إنشاء تدرجات لاصق وقابل للذوبان للهجرة الخليوي مع التصوير مضان المجهري

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنشاء تدرجات لاصقة وقابلة للذوبان لدراسة هجرة الخلايا. يتم تحقيق ذلك عن طريق التخميل أولا ، وهو سطح لمنع التصاق الخلايا غير المحدد. الخطوة الثانية هي تصنيع الطوابع من طباعة الاتصال الصغير.

بعد ذلك ، يتم تصميم السطح المزخرف بخطوط متعطشة للبكتيريا العقدية عن طريق طباعة الاتصال الدقيقة. يمكن أيضا طباعة الدين المربوطة كنقاط باستخدام الطباعة الحجرية للقلم المنخفض المرفقة بالجزء السفلي من جهاز الموائع الدقيقة. سيكون السطح المعدل بمثابة أساس لتدرج لاصق للبيوتين RGD.

الخطوة الأخيرة هي تحميل الخلايا على السطح باستخدام الإشارة اللاصقة في وجود تدرج جاذب كيميائي قابل للذوبان. في النهاية ، يتم استخدام الفحص المجهري للخلايا الحية لإظهار هجرة الخلايا استجابة لكل من الإشارات اللاصقة والقابلة للذوبان. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل مقايسة الغرفة الشفافة أو الفراغ والإعداد التقليدي للموائع الدقيقة هي أن النظام المفكك لجهاز الموائع الدقيقة ذو النمط السطحي يسمح بمراقبة استجابات الخلايا للإشارات اللاصقة التي يتم التحكم فيها مكانيا والتدرج اللاصق والتدرج القابل للذوبان في نفس الوقت.

حسنا ، يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال هجرة الخلايا ، مثل أهمية التصاق الخلايا وتسبب السكتة الدماغية بين مستقبلات تكساس الكيميائي مثل المستقبلات المقترنة ببروتين كيناز G ومستقبلات الالتصاق مثل RIN لأكل زلات الغطاء الزجاجي. أولا ، قم بتنظيف زلات الغطاء عن طريق غمرها في رف بنسبة 100٪ من الإيثانول ووضع الرف في حمام مائي للتزلج على الجليد لمدة 30 دقيقة. جفف الغطاء الزجاجي ينزلق في الهواء.

بعد ذلك صوتنة ينزلق الغطاء الزجاجي لمدة 30 دقيقة في هيدروكسيد الصوديوم المولي واحد. بعد ذلك ، اشطف الأسطح الزجاجية عن طريق قلب الرف بعناية في دورق مملوء بسعة لتر ونصف من ماء مكعب الملي. كرر عملية الشطف ثلاث مرات باستخدام ماء مكعب ملي طازج في كل مرة.

بعد الشطف الثالث ، يجف ، ينزلق الغطاء الزجاجي في فرن على حرارة 60 درجة مئوية لمدة نصف ساعة تقريبا. ضع نصف زلزات الزجاج النظيف بشكل فردي في غرفة رطبة مصنوعة من صفيحة 24 بئرا مملوءة جزئيا بالماء. تمتلئ الآبار بالماء وتوضع زلات الغطاء الزجاجي فوق الآبار من أجل الآبار ، ويتم استخدام بوليمر مشترك من البولي ليسين والبولي إيثيلين جلايكول حيث يتم تطعيم 20٪ من جزيئات الوتد بالبيوتين.

يتم اختصاره باسم PLL Peg biotin ، ويسقط 15 ميكرولترا من البيوتين PLL Peg في PBS على كل زلة غطاء زجاجي. خذ النصف الآخر من زلات الغطاء الزجاجي النظيف المتبقية وقم بشطيرة محلول PEG بعناية. اترك الغطاء ينزلق لمدة ساعة في الغرفة الرطبة.

بعد انزلاق لمدة ساعة ، ينزلق الغطاء المحصور برفق بعيدا عن بعضه البعض دون كشط السطح المطلي ب PEG وشطفه بماء UE. يجب أن ينزلق الماء بسهولة على الجانب المعالج بالوتد. إذا لزم الأمر.

جفف الغطاء الزجاجي في الهواء على منشفة ورقية بحيث يكون السطح المعالج متجها لأعلى متجه. ينزلق الغطاء الزجاجي في فراغ يجف حتى الاستخدام الآخر. يتم تصنيع سيد السيليكون المطلوب لهذا الإجراء عن طريق الطباعة الحجرية الضوئية لصب ختم A-P-D-M-S لمطاط PDMS على السيليكون ماستر داخل طبق بتري إلى حوالي سنتيمتر واحد في الارتفاع ومعالجة خليط الماستر و PDMS في فرن عند 70 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.

بعد ذلك ، تتم إزالة ختم PDMS من سيد السيليكون وتقطيعه إلى الحجم لطباعة أنماط البروتين باستخدام تقنية طباعة التلامس الدقيق أولا ولجعل طوابع PDMS أكثر محبة للماء عن طريق معالجة جانب النمط في منظف الأشعة فوق البنفسجية والأوزون لمدة ساعة ونصف مباشرة بعد مكان معالجة الأوزون. وانشر 10 ميكرولترات من الدين المجرد على طوابع PDMS. إذا كان يجب أن تكون المسارات مرئية تحت المجهر الفلوري ، فاستخدم عدن المجردة المترافقة مع الفلورو أربعة ، مثل تجريد Avid و LOR three 50.

اتركيه لمدة ساعة في غرفة رطبة. قم بإزالة البكتيريا العقدية الزائدة من الختم بالمناديل والورق والهواء. جفف الختم لمدة دقيقة واحدة تقريبا.

اضغط برفق على الختم على زلة الغطاء الزجاجي المطلي بالبيوتين PLL peg. إذا تم استخدام البكتيريا العقدية الفلورية ، فقم بفحص النمط تحت مجهر مضان epi. يمكن أيضا طباعة أنماط البروتين باستخدام الطباعة الحجرية بقلم الغمس.

قم أولا بخلط جزء واحد من مليغرام واحد لكل مليلتر ، أو تجريد أو تجريد من avidan elif Fluor three 50 مع 10 أجزاء من الجلسرين وقم بتحميل خمسة ميكرولترات من الخليط على الكابولي. ضبط سرعة الطباعة. وقت ملامسة الكابول على السطح أو المسافة الرأسية للناتئ إلى السطح لتقليل حجم البقعة.

يبدأ ما يقرب من خمسة ميكرومترات عملية الطباعة كما هو موضح في دليل التشغيل لمتجر أدوات الطباعة الحجرية بقلم الغمس. جميع الأسطح المطبوعة في المجفف. يتم استخدام جهاز الموائع الدقيقة المتاح تجاريا لإنشاء تدرجات سطحية.

قم بلصق هذا الغطاء الزجاجي المطلي بالتريتين أو المنقوش على الجانب اللاصق من الجهاز لضمان عدم وجود تسرب لعدة ساعات. أغلق حواف الجهاز بطبقة رقيقة من الفازلين الدافئ وبطبقة ثانية من خليط من جزء واحد من الفازلين إلى جزء واحد من شمع البارافين. املأ قناة الجهاز بستة ميكرولترات من PBS لإنشاء تدرجات متعارضة.

املأ الخزانين ، أحدهما ب 70 ميكرولترا من البيوتين ، وأربعة فلورسين والآخر ب 70 ميكرولترا من البيوتين المقترن بحمض سبارتيك للببتيد الحيوي أو أرجينين جلايسين سبارتيك أو RGD ، احتضان العينات في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة ساعة واحدة. يعد شطف البيوتين و RGD والبيوتين المناسب لجهاز الموائع الدقيقة أصعب جانب في هذا الإجراء نظرا لوجود خطر احتجاز فقاعات الهواء وإزعاج المسارات المطبوعة ذات التلامس الدقيق. لضمان النجاح ، يجب إزالة البيوتين و PBS بعناية وببطء.

قم بإزالة محاليل البيوتين واشطف السطح بعناية مرتين باستخدام PBS بينما لا يزال متصلا بجهاز الموائع الدقيقة. حدد اتجاه التدرج اللاصق قبل تحميل الخلايا ذات العلامات الفلورية في جهاز الموائع الدقيقة. عد الخلايا وقسمها إلى أنبوبين بأرقام خلايا متساوية.

اغسل وإعادة التماس. قم بتعليق أنبوب واحد من الخلايا بوسائط تحتوي على جاذب كيميائي ، مثل DMEM منخفض الجلوكوز مع غسل FBS بنسبة 10٪ والأنبوب الآخر من الخلايا في الوسائط. بدون جاذب كيميائي مثل DMEM مع 0٪ FBS ، يجب أن يكون التركيز النهائي للخلايا في كل أنبوب خمسة أضعاف 10 من الخلايا الخامسة لكل مليلتر.

قم بإزالة جميع المحاليل من جهاز الموائع الدقيقة وضعها على المجهر الدافئ. تحميل المرحلة 70 ميكرولترا من الخلايا المعلقة في 0٪ F-B-S-D-M-E-M في خزان واحد. قم بتحميل 70 ميكرولترا من الخلايا المعلقة في 10٪ F-B-S-D-M-E-M في خزان آخر.

ضع شريطا فضفاضا فوق الخزانات لتجنب التبخر. تأكد من أن قناة جهاز الموائع الدقيقة في مجال الرؤية وأن الخلايا في بؤرة التركيز. حدد معلمات الحصول على الصور مثل أوقات التعريض الضوئي ومرشحات الفلورسنت.

تسلسل صور المجال الساطع والفلورة التي تبدأ الخلايا والمسارات بالإضافة إلى النقاط الزمنية وطول التسجيل برنامج الحصول على الصور. يوضح هذا الفيديو طريقة لتصوير الخلايا الحية للخلايا التي تهاجر في بيئة ذات تدرجات لاصقة وقابلة للذوبان متنافسة. تم إنشاء المسارات اللاصقة التي تحتوي على شريط الفلورسنت و RGD البيوتينيل باستخدام طباعة التلامس الجزئي أو الطباعة الحجرية للقلم الغمس.

يشار إلى طباعة التلامس الجزئي الناجحة من خلال ملف تعريف الخط لشدة التألق عبر المسارات حيث يمكن تمييز المسارات اللاصقة والمناطق المضادة للحشف بوضوح. تظهر النقاط المطبوعة باستخدام الطباعة الحجرية بقلم الغمس مستديرة وليست على شكل تمزق ، مما يشير إلى عملية طباعة ناجحة. في هذا المثال، تمت طباعة النقاط في سطر مع تعيين فصل الصفوف والأعمدة على 10 إلى 15 ميكرومتر.

هذه المسافة كافية لمنع النقاط من الاندماج مع بعضها البعض ، ولكنها تسمح بعرض نقاط متعددة في مجال رؤية واحد. مع معظم إعدادات المجهر ، تم إنشاء Grady من الإشارات اللاصقة على المسار المطبوع باستخدام جهاز الموائع الدقيقة البسيط. عن طريق تحميل البيوتين أربعة فلوريسين والبيوتين RGD في الجانبين المتقابلين للوحة غرفة الموائع الدقيقة.

عرض 60 صورة فسيفساء تم التقاطها بطول إجمالي للصورة 3072 ميكرومتر. في اللوحة B ، تم قياس شدة التألق عبر طول الفسيفساء بأكملها. تم تركيب خطوط الاتجاه الخطية على شدة التألق للإشارة إلى تدرج RGD في القناة.

بعد إزالة البيوتين ، محلول البيوتين RGD ، يمكن استخدام نفس الغرفة لإدخال تدرج قابل للذوبان. توضح اللوحة A شدة الفلورسنت لصبغة الفلورسين بالقرب من PBS والخزانات المملوءة بالفلورسين وعبر القناة عند T يساوي صفرا. توضح اللوحة B شدة الفلورسنت للإشارات القابلة للذوبان.

بعد حضانة لمدة 16 ساعة ، تشير النتائج المماثلة إلى أن التدرج كان مستقرا لمدة 16 ساعة على الأقل. لوحظ هجرة خلية في غرفة ميكروسويديك ذات تدرجات متعارضة باستخدام هذه الطريقة ويتم عرض فيلم تمثيلي هنا. تم تثبيت التدرج اللاصق RGD على مسارات البكتيريا العقدية أفيدان وكان التدرج القابل للذوبان من صفر إلى 10٪ FBS.

تم التقاط الصور كل 15 دقيقة لمدة 20 ساعة. انتقال الصورة المعروض هو ثمانية إطارات في الثانية. هذا الفيلم الثاني هو خلية طائرات هليكوبتر واحدة تهاجر نحو مصدر FBS.

انتقال الصورة المعروض هو ثمانية إطارات في الثانية. تم الحصول على الخط الأزرق الذي يمثل مسار الخلية عبر برنامج تتبع الخلايا. يوضح هذا الرسم الأخير مسارات الخلايا من الصور في الفيلم الأول.

تظهر مسارات الخلايا التي هاجرت نحو التركيز الأعلى من FPS القابلة للذوبان في مسارات الخلايا الحمراء التي هاجرت نحو تركيزات أعلى من RGD الملتصقة باللون الأسود. أظهرت هذه المسارات أن المزيد من خلايا هيلا هاجرت نحو مصدر الجاذب الكيميائي أكثر من تركيزات أعلى من RGD الملتصق. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تجنب تبخر PBS أو الوسائط في جهاز الموائع الدقيقة أثناء تحضير التدرج اللاصق وتصوير نمط الحياة ، استخدم شريطا لاصقا إذا لزم الأمر لتغطية جميع مداخل جهاز الموائع الدقيقة باتباع هذا الإجراء.

يمكن إجراء طرق أخرى مثل التعدي والفحص المجهري للمحلول الهجين من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل الميكانيكا الحيوية للهيكل الخلوي الذي يعمل بواسطة البروتين وبروتينات الالتصاق البؤري والمستقبلات أثناء هجرة الخلايا.