تسجيل النشاط الكهربائي من الخلايا العصبية التي تم تحديدها في الدماغ سليمة من الأسماك المعدلة وراثيا

الهدف العام من هذا الإجراء هو تسجيل الأنشطة الكهربائية من العصبونات في تحضيرة سليمة لدماغ سمكة. ويتم تحقيق ذلك من خلال تخدير سمكة meca معدلة وراثياً يتراوح عمرها بين أربعة إلى ستة أشهر في MS 2 22، ثم تشريح دماغها. بعد ذلك، يتم توصيل قطب تسجيل بأحد العصبونات المستهدفة والموسومة ببروتين GFP، ثم تُسجل أنشطتها الكهربائية باستخدام تقنية الفيزيولوجيا الكهربائية عبر تثبيت الرقعة الرخوة (loose patch) أو تثبيت الرقعة للخلية الكاملة (whole cell patch clamp).

في نهاية المطاف، يمكن أن تظهر النتائج تغيرات في تردد إطلاق جهود الفعل أو تغيرات في جهد الغشاء استجابةً لمعالجات مختلفة في الدماغ السليم. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنةً بالطرق الحالية، مثل الفيزيولوجيا الكهربائية للخلايا والمزارع الخلوية أو تحضيرات شرائح الدماغ، في قدرتنا على توصيف الخصائص الكهربائية للعصبونات في تحضيرة للدماغ الكامل مع دوائر عصبية سليمة. ورغم أن هذه القياسات توفر رؤية معمقة في علم الغدد الصماء العصبي التناسلي، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً على الأنظمة العصبية الأخرى باستخدام أسماك الزينة، مثل العصبونات التي تتحكم في الدافع والسلوكيات العاطفية.

يستخدم هذا العرض أسماك meca المعدلة وراثياً والتي تم وسم عصبونات GnRH three فيها وراثياً ببروتين GFP. للبدء، يتم تخدير سمكة maka بالغة عن طريق غمرها في 5 mL من MS 2 22. وبعد بضع دقائق من توقف حركات الخياشيم، يتم نقلها إلى طبق بتري بقطر 60 mm يحتوي على محلول ملحي للأسماك. الآن، استخدم المقص لفصل رأس السمكة عند الطرف الذيلى للـ alum.

انقل الرأس إلى طبق بتري بقطر 35 مليمتر، مملوء إلى النصف بمحلول ملحي للأسماك، ومبطن بـ yl guard. يتطلب الطبق وجود تجويف مركزي لوضع الرأس فيه وتثبيته بحيث يكون الجانب الظهري للأعلى باستخدام دبابيس الحشرات ومقصات دقيقة. اقطع الجزء الظهري من الجمجمة بعناية على طول محيطها.

بعد ذلك، قم بإزالة الجمجمة برفق باستخدام الملقط لكشف الجزء الظهري من الدماغ، بما في ذلك الجزء الأمامي من النخاع الشوكي. والآن، ارفع النخاع الشوكي برفق باستخدام ملقط دقيق الرأس، ثم اقطع الأعصاب الضامة الثنائية باستخدام مقص دقيق الرأس. يتضمن ذلك قطع الأعصاب القحفية، والأعصاب الشوكية، والأعصاب البصرية من الجانب البطني، والأعصاب الشمية الأمامية.

ضع الدماغ الذي تم تشريحه بالكامل في طبق بتري جديد مملوء بمحلول ملحي سمكي طازج تحت المجهر. تحقق بعناية من أن الدماغ بالكامل والغدة النخامية سليمين ولم يتم قطعهما أو ثقبهما. تخلص من أي أدمغة تالفة وابدأ العملية مجدداً باستخدام إبرة.

ضع قطرة صغيرة من غراء سريع المفعول مثل cyanoacrylate في مركز غرفة التسجيل. وزع قطرة الغراء على مساحة سنتيمتر مربع واحد. ثم انقل الدماغ بسرعة إلى الغراء.

قم بتثبيته بحيث يكون الجانب البطني للأعلى. الآن، املأ غرفة التسجيل بحوالي 1 milliliter من محلول ملحي للأسماك لتغطية الدماغ. باستخدام ملقط دقيق الرأس، قم بإزالة السحايا بعناية من فوق سطح منطقة التسجيل في الدماغ باتجاه الأمام.

قم بتروية الدماغ باستمرار بمحلول ملحي للأسماك مهوى بمعدل لا يقل عن 200 µL في الدقيقة. قم بتصنيع بعض الأقطاب الكهربائية الزجاجية الدقيقة بمقاومة تتراوح من 6 إلى 10 MΩ، واملأها جزئياً حتى المنتصف تقريباً بمحلول تسجيل الرقعة السائبة (loose patch recording solution). وباستخدام مجهر فلوري رأسي مزود بكاميرا CCD مبردة، حدد موقع عصبونات الطرف العصبي gn RH 3 التي تعبر عن البروتين الفلوري الأخضر (GFP)، بدءاً باستخدام العدسة الشيئية 10x.

بعد ذلك، انتقل إلى العدسة الشيئية 40x وحدد موقع العصبونات عند السطح البطني للبصيلات الشمية أو بالقرب منه، وذلك في المنطقة الأمامية مباشرة من الرأس (cephalon). الآن، انتقل إلى شاشة الفيديو التي تعرض صوراً في الوقت الفعلي من المجهر. تحتوي المجموعة العصبونية على ثمانية إلى 10 عصبونات GnRH.

ضع القطب الدقيق في حمام غرفة التسجيل بحيث تكون طرف القطب فوق العصبون المستهدف. طبق ضغطاً موجباً طفيفاً ومستمراً لمنع انسداد القطب الدقيق. اقترب ببطء من العصبون المستهدف بطرف القطب، مع فحص ومراقبة مقاومة القطب باستخدام برنامج Axo graft.

عند استخدام اختبار الختم (seal test) في وضع تثبيت الجهد (voltage clamp mode)، تتغير مقاومة القطب الكهربائي قليلاً عندما يكون طرف القطب على سطح العصبون. قم بتحرير الضغط الإيجابي لتكوين ختم منخفض المقاومة، وإذا لزم الأمر، قم بتطبيق ضغط سلبي خفيف. وتتمثل الخطوة الأكثر أهمية لضمان تسجيل جيد في اختيار ذراع عصبية نظيفة، مما يساعدك في تكوين ختم مثالي بين الأقطاب الكهربائية والغشاء نفسه.

انتقل الآن إلى وضع تثبيت التيار (current clamp mode). افتح برنامج PowerLab (Chart)، وابدأ بتسجيل جهد الغشاء بشكل مستمر دون أي إدخال للتيار، وقم بضبط مقياس الجهد ومعدل التسجