الدجاج الأجنة شريحة الحبل الشوكي الثقافة البروتوكول

الهدف العام من هذا الإجراء هو زراعة شرائح جنين الدجاج للحفاظ على نمو الخلايا العصبية الطبيعي ، وخاصة الخلايا العصبية الحركية الشوكية. يتم تحقيق ذلك عن طريق تشريح جنين الدجاج أولا لإزالة الأعضاء الحشوية. الخطوة الثانية هي تحضير وتقطيع الجنين المدمج في كتلة أغارو.

بعد ذلك ، تتم إزالة شريحة الجنين بعناية من الأجارو. الخطوة الأخيرة هي نقل شريحة الجنين إلى وسط استزراع ، يتم تحضينها لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية. في النهاية ، يتم استخدام الفحص المجهري المناعي الفلوري على الأجزاء الرقيقة من شريحة الجنين لإظهار وجود وموقع الخلايا العصبية الحركية الشوكية بعد فترة الزراعة.

لذلك يمكن أن تساعد هذه الطريقة في معالجة الأسئلة الرئيسية في مجال البيولوجيا العصبية التنموية. على سبيل المثال ، الآليات والجزيئات المشاركة في هجرة الخلايا العصبية الحركية الشوكية. بشكل عام ، سيكافح الأشخاص الجدد في هذه الطريقة لأن هناك حاجة إلى الكثير من العناية أثناء مراحل تشريح البروتوكول.

ضع 10 بيضات مخصبة مع الجانب الأطول أفقيا في حاضنة سحب قسري عند 38 درجة مئوية حتى تتطور إلى مرحلة الهامبرغر وهاميلتون 24. يتطلب هذا عادة ما يقرب من أربعة أيام من الحضانة. في اليوم الثاني من الحضانة ، قم بتعقيم قشر البيض عن طريق المسح بمناديل ورقية مبللة بنسبة 70٪ من الإيثانول ، واخترق بعناية الطرف المسطح لقشرة البيضة باستخدام إبرة قياس 21 متصلة بحقنة سعة خمسة ملليلتر وإزالة خمسة ملليلتر من الألبومين.

يؤدي ذلك إلى خفض الجنين بعيدا عن القشرة حتى لا يتضرر الجنين عند فتح القشرة. أعد البيض إلى الحاضنة واحتضنه لمدة يومين آخرين. بمجرد مرور اليومين ، استخدم ضعيفا.

افعل المزيد. رقم خمسة ، ملقط لاختراق الجزء العلوي الأوسط من القشرة بعناية وإزالة حوالي تسعة سنتيمترات مربعة من القشرة. قطع حول الجنين ورفع الجنين بعناية ووضعه في HBSS.

للتشريح. يجب أن تكون جميع الأجنة المستخدمة قريبة من المرحلة 24. يجب التخلص من أي أجنة تظهر عليها أي علامات على الشذوذ.

ضع الطبق الذي يحتوي على الجنين تحت مجهر التشريح. استخدم ملقطين من دو آل رقم خمسة لإزالة غشاء السلى يقوم chorio Alan إلى الغشاء ، وAlan Tous والرأس بعد ذلك بنزع أحشاء الجنين لإزالة جميع الأعضاء الداخلية باستخدام مقص تشريح micros لفتح خط الوسط البطني للجنين.

ثم أمسك الجنين حول منطقة الجذع المنقاري بزوج واحد من الملقط. أمسك الجزء المنقاري من الأمعاء والقلب واسحب. ربع سنوي. يجب أن تكون قادرا على رؤية جسيدات الجنين بوضوح.

الآن قم بقص جدار الجسم الصدري باستخدام مقص التشريح المجهري. بعد ذلك ، قم بقطع الجنين إلى نصفين بشكل عرضي بين براعم الأطراف العلوية والسفلية. قم بإزالة النصف القطني من الجنين المقطوع برفق باستخدام ملقطين لحمل الجنين خارج محلول التشريح وضعه في طبق بتري جاف باستخدام ماصة معكرونة يمكن التخلص منها بحوالي خمسة سنتيمترات.

قطع من الأسفل ، واستنشق ما يقرب من ملليلترين من الوزن المنصهر بنسبة 4٪ لكل حجم. تقوم Aros في ماصة PBS بحوالي 0.5 مل من aros فوق الجنين ثم تمتص قطعة الجنين في الماصة. انقل الجنين والقشر إلى قالب بلاستيكي مقشر دون إدخال فقاعات في الحوس.

اخفض الجنين برفق إلى قاع القوس في القالب البلاستيكي بحيث يكون الجزء الصدري متجها لأسفل واستخدم إبرة قياس 25 للتأكد من أن الجنين مستقيم. سيحتوي agros أيضا على جزء من الطرف النامي ومن المهم أن يتم وضع الأجنة عموديا في aros للسماح لهذا وضع القالب البلاستيكي على الجليد لمدة دقيقتين تقريبا. لضبط aros ، احرص على ألا يغير الجنين اتجاهه خلال هذه الفترة.

قم بإعداد مثل VT 1000 S foma على غرار ذلك بحيث تمتلئ الغرفة ب HBSS وتحيط بها الجليد. ماء بارد. استخدم الغراء الفائق لتثبيت كتلة aros على منصة Vibram ثم قم بقص الكتلة بشفرة حلاقة لترك قطعة الجنين مع واحد إلى ثلاثة ملليمترات من aros تحيط بها.

ابدأ الاهتزاز وابدأ في تقطيع الجنين. يتم اختيار الشرائح التي تتضمن أقسام براعم الأطراف ذات التلال الكهربية القمية الشفافة ثم نقلها إلى طبق HBSS. بشكل عام ، لا يوجد سوى شريحة واحدة أو شريحتين مناسبتين لكل جنين.

