المسبق للحمض النووي الريبي ضروريا عن طريق تحديد كمية الحمض النووي الريبي المعزول باستخدام مقياس طيف للعينات التي يزيد حجمها عن 350 نانوغراما من تضخيم ما قبل مضخم الحمض النووي الريبي قد لا يكون ضروريا ما لم يكن النسخة محل الاهتمام منخفضة الوفرة. بعد ذلك ، قم بإعداد CD NA من الحمض النووي الريبي المنقى باستخدام تجمع megaplex. بادئات النسخ العكسي.

ابدأ بإذابة البرايمر على الجليد. تحتوي المجموعة A والتجمع B على بادئات للحمض النووي الريبي الصغير على صفيف بطاقات الموائع الدقيقة A و B أثناء إذابة الجليد في تسمية أنبوبين من RNAs خالية من 1.5 ملليلتر للنسخ العكسي باستخدام بادئات التجمع A أو بادئات التجمع B وإعداد مزيج رئيسي لكل منهما بشكل منفصل عن المكونات كما هو موضح في بروتوكول النص. احرص على إبقاء البادئات للمسبح A والمسبح B منفصلة.

ثم اقلب الأنابيب مع المزيج الرئيسي ست مرات وقم بعمل ماصة بمقدار 4.5 ميكرولتر من تفاعل RT باختلاط في كل أنبوب من شرائط المنحدر الصغير الثمانية أنابيب. بعد ذلك ، أضف ثلاثة ميكرولترات من عينة الحمض النووي الريبي التي تحتوي على ما بين واحد و 350 نانوجرام من الحمض النووي الريبي إلى كل أنبوب. حرك العينة بطرف الماصة وقم بتغطية الأنابيب.

قم بتدوير العينات لفترة وجيزة واحتضانها على الجليد لمدة خمس دقائق. بعد الحضانة ، قم بتحميل أنابيب التفاعل في جهاز PCR وتشغيلها في ظل الظروف التالية. عند اكتمال تفاعل البوليميراز المتسلسل ، قم بتخزين CDNA عند سالب 20 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد أو استمر في التضخيم المسبق للعينات التي يقل وزنها عن 350 نانوجراما.

أو إذا كان النص محل الاهتمام منخفضا ، فقم بتنفيذ خطوات التضخيم الأولية التالية: ابدأ باتباع بادئات preamp للتجمع A و Pool B على الجليد واقلبها للخلط. بعد ذلك ، قم بتدوير المزيج الرئيسي الاستباقي للرجل ، واحتفظ به على الجليد. أيضا ، ثم قم بإعداد مزيج التضخيم الرئيسي.

بعد ذلك ، قم بإدخال 2.5 ميكرولتر من منتج CD NA في ثمانية شرائط أنبوبية صغيرة ، ثم أضف 22.5 ميكرولتر من مزيج تفاعل تضخيم ما قبل مكبر الصوت. أخيرا ، احتضان الأنابيب على الجليد لمدة خمس دقائق. ثم قم بتحميل العينة في جهاز PCR وقم بتشغيلها في ظل الظروف التالية.

بعد الانتهاء من تفاعل التضخيم المسبق ، قم بالطرد المركزي للأنابيب لفترة وجيزة ثم أضف 75 ميكرولترا من 0.1 × تريس ، درجة الحموضة EDTA 8.0 لكل أنبوب. بعد ذلك ، امزج الأنابيب لفترة وجيزة وقم بتدويرها. استمر في تحميل مصفوفة الحمض النووي الريبي الصغير أو قم بتخزين المنتج المخفف لمدة تصل إلى أسبوع واحد عند سالب 20 درجة مئوية.

لتحضير العينات لمجموعة الحمض النووي الريبي الصغير tac MAN ، امزج 450 ميكرولترا من جهاز PCR العالمي tac man امزج تسعة ميكرولترات من منتج تضخيم مكبر الصوت المخفف و 441 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز إلى أنبوب خال من الحمض النووي الريبي سعة 1.5 مليلتر على الجليد. ثم امزج الأنبوب عن طريق قلبه ست مرات وقم بالطرد المركزي للعينة. قم بتوزيع 100 ميكرولتر من مزيج تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل لفترة وجيزة في كل منفذ من بطاقة مصفوفة الحمض النووي الريبي الصغير tac man.

بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للبطاقة مرتين عند 1000 مرة G لمدة دقيقة واحدة ، ثم أغلق البطاقة. بعد ذلك ، قم بتحميل المصفوفة في الدراجة الحرارية. بعد ذلك ، قم بتشغيل العينات باستخدام ظروف التدوير الحراري الافتراضية المتوفرة مع الاشعال في دليل الأنظمة الحيوية التطبيقية لمصفوفة 384 بئر TAC Man منخفضة الكثافة من أجل إجراء تحليل mRNA في نظام Biosystem 7 ، 900 HG سريع في الوقت الفعلي المطبق.

أولا ، قم بتغيير الكتل الحرارية لتشغيل لوحة 96 بئر. صورة المجهر الإلكتروني الناقل الموضحة على اليسار هي لإكسوسومات معزولة من دم الفأر. باستخدام الطرق الموضحة في هذا الفيديو.

الصورة الموجودة على اليمين عبارة عن إكسوسومات منقاة من وسائط زراعة الخلايا ثم تتراوح الإكسوسومات المضادة للقرص المضغوط 81 ذات العلامات الذهبية عادة من 30 إلى 100 نانومتر في القطر. تظهر الوفرة النسبية للحمض النووي الريبي الصغير الطبيعي الموجود في الإكسوسومات المعزولة من دم القوارض ودم الإنسان ووسائط زراعة الخلايا البطانية الأبهرية البشرية حيث تشير قيم دلتا CT التي تم تطبيعها إلى U ستة قيم دلتا للتحكم الداخلي دلتا إلى أن الحمض النووي الريبي الصغير أقل وفرة وسلبية. تشير قيم Delta CT إلى أن الحمض النووي الريبي الصغير أكثر وفرة.

ليست كل الحمض النووي الريبي الصغير موجودة في كل نوع عينة. على سبيل المثال ، لم يتم اكتشاف 1 26 فقط في إكسوسومات دم القوارض و 200 درجة مئوية فقط غائبة عن الإكسوسومات H-A-O-E-C. توجد الحمض النووي الريبي الأربعة المتبقية في جميع العينات الثلاث بكميات متفاوتة.

على الرغم من أن هذا البروتوكول يركز على توصيف الحمض النووي الريبي الميكرو الخارجي ، إلا أنه يمكن أيضا قياس نصوص Mr.NA الفردية من الإكسوسومات باستخدام QPCR عند مقارنتها ب Mr.NA من الدم الكامل. أظهر Exo Omal ، RNA تعبيرا مشابها لكل من عامل نمو البطانة الوعائية A ، وقد مهد الجمع بين هذه التقنيات الطريق للباحثين في مجال بيولوجيا الحمض النووي الريبي لاستكشاف وظيفة الحمض النووي الريبي المتداول. في التوسط في تغيرات التعبير الجيني وفي تحديد التوقيعات الجزيئية المرتبطة بالإكسوسومات في كل من الحالات الطبيعية والمرضية.