تسليخ مجهري ليزر لقطة من السكان المخصب من الخلايا العصبية أو الخلايا العصبية واحدة لتحليل التعبير الجيني بعد إصابات في الدماغ

الهدف العام من هذا الإجراء هو توضيح كيفية الحصول على مجموعات غنية من الخلايا العصبية في الحصين والخلايا العصبية المفردة من أقسام الأنسجة المجمدة عن طريق التشريح الدقيق لالتقاط الليزر لتحليل التعبير الجيني اللاحق. يتم تحقيق ذلك عن طريق التخدير الأول ، وهو فأر في غرفة التخدير. ثم يتم تنبيب الجرذ وتهويته ميكانيكيا ووضعه في حامل رأس تجسيمي لإعداد الفئران لإصابة الدماغ الإيقاعية السائلة ، يتم إجراء بضع القحف.

الخطوة الثانية هي إدارة إصابة الدماغ بالإيقاع السائل. بعد ذلك ، يتم قطع الأجزاء الإكليلية من الدماغ على ناظم البرد وتلطيخها إما بمساعدة فلورو ، وهي علامة على الخلايا العصبية المتدهورة ، أو البنفسجي الحقيقي ، وصمة عار صاروخية. الخطوة الأخيرة هي إجراء الالتقاط بالليزر والتشريح الدقيق وجمع الخلايا العصبية المفردة أو مجموعات الخلايا العصبية.

في النهاية ، يتم عزل الحمض النووي الريبي الكلي عن الخلايا التي تم التقاطها ، وتحليلها للتأكد من جودتها وقياسها كميا باستخدام محلل حيوي Agilent واستخدامها في التطبيقات النهائية مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي وتحليل المصفوفات الدقيقة التي تركز على المسار أو على مستوى الجينوم. الميزة الرئيسية لهذه التقنية للطرق الحالية مثل التشريح الدقيق اليدوي ، هي أنه يمكننا الحصول على مجموعات غنية من الخلايا العصبية أو أنواع خلايا الدماغ الأخرى مثل الخلايا الدبقية أو الخلايا المعدلة للمناعة ، أو الخلايا العصبية المفردة من أقسام الأنسجة. هذا يسمح لنا بإجراء تحليل التعبير الجيني في أنواع الخلايا المحددة المتميزة في الدماغ وفي الأنسجة الأخرى غير المتجانسة المكونة من أنواع متعددة من الخلايا ، مما يدل على أن هذا الإجراء سوف يفوت.

ديبي بون ، باحثة مشاركة أولى في مختبرنا. أولا ، استرجع أنسجة المخ التي تم الحصول عليها من الفئران المصابة بإيقاع السوائل أو إصابة الدماغ الرضحية أو الإصابة الوهمية من الفريزر 80 درجة مئوية تحت الصفر ، وانتقل إلى 22 درجة مئوية تحت الصفر. ناظم البرد لمدة 10 دقائق لإحضار الدماغ إلى درجة حرارة التقسيم أثناء ذوبان الدماغ.

امسح ناظم الثلاجة باستخدام RNA zap الذي يحتوي على الإيثانول ونظف الفرشاة بالإيثانول. بعد مرور 10 دقائق ، أخرج الدماغ من الأنبوب وضعه بطنيا لأعلى على قطعة من الشاش في مرحلة ناظم البرد ، واستخدم شفرة حلاقة جديدة وقم بتقطيع الدماغ لإزالة الجزء الخلفي من الدماغ. فقط المنقاري إلى المخيخ والجزء الأمامي في chiasm البصري.

املأ قالب التبريد بوسيط تثبيت OCT وضع الدماغ في القالب مع الجانب الأمامي لأسفل. اترك أنسجة المخ تتجمد في وسط التركيب حتى تتحول إلى اللون الأبيض. يجب أن يستغرق هذا حوالي 10 دقائق.

الآن قم بتجميد قرص العينة على الدماغ باستخدام OCT. ثم قم بإزالة القالب. أدخل القرص مع توصيل الدماغ برأس العينة وشد البراغي.

أدخل شفرة منخفضة الارتفاع يمكن التخلص منها في حامل السكين وشد الرافعة لأسفل. ابدأ في تقطيع الدماغ إلى شرائح 20 ميكرون لإزالة الطبقة الخارجية من OCT. بمجرد الوصول إلى منطقة الحصين ، اضبط قرص الميكرون على 10.

اجمع المقاطع التسلسلية الإكليلية عن طريق وضع شريحة زجاجية أو زجاج زائد. انزلق على قسم المناديل. ضع الشرائح في رف تلطيخ خال من الحمض النووي الريبي عند 20 درجة مئوية تحت الصفر حتى يكتمل التقسيم.

قبل الشروع في تلطيخ الأقسام ، امسح جميع حاويات التلوين والأسطوانات المتدرجة ب ese واشطفها بماء مللي كيو. تأكد من تحضير جميع المحاليل بالماء الخالي من الحمض النووي الريبي وأن صبغة اليشم البنفسجي والفلوري قد مرت عبر مرشح 0.2 ميكرون من قبل. استخدم أقسام دماغ ثور في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 ثانية وثبتها في 75٪ من الإيثانول لمدة دقيقة واحدة.

ثم انتقل إلى وصمة العداد المناسبة ل LCM إما من مساحات من الخلايا العصبية أو الخلايا العصبية الفردية ل LCM من مساحات من الخلايا العصبية بعد التثبيت ، اشطف الشرائح في ماء خال من الحمض النووي الريبي لمدة دقيقة واحدة مع 1٪ قمة البنفسجي لمدة دقيقة واحدة. اشطف بالماء الخالي من الحمض النووي الريبي ثلاث مرات لمدة دقيقة واحدة لكل مجفف بنسبة 95٪ إيثانول مرتين لمدة 30 ثانية لكل منهما. ثم 100٪ إيثانول مرتين لمدة 30 ثانية والزيلين مرتين لمدة ثلاث دقائق لكل منهما.

بعد تلطيخ الهواء ، جفف جميع الأقسام في غطاء الدخان لمدة 15 دقيقة ثم انتقل إلى LCM.Here. يتم تنفيذ المضاعف المشترك الأصغر حجما. باستخدام مجهر P خلية E مع ليزر الصمام الثنائي بالأشعة تحت الحمراء ، اضبط أولا عصا التحكم المركزية على الوضع الرأسي.

ثم قم بتدوير هدف الفوركس وقفله في موضعه. ضع شريحة بها أقسام الحصين الملطخة في وسط مرحلة المجهر واضبطها يدويا حتى تظهر منطقة الحصين. استخدم الدورة التدريبية وابحث عن تعديلات التركيز.

لتركيز القسم، قم بتنشيط ظرف التفريغ بالضغط على زر التفريغ الموجود على وحدة التحكم. ثم قم بتدوير وقفل الهدف 10 × في مكانه. ركز مرة أخرى مع المسار والتعديلات الدقيقة.

قم بتحميل أغطية المضاعف المشترك الأصغر للماكرو في الأغطية ووحدة الكاسيت الخاصة بك ووضع غطاء في موضع خط التحميل. قم بتدوير ذراع وضع الغطاء وضعه حول الغطاء. ثم ارفع ذراع وضع الغطاء لإزالة الأغطية الموجودة على الغطاء من وحدة الكاسيت.

قم بتدوير ذراع وضع الغطاء فوق الشريحة ثم قم بخفضها لأسفل فوق الشريحة لوضع الغطاء على الشريحة. اضبط التركيز الدقيق وحرك عصا التحكم للتحقق مما إذا كانت الخلايا داخل الدائرة السوداء على الغطاء. يجب أن تكون جميع الخلايا المراد التقاطها داخل هذه الدائرة السوداء.

الآن قم بتعيين معلمات الليزر. اضغط أولا على زر تمكين الليزر على وحدة التحكم. ستكون بقعة الليزر المستهدفة مرئية باللون الوردي.

في مجال الرؤية على شاشة الكمبيوتر. اضبط حجم بقعة الليزر على صغير لتركيز الليزر واضبط الطاقة والمدة على 65 إلى 75 مللي واط لمدة ثانية إلى مللي ثانية حسب الحاجة لالتقاط الخلايا بشكل مثالي. لاختبار الليزر ، استخدم عصا التحكم لنقل بقعة الليزر إلى منطقة لا توجد فيها خلايا لالتقاطها.

أطلق الليزر باستخدام مفتاح الإبهام. ثم استخدم عصا التحكم لتحريك بقعة الليزر بعيدا عن بقعة البوليمر الذائبة وتحقق لمعرفة ما إذا كانت هناك حلقة داكنة مرئية تحيط بمنطقة واضحة حيث تم إطلاق الليزر. لالتقاط الخلايا ، استخدم عصا التحكم لتحريك بقعة الليزر فوق منطقة الخلايا لالتقاط الليزر وإطلاقه.

باستخدام مفتاح الإبهام ، حرك عصا التحكم أثناء إطلاق الليزر لالتقاط مساحة كبيرة من الخلايا. بعد إطلاق جميع الخلايا ذات الأهمية ، ارفع ذراع وضع الغطاء. ستنفصل الخلايا التي تم التقاطها عن قسم الأنسجة وتلتصق بالغطاء.

سيظهر الغطاء والأنسجة المتبقية والخلايا المفقودة في مجال الرؤية. يمكن أيضا عرض الخلايا الموجودة على الغطاء عن طريق وضع الغطاء على جزء فارغ من الشريحة. ارفع ذراع وضع الغطاء وقم بتدويره إلى محطة تفريغ الغطاء.

اخفض الغطاء في المحطة وقم بتدوير ذراع وضع الغطاء مرة أخرى إلى موضعه السابق. حرك الغطاء وأداة الإدخال على طول المنصة وعلى الغطاء. ارفع الأداة مع الغطاء المرفق من المنصة.

المس الغطاء برفق بالجزء اللاصق من ملاحظة لاصقة لتنظيف الأنسجة غير المرغوب فيها. ضع الغطاء في أنبوب خال من الحمض النووي الريبي سعة 0.5 مل مملوء ب 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل الذي تم الحصول عليه من مجموعة العزل الدقيق المائي RN. قم بدوامة الغطاء على الفور لمدة 30 ثانية للكذب.

تحتضن الخلايا العينات عند 42 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة وتتجمد عند 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى عزل الحمض النووي الريبي. يشبه إجراء تلطيخ المضاعف المشترك الأصغر للخلايا العصبية المفردة المصابة بعد التثبيت الإجراء الخاص بمساحات من الخلايا العصبية. ومع ذلك ، تختلف بعض أوقات الحضانة والأقسام التي تتحمل الفلورايد لمدة أربع دقائق قبل الشطف والجفاف ، راجع الجزء النصي من البروتوكول للحصول على التفاصيل بعد التلوين.

مرة أخرى ، جفف جميع الأقسام بالهواء في غطاء الدخان لمدة 15 دقيقة. قبل المتابعة إلى المضاعف المشترك الأصغر لالتقاط أغطية تحميل الخلايا المفردة HS LCM في الغطاء أو وحدة الكاسيت باستخدام نفس الإجراء المتبع في غطاء المضاعف المشترك الأصغر للماكرو. مرة أخرى ، اضبط حجم بقعة الليزر على صغير لتركيز الليزر ، ولكن هذه المرة اضبط قوة الليزر ومدته على 65 إلى 75 مللي واط لمدة 0.45 إلى 0.5 مللي ثانية لالتقاط الخلايا المثلى للخلايا المفردة.

قم بتدوير ذراع وضع الغطاء فوق الشريحة وقم بخفض الذراع لأسفل باتجاه الشريحة. لوضع الغطاء فوق الشريحة، يجلس سطح غطاء HS الملتقط مرتفعا من العينة. أثناء LCM ، استخدم عصا التحكم لتحريك الليزر فوق الخلايا الموجبة لمساعدة الفلور الفردي.

يجب أن تكون جميع الخلايا التي يتم التقاطها داخل الحلقة السوداء الصغيرة الموجودة على الغطاء ، وإطلاق الليزر باستخدام مفتاح الإبهام. عندما يتم إطلاق جميع الخلايا داخل منطقة الدائرة السوداء باستخدام الرفع بالليزر ، وذراع وضع الغطاء ، ستنفصل الخلايا الملتقطة عن قسم الأنسجة وتلتصق بغطاء hs الملتقط. الآن ضع شريحة أخرى على مرحلة المجهر واجمع الخلايا الإيجابية لمساعد الفورو حتى يمتلئ غطاء النظام المنسق.

ثم ضع الغطاء في أنبوب خال من الحمض النووي الريبي سعة 0.5 مل مملوء ب 40 إلى 50 ميكرولتر من التحلل والمخزن المؤقت والدوامة والحاضنات قبل التجميد مرة أخرى عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. إذا لم يتم إجراء عزل الحمض النووي الريبي على الفور وفقا للتعليمات الواردة في الجزء النصي من البروتوكول. تظهر الصور التالية التشريح الدقيق لالتقاط الليزر لمساحات من مجموعات خلايا معينة من دماغ الفئران المجمدة 10 ميكرون من دماغ الفئران.

تم تحضيرها وفقا لهذا البروتوكول وملطخة بصبغة البنفسج والصاروخ. تظهر هذه الصورة الخلايا العصبية شبه المعدنية من الحقول الفرعية من الحجين الواحد إلى حوالي ثلاثة حقول فرعية من الحصين الفئران. هنا ، تم التقاط الخلايا الحبيبية في التلفيف المسنن في الحصين.

أخيرا ، نعرض مساحات من الخلايا العصبية التي تم التقاطها من نوى chiasma الثنائية الموجودة على جانبي البطين الثالث وفوق chiasma البصري. يحتوي SCN على الساعة البيولوجية الرئيسية التي تتحكم في إيقاعات الساعة البيولوجية في جميع أنحاء الجسم. تظهر الصور التالية التشريح الدقيق لالتقاط الليزر للخلايا العصبية المفردة من الحصين الفئران.

كما هو موضح هنا الفلورايد الإيجابي الحصين CA ثلاث خلايا عصبية هنا الناجين من مساعدة فلورو السالبة ، ثلاث خلايا عصبية قبل وبعد المضاعف المشترك الأصغر ، يتم تصور الخلايا الملتقطة على غطاء المضاعف الأصغر حجما. أظهرت الصور التالية تحليل التعبير الجيني للحمض النووي الريبي الكلي ، المعزول من الخلايا العصبية الملتقطة بالليزر. تظهر هذه الصورة بيانات PCR الكمية في الوقت الفعلي للتعبير الجيني على مدار الساعة البيولوجية في SCN.

تظهر هذه الخريطة الحرارية للتعبير الجيني في الخلايا العصبية في الحصين المحتضرة والباقية على قيد الحياة التنميط التعبيري للجينات المرتبطة بموت الخلايا المبرمج باستخدام مصفوفات تفاعل البوليميراز المتسلسل المركزة. أخيرا ، نعرض مثالا على خريطة حرارية تم إنشاؤها من تحليل المصفوفة الدقيقة للأنف والأذن والحنجرة الجينوم الكامل للتعبير الجيني في كاليفورنيا واحد إلى ثلاثة خلايا عصبية عصبية من الفئران التي تلقت إصابة زائفة TBI أو TBI بالإضافة إلى فيروس siRNA المرتبط بالغدة الراقد المصمم لإسقاط التعبير عن أكسيد النيتريك العصبي أو سينتاز أو الجلوتاثيون بيروكسيداز واحد ، كلاهما جينات ناتجة عن إصابة الدماغ بعد تطورها. مهدت هذه التقنيات الطريق للعلماء في العديد من مجالات البحث ، بما في ذلك إصابات الدماغ والسرطان الذين يستخدمون نماذج حيوانية لهذه الاضطرابات لإجراء التنميط البروتيني والتمثيلي الجيني لمجموعات خلايا معينة.

على سبيل المثال ، نستخدم حاليا هذه التقنيات لالتقاط مجموعات خلايا معينة بالليزر من قشرة الفص الجبهي ومناطق الدماغ في النواة المتكئة المعروفة بتورطها في الإدمان.