قم بإزالة الاغاروز برفق حول شرائح الأنسجة باستخدام إبرتين. من الضروري أن يتم ذلك بدقة وبعناية. أضف 500 ميكرولتر من محلول الاستزراع إلى العدد المطلوب من الآبار لثقافة الأنسجة المرفقة المنخفضة للغاية 24 بئرا.

انقل الشرائح بعناية من محلول HBSS إلى البئر ، وضع شريحتين أو ثلاث شرائح في كل بئر ، ثم ضع صفيحة 24 بئر في حاضنة زراعة الأنسجة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة بعد فترة الاستزراع عند 500 ميكرولتر من التثبيت غير المخزن لكل بئر من شرائح الجنين واتركها على الجليد لمدة 20 دقيقة. ثم قم بشفط المحلول الكلي بعناية واغسله ثلاث مرات في PBS لمدة خمس دقائق. ثم أضف 30٪ من السكروز في PBS إلى الآبار وضع الطبق على أربع درجات مئوية لمدة ست ساعات أو أكثر حتى تغرق الشرائح.

بعد أن تغرق الشرائح ، انقل الشرائح إلى طبق بتري نظيف بطول 10 سم وامسح محلول السكروز الإضافي. ثم أضف ملليلترا واحدا من OCT واترك الشرائح تتوازن لمدة خمس دقائق عند 20 درجة مئوية. قم بتركيب كل شريحة بشكل مسطح في قالب بلاستيكي مملوء ب OCT ، ثم قم بإزالة القالب البلاستيكي بعد التركيب.

ضع القوالب عموديا على الثلج الجاف لترسيخ تركيب كتل OCT على ناظم التبريد وتوازن الكتل عند 24 درجة مئوية تحت الصفر لمدة 20 دقيقة تقريبا. ثم قم بتقطيع كل شريحة إلى أقسام بحجم 15 ميكرون وقم بتثبيتها على الصقيع الفائق بالإضافة إلى الشرائح. يمكن تخزين الشرائح عند 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى تكون هناك حاجة إليها لتلوين الفلورسنت المناعي كما هو موضح في جزء النص من البروتوكول ، توضح هذه الصورة حالة توليد العمود الحركي الجانبي في مرحلة الهامبرغر وهاميلتون 24.

يتم تصور التقسيم الجانبي لعمود المحرك الجانبي بواسطة LH X تلطيخ واحد في اللوحة اليسرى. يتم تصور عمود المحرك الجانبي عن طريق تلطيخ Fox P one في اللوحة المركزية واللوحة اليمنى عبارة عن دمج بين القناتين. يظهر خط الوسط كخط منقط ويشير DV إلى المحور البطني الظهري هنا.

تظهر حالة التقسيم الجانبي لعمود المحرك الجانبي مرة أخرى بواسطة LH X تلطيخ واحد في اللوحة اليسرى وعمود المحرك الجانبي بواسطة Fox P تلطيخ واحد في اللوحة الوسطى مع الصورة المدمجة على اليمين. تظهر هذه الصور التطور في المرحلة 27. تظهر هذه الصور LH X تعبيرا واحدا على اليسار و Fox P تعبيرا واحدا في اللوحة الوسطى في أقسام من شريحة مستزرعة في وسط يدعم بقاء الخلايا العصبية الحركية القحفية المنفصلة.

لم يعد يتم التعبير عن LH X واحد في الخلايا العصبية الحركية ، على الرغم من وجود بعض البقاء على قيد الحياة لخلايا LMC التي يتضح من تعبير Fox P واحد. يمثل DV اتجاه المحور البطني للحبل الشوكي ، ويمثل ML اتجاه المحور الجانبي للوسائط للعمود الحركي الجانبي للحبل الشوكي. يمكن ملاحظة خلايا الانقسام الجانبي ، الملطخة مرة أخرى ل LH X واحد في القرن البطني في اللوحة اليسرى و LMC بشكل عام ملطخ ل Fox P واحد في اللوحة المركزية في شرائح ، مستزرعة في وسط يحتوي على 4٪ مصل كتكوت و 100 نانوجرام لكل مليلتر CNTF.

لاحظ أن بعض خلايا الانقسام الجانبي للعمود الحركي الجانبي توجد في وضع جانبي في القرن البطني كما هو موضح بالسهم الموجود في اللوحة اليسرى. توضح هذه الصورة حالة التعبير عن LH X واحد و Fox P واحد في أقسام من الجنين المحفوظ في OVO أثناء زراعة شرائح الجنين الموضحة سابقا. يوضح هذا الرسم البياني نتائج القياس الكمي للنسبة المئوية لخلايا الانقسام الجانبي للعمود الحركي الجانبي ، والتي تلطخ FOX P موجبة واحدة و LHX واحدة إيجابية مقابل خلايا العمود الحركي الجانبي ، والتي تلطخ FOX P إيجابيا واحدا و LHX واحد.

تظهر البيانات السلبية للخلايا الموجودة في مزارع الشرائح في ظروف مختلفة مقارنة بالأجنة الضابطة المحفوظة في البيض ، والتي تمثل 100٪ تم تحليل البيانات باستخدام اختبار T للطلاب. تمثل العلامة النجمية الثلاثية مستوى أهمية أقل من 0.01 أثناء محاولة هذا البروتوكول. من المهم توخي الحذر عند تشريح الجنين وعند إزالة agros من الشرائح لأنه من المهم الحفاظ على سلامة المحاور الحركية في برعم الأطراف.