الدجاج الأجنة شريحة الحبل الشوكي الثقافة البروتوكول

الهدف العام من هذا الإجراء هو استزراع شرائح من أجنة الدجاج للحفاظ على التطور العصبي الطبيعي، ولا سيما في العصبونات الحركية الشوكية. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تشريح جنين الدجاج لإزالة الأعضاء الحشوية. وتتمثل الخطوة الثانية في تحضير الجنين المدمج في كتلة من الآجار وتقطيعه إلى شرائح.

بعد ذلك، يتم إزالة شريحة الجنين بعناية من الآغار. وتتمثل الخطوة النهائية في نقل شريحة الجنين إلى وسط زراعي، حيث يتم تحضينها لمدة 24 ساعة عند 37 °C. وفي النهاية، يُستخدم المجهر الفلوري المناعي على مقاطع رقيقة من شريحة الجنين لإظهار وجود وموقع العصبونات الحركية الشوكية بعد فترة الزراعة.

وبذلك يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال علم الأحياء العصبي النمائي. على سبيل المثال، الآليات والجزيئات المشاركة في هجرة العصبونات الحركية الشوكية. وبوجه عام، قد يواجه المبتدئون في هذه الطريقة بعض الصعوبات لأن مراحل التشريح في البروتوكول تتطلب دقة وعناية فائقة.

ضع 10 بيضات مخصبة بحيث يكون الجانب الأطول في وضع أفقي داخل حاضنة ذات تيار هواء قسري عند 38 درجة مئوية حتى تصل إلى مرحلتي hamburger وHamilton stage 24. يتطلب هذا عادةً حوالي أربعة أيام من الحضن. وفي اليوم الثاني من الحضن، قم بتعقيم قشرة البيضة عن طريق مسحها بورق مناديل مغموس في 70%Ethanol، ثم اثقب الطرف المسطح لقشرة البيضة بعناية باستخدام إبرة قياس 21 متصلة بمحقنة سعة خمسة ملليلتر، وقم بسحب خمسة ملليلتر من الألبومين.

يؤدي ذلك إلى خفض الجنين بعيداً عن القشرة حتى لا يتضرر الجنين عند فتح القشرة. أعد البيض إلى الحاضنة واتركه يتطور لمدة يومين إضافيين. بمجرد مرور اليومين، استخدم أداة غير مدببة.

المزيد من الخطوات. خامساً، استخدم ملقطاً لثقب الجزء العلوي الأوسط من القشرة بعناية وإزالة مساحة تبلغ حوالي 9 cm² من القشرة. قم بالقص حول الجنين وارفع الجنين بحذر ثم ضعه في HBSS.

لأغراض التشريح. يجب أن تكون جميع الأجنة المستخدمة قريبة من المرحلة 24. ويجب استبعاد أي أجنة تظهر عليها أي علامات تشوه.

ضع الطبق الذي يحتوي على الجنين تحت مجهر تشريحي. استخدم ملقطين من النوع dual number five لإزالة غشاء السلى. قم بإزالة الغشاء الكوريوني السلوي، والallantois، والرأس. بعد ذلك، قم بإفراغ أحشاء الجنين لإزالة جميع الأعضاء الداخلية باستخدام مقص تشريح دقيق لقص الخط الناصف البطني للجنين.

بعد ذلك، ثبّت الجنين من منطقة الجذع المنقارية باستخدام زوج واحد من الملاقط. أمسك الجزء المنقاري من الأمعاء والقلب ثم اسحبهما برفق. يجب أن تكون قادراً على رؤية القطع الجسمية للجنين بوضوح.

الآن، قم بتشذيب جدار الجسم الصدري باستخدام مقص التشريح الدقيق. بعد ذلك، اقطع الجنين إلى نصفين عرضياً بين براعم الأطراف العلوية والسفلية. قم بإزالة النصف القطني من الجنين المشرح برفق باستخدام ملقطين لحمل الجنين من محلول التشريح، ثم ضعه في طبق بتري جاف باستخدام ماصة باستيل disposable بطول خمسة سنتيمترات تقريباً.

قم بالقطع من الأسفل، ثم اسحب حوالي 2 mL من Agar المنصهر بتركيز 4% weight per volume. وباستخدام ماصة PBS، ضع حوالي 0.5 mL من Agar فوق الجنين، ثم اسحب قطعة الجنين داخل الماصة. انقل الجنين وAgar إلى قالب بلاستيكي قابل للنزع دون إدخال فقاعات في Agar.

أنزل الجنين برفق إلى قاع الحلقة (aros) في القالب البلاستيكي بحيث يكون المقطع الصدري مواجهًا للأسفل، واستخدم إبرة قياس 25 gauge للتأكد من استقامة الجنين. ستحتوي الحلقة أيضًا على جزء من الطرف النامي، ومن المهم وضع الأجنة رأسيًا في الحلقة للسماح بذلك؛ لذا ضع القالب البلاستيكي على الثلج لمدة دقيقتين تقريبًا. ولتثبيت الحلقة، احرص على عدم تغيير اتجاه الجنين خلال هذه الفترة.

قم بإعداد جهاز مشابه لـ VT 1000 S بحيث تكون الحجرة مليئة بمحلول HBSS ومحاطة بالثلج والماء البارد. استخدم الغراء الفائق لتثبيت كتلة الـ aros على منصة Vibram، ثم قم بتشذيب الكتلة باستخدام شفرة حلاقة لترك قطعة الجنين محاطة بـ 1 إلى 3 مليمترات من الـ aros.

قم بتشغيل جهاز التقطيع الاهتزازي وابدأ بتقطيع الجنين. يتم اختيار الشرائح التي تحتوي على مقاطع من برعم الطرف مع وجود حافة جلدية قميّة واضحة، ثم تُنقل إلى طبق يحتوي على HBSS. وعادةً ما يتوفر شريحة واحدة إلى شريحتين مناسبتين فقط لكل جنين.

قم بإزالة الأجاروز المحيط بشرائح الأنسجة برفق باستخدام إبرتين. من الضروري القيام بهذه الخطوة بدقة وعناية فائقة. أضف 500 µL من محلول الزرع إلى العدد المطلوب من آبار طبق زرع أنسجة مكون من 24 بئراً فائق انخفاض الالتصاق.

انقل الشرائح بعناية من محلول HBSS إلى الفجوة، مع وضع شريحتين أو ثلاث شرائح في كل فجوة، ثم ضع طبق الـ 24 فجوة في حاضنة زراعة الأنسجة عند 37 درجة مئوية مع 5% carbon dioxide لمدة 24 ساعة. بعد فترة الزراعة، أضف 500 microliters من المثبت غير المنظم (unbuffered fix) إلى كل فجوة تحتوي على شرائح الأجنة، واتركها على الثلج لمدة 20 دقيقة. بعد ذلك، اشفط المحلول بالكامل بعناية واغسلها ثلاث مرات في PBS على فترات زمنية مدتها خمس دقائق. ثم أضف 30% sucrose في PBS إلى الفجوات وضع الطبق عند 4 درجة مئوية لمدة ست ساعات تقريبًا أو لفترة أطول حتى تغوص الشرائح.

بعد أن تغوص الشرائح، انقلها إلى طبق بتري نظيف بقطر 10 سنتيمتر وجفف محلول السكروز الزائد بالتربيت. ثم أضف 1 مل من OCT واترك الشرائح لتتوازن لمدة خمس دقائق عند 20 درجة مئوية. قم بتثبيت كل شريحة بشكل مسطح في قالب بلاستيكي قابل للنزع مملوء بـ OCT، ثم انزع القالب بعد التثبيت.

ضع القوالب عمودياً على الثلج الجاف لتجميد تثبيت كتل OCT على الميكروتوم المجمد (cryostat)، واترك الكتل لتتوازن عند درجة حرارة -24 °C لمدة 20 دقيقة تقريباً. بعد ذلك، قم بتقطيع كل شريحة إلى مقاطع بسمك 15 micron وثبتها على شرائح super frosts plus. يمكن تخزين الشرائح عند درجة حرارة -80 °C حتى يحين وقت استخدامها في الصبغ المناعي الفلوري كما هو موضح في الجزء النصي من البروتوكول؛ وتوضح هذه الصورة حالة تكوين العمود الحركي الجانبي في مرحلة hamburger and Hamilton stage 24.

يظهر التقسيم الجانبي للعمود الحركي الجانبي من خلال صبغ LH X one في اللوحة اليسرى. ويظهر العمود الحركي الجانبي من خلال الصبغ بـ Fox P one في اللوحة المركزية، بينما تمثل اللوحة اليمنى دمجاً للقناتين. يشار إلى الخط المتوسط بخط منقط، ويرمز DV هنا إلى المحور الظهري البطني.

تظهر حالة الانقسام الجانبي للعمود الحركي الجانبي مرة أخرى من خلال صبغ LH X one في اللوحة اليسرى، ويظهر العمود الحركي الجانبي من خلال صبغ Fox P one في اللوحة الوسطى، مع الصورة المدمجة على اليمين. وتوضح هذه الصور التطور في المرحلة 27. كما تُظهر هذه الصور تعبير LH X one على اليسار وتعبير Fox P one في اللوحة الوسطى في مقاطع من شريحة مستزرعة في وسط يدعم بقاء خلايا العصبونات الحركية القحفية المفككة.

لم يعد يتم التعبير عن LH X one في العصبونات الحركية، على الرغم من وجود بعض البقاء لخلايا LMC كما يتضح من التعبير عن Fox P one. ويمثل DV اتجاه المحور الظهري البطني للنخاع الشوكي، بينما يمثل ML اتجاه المحور الإنسي الجانبي للعمود الحركي الجانبي في النخاع الشوكي. ويمكن ملاحظة خلايا القسم الجانبي، المصبوغة مجددًا بـ LH X one في القرن البطني في اللوحة اليسرى، والـ LMC بشكل عام المصبوغة بـ Fox P one في اللوحة المركزية، وذلك في شرائح مستزرعة في وسط يحتوي على 4%chick serum و 100 nanograms per milliliter CNTF.

لاحظ أن بعض خلايا القسم الجانبي من العمود الحركي الجانبي توجد في موضع جانبي في القرن البطني كما يشير السهم في اللوحة اليسرى. تُظهر هذه الصورة حالة تعبير LHX1 و FoxP1 في مقاطع من جنين تم الحفاظ عليه في البيضة (OVO) خلال زراعة شرائح الجنين الموضحة سابقاً. يوضح هذا المدرج التكراري نتائج تقدير النسبة المئوية لخلايا القسم الجانبي من العمود الحركي الجانبي، التي تظهر صبغة إيجابية لـ FOXP1 و LHX1، مقابل خلايا العمود الحركي الجانبي التي تظهر صبغة إيجابية لـ FOXP1 و LHX1.

تظهر البيانات السلبية للخلايا الموجودة في مزارع الشرائح تحت ظروف مختلفة مقارنة بالأجنة الضابطة المحفوظة داخل البيضة (in ovo)، والتي تمثل 100%. تم تحليل البيانات باستخدام اختبار T للطلاب (students T-test). وتمثل النجمات الثلاث مستوى دلالة أقل من 0.01. عند تطبيق هذا البروتوكول، من المهم توخي الحذر أثناء تشريح الجنين وعند إزالة الأجراس من الشرائح، وذلك للحفاظ على سلامة المحاور الحركية في برعم الطرف.