إنشاء تدرجات لاصق وقابل للذوبان للهجرة الخليوي مع التصوير مضان المجهري

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنشاء تدرجات لاصقة وذائبة لدراسة هجرة الخلايا. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق خمل السطح لمنع التصاق الخلايا غير النوعي. وتتمثل الخطوة الثانية في تصنيع أختام باستخدام الطباعة بالتلامس الدقيق.

بعد ذلك، يتم نقش السطح المعالج بخطوط من الستربتافيدين (strep avid) بواسطة الطباعة بالتلامس الدقيق. كما يمكن طباعة الستربتافيدين على شكل نقاط باستخدام تقنية الليثوغرافيا بقلم الغمس المثبت في الجزء السفلي من جهاز الموائع الدقيقة. سيعمل السطح المعدل كأساس لتدرج لاصق من البيوتين RGD.

تتمثل الخطوة النهائية في تحميل الخلايا على السطح الذي يحتوي على إشارة الالتصاق في وجود تدرج من الجاذب الكيميائي القابل للذوبان. وفي النهاية، يُستخدم مجهر الخلايا الحية لإظهار هجرة الخلايا استجابةً لكل من الإشارات اللاصقة والقابلة للذوبان. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنةً بالطرق الحالية، مثل مقايسة transwell أو مقايسة الغرفة الفارغة (void chamber assay) وإعدادات الموائع الدقيقة التقليدية، في أن هذا النظام المتكامل من جهاز الموائع الدقيقة ذي الأنماط السطحية يسمح بمراقبة استجابات الخلايا لإشارات الالتصاق المتحكم بها مكانياً وتدرج الالتصاق والتدرج القابل للذوبان في آن واحد.

يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال هجرة الخلايا، مثل أهمية التصاق الخلايا والتواصل المتبادل بين المستقبلات الكيميائية مثل receptor seen kinase وG-protein coupled receptors ومستقبلات الالتصاق. لتجهيز شرائح الغطاء الزجاجية، قم أولاً بتنظيف شرائح الغطاء عن طريق غمرها في حامل داخل إيثانول 100%، ووضع الحامل في حمام مائي يعمل بالموجات فوق الصوتية لمدة 30 دقيقة. ثم جفف شرائح الغطاء الزجاجية في الهواء.

بعد ذلك، قم بمعالجة شرائح الغطاء الزجاجية بجهاز سونيكيتور لمدة 30 دقيقة في محلول هيدروكسيد الصوديوم بتركيز 1 molar. بعد ذلك، اشطف الأسطح الزجاجية عن طريق إمالة الحامل بعناية في بيكر مملوء بـ 1.5 لتر من ماء Milli-Q. كرر عملية الشطف ثلاث مرات باستخدام ماء Milli-Q نقي في كل مرة.

بعد الشطفة الثالثة، جفف شرائح الغطاء الزجاجية في فرن عند 60 degrees Celsius لمدة نصف ساعة تقريبًا. ضع نصف شرائح الغطاء الزجاجية النظيفة بشكل فردي في غرفة ترطيب مكونة من طبق 24 well plate، مملوء جزئيًا بالماء. يتم ملء الآبار بالماء وتوضع شرائح الغطاء الزجاجية فوق الآبار من أجل الـ ation، حيث يُستخدم كوبوليمر من polylysine و polyethylene glycol والذي يتم فيه تطعيم 20% من جزيئات peg بالبيوتين.

يُشار إليه اختصاراً بـ PLL Peg biotin؛ ضع 15 µL من PLL Peg biotin في محلول PBS على كل شريحة غطاء زجاجية. خذ النصف الآخر من شرائح الغطاء الزجاجية النظيفة المتبقية وقم بتغطية محلول PEG بعناية بين شريحتين. اترك شرائح الغطاء لمدة ساعة واحدة في غرفة رطبة.

بعد مرور ساعة، تُسحب الغطاءات المتراكبة بلطف بعيداً عن بعضها البعض دون كشط السطح المغطى بـ PEG، ثم تُشطف باستخدام ماء UE. يجب أن ينزلق الماء بسهولة عن الجانب المعالج بـ peg. عند الضرورة.

جفف شرائح الغطاء الزجاجية بالهواء على مناديل ورقية مع توجيه السطح المعالج للأعلى. تخزن شرائح الغطاء الزجاجية في مجفف تفريغ حتى وقت الاستخدام. يتم تصنيع القالب السيليكوني المطلوب لهذا الإجراء عن طريق الطباعة الحجرية الضوئية لصب ختم A-P-D-M-S، حيث يوضع elastomer PDMS فوق القالب السيليكوني داخل طبق بتري بارتفاع يصل إلى 1 cm تقريبًا، ثم يعالج القالب ومزيج PDMS في فرن عند 70 °C لمدة ساعة واحدة.

بعد ذلك، يتم إزالة ختم PDMS من القالب السيليكوني وقصه للحجم المطلوب لطباعة أنماط بروتينية باستخدام تقنية الطباعة بالتلامس الدقيق؛ أولاً يتم التنظيف وجعل أختام PDMS أكثر حبّة للماء عن طريق معالجة جانب النمط في جهاز تنظيف بالأشعة فوق البنفسجية والأوزون لمدة ساعة ونصف. وفور الانتهاء من معالجة الأوزون، يتم وضع وتوزيع 10 µL من streptavidin على أختام PDMS. وفي حال الرغبة في رؤية المسارات تحت المجهر الفلوري، يُستخدم streptavidin مقترن بفلوروفور، مثل streptavidin- Alexa Fluor 647.

اتركه لمدة ساعة واحدة في غرفة رطبة. قم بإزالة فائض الـ strep din من الختم باستخدام منديل ورقي والهواء. جفف الختم لمدة دقيقة واحدة تقريباً.

اضغط برفق بالختم على شريحة غطاء زجاجية مطلية بالبيوتين ومثبتة بـ PLL peg. في حال استخدام strep din الفلوري، افحص النمط تحت مجهر فلوري انعكاسي (epi fluorescence microscope). كما يمكن طباعة أنماط البروتين باستخدام تقنية الليثوغرافيا بالقلم الغاطس (dip pen lithography).

أولاً، اخلط جزءاً واحداً من محلول بتركيز 1 mg/mL من avidan elif Fluor three 50 (سواء كان strippin أو stripped) مع 10 أجزاء من glycerol، ثم حمّل 5 µL من الخليط على الرافعة (cantilever). اضبط سرعة الطباعة، ووقت تلامس الرافعة مع السطح أو المسافة الرأسية للرافعة عن السطح لتقليل حجم البقعة.

تبدأ عملية الطباعة بوضع كمية تبلغ 5 µm تقريباً كما هو موضح في دليل تشغيل جهاز الطباعة الحجرية بالقلم الغاطس. تُحفظ جميع الأسطح المطبوعة في مجفف. ويُستخدم جهاز ميكروفلويديك متاح تجارياً لإنشاء تدرجات سطحية.

قم بتثبيت هذه الرقائق الزجاجية المغطاة أو المنقوشة بمادة tritin على الجانب اللاصق من الجهاز لضمان عدم حدوث أي تسرب لعدة ساعات. أغلق حواف الجهاز بطبقة رقيقة من الفازلين الدافئ، ثم بطبقة ثانية من خليط يتكون من جزء واحد من الفازلين إلى جزء واحد من شمع البارافين. املأ قناة الجهاز بـ 6 µL من PBS لإنشاء تدرجين متقابلين.

املأ الخزانين، أحدهما بـ 70 µL من الـ biotin fluorescein والآخر بـ 70 µL من الـ biotin المقترن بالببتيد المبيوتني arginine glycine spartic acid أو RGD، ثم حضن العينات في درجة حرارة الغرفة وفي الظلام لمدة ساعة واحدة. يُعد شطف الـ biotin والـ RGD والـ biotin fitsy من الجهاز الموائع الدقيقة (microfluidic device) الجانب الأكثر صعوبة في هذا الإجراء، نظراً لوجود خطر احتجاز فقاعات الهواء وإزعاج المسارات المطبوعة بالاتصال الدقيق (micro contact printed tracks). ولضمان النجاح، يجب إزالة الـ biotin والـ PBS بعناية وببطء.

قم بإزالة محاليل البيوتين وشطف السطح بعناية مرتين باستخدام PBS بينما لا تزال مثبتة في جهاز الموائع الدقيقة. حدد اتجاه التدرج اللاصق قبل تحميل الخلايا الموسومة فلورياً في جهاز الموائع الدقيقة. قم بعدّ الخلايا وتوزيعها على أنبوبين بأعداد متساوية من الخلايا.

اغسل الخلايا وأعد تعليقها. قم بتعليق أنبوب واحد من الخلايا في وسط يحتوي على المادة الجاذبة الكيميائية، مثل DMEM منخفض الجلوكوز مع 10% FBS، وأنبوب الخلايا الآخر في وسط خالٍ من المادة الجاذبة الكيميائية، مثل DMEM مع 0% FBS، بحيث يكون التركيز النهائي للخلايا في كل أنبوب 5 × 10⁵ خلية/ملل.

قم بإزالة جميع المحاليل من جهاز الموائع الدقيقة وضعه على المجهر المسخن مسبقاً. قم بتحميل 70 µL من الخلايا المعلقة في 0% F-B-S-D-M-E-M في أحد الخزانات. ثم قم بتحميل 70 µL من الخلايا المعلقة في 10% F-B-S-D-M-E-M في الخزان الآخر.

ضع شريطاً لاصقاً بشكل فضفاض فوق الخزانات لتجنب التبخر. تأكد من أن قناة الجهاز الموائع الدقيقة تقع ضمن مجال الرؤية وأن الخلايا في بؤرة التركيز. حدد معاملات التقاط الصور مثل أوقات التعريض والمرشحات الفلورية.

تسلسل صور للمجهر ذي المجال المضيء والفلورية يحدد الخلايا والمسارات بالإضافة إلى النقاط الزمنية ومدة التسجيل لبدء برنامج الحصول على الصور. يستعرض هذا الفيديو طريقة للتصوير الحي للخلايا التي تهاجر في بيئة تحتوي على تدرجات متنافسة من المواد اللاصقة والقابلة للذوبان. وقد تم إنشاء مسارات لاصقة تحتوي على strippin فلوري وRGD مبيوتني (biotinylated RGD) باستخدام الطباعة بالتلامس الدقيق أو الطباعة الحجرية بقلم الغمس.

يُستدل على نجاح الطباعة بالتلامس الدقيق من خلال مخطط الخط لشدة الفلورة عبر المسارات، حيث يمكن التمييز بوضوح بين المسارات اللاصقة والمناطق المضادة للاتساخ. تظهر النقاط المطبوعة باستخدام طباعة القلم الغاطس مستديرة وليست على شكل دمعة، مما يشير إلى نجاح عملية الطباعة. في هذا المثال، طُبعت النقاط في خط مع تحديد المسافة الفاصلة بين الصفوف والأعمدة من 10 إلى 15 micrometers.

تعد هذه المسافة كافية لمنع اندماج النقاط مع بعضها البعض، ولكنها تسمح بمشاهدة نقاط متعددة في مجال رؤية واحد. وباستخدام معظم إعدادات المجهر، تم إنشاء تدرج من الإشارات اللاصقة على المسار المطبوع باستخدام جهاز ميكروفلويديك بسيط، وذلك عن طريق تحميل biotin four fluorescein و biotin RGD في الجانبين المتقابلين من لوحة غرفة الميكروفلويديك.

يُظهر الشكل 60 صوراً فسيفسائية تم التقاطها بطول إجمالي للصورة يبلغ 3072 micrometers. وفي اللوحة B، تم قياس شدة الفلورة على طول الفسيفساء بأكملها. وقد تم تطبيق خطوط اتجاه خطية على شدة الفلورة للإشارة إلى تدرج RGD في القناة.

بعد إزالة محلول biotin RGD، يمكن استخدام الغرفة نفسها لتقديم تدرج قابل للذوبان. يوضح اللوح A شدة الفلورة لصبغة fluorescein بالقرب من خزانات PBS وfluorescein وعبر القناة عند الزمن T يساوي صفر. ويوضح اللوح B شدة الفلورة للإشارات القابلة للذوبان.

بعد تحضين لمدة 16 ساعة، تشير النتائج المتقاربة إلى أن التدرج كان مستقراً لمدة 16 ساعة على الأقل. وقد لوحظت هجرة الخلايا في غرفة ميكروفلويديك ذات تدرجات متقابلة باستخدام هذه الطريقة، ويظهر هنا مقطع فيديو تمثيلي. كان التدرج اللاصق عبارة عن RGD مثبت على مسارات strep avidan، بينما تراوح التدرج الذائب من 0 إلى 10%FBS.

تم التقاط الصور كل 15 دقيقة لمدة إجمالية بلغت 20 ساعة. يظهر الانتقال الصوري بمعدل ثماني إطارات في الثانية. هذا المقطع الثاني يوضح خلية heli واحدة تهاجر نحو مصدر FBS.

يظهر انتقال الصور بمعدل ثماني إطارات في الثانية. تم الحصول على الخط الأزرق الذي يمثل مسار الخلية عبر برنامج لتتبع الخلايا. يوضح هذا الرسم البياني الأخير مسارات الخلايا من الصور الواردة في المقطع المرئي الأول.

تظهر مسارات الخلايا التي هاجرت باتجاه التركيز الأعلى من FPS القابل للذوبان باللون الأحمر، بينما تظهر مسارات الخلايا التي هاجرت باتجاه التركيزات الأعلى من RGD الملتصق باللون الأسود. وأظهرت هذه المسارات أن عددًا أكبر من خلايا hela قد هاجر باتجاه مصدر الجاذب الكيميائي مقارنة بالهجرة نحو التركيزات الأعلى من RGD الملتصق. وأثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر تجنب تبخر PBS أو الوسط الغذائي في الجهاز الموائع الدقيقة (microfluidic device) أثناء تحضير تدرج الالتصاق والتصوير الحي، واستخدام شريط لاصق إذا لزم الأمر لتغطية جميع مداخل الجهاز الموائع الدقيقة عند اتباع هذا الإجراء.

يمكن إجراء طرق أخرى مثل transfection ومجهر المحلول الهجين (hybrid solution microscopy) للإجابة على أسئلة إضافية، مثل الميكانيكا الحيوية للهيكل الخلوي التي تعمل بواسطة البروتين، وبروتينات الالتصاق البؤري والمستقبلات أثناء هجرة الخلايا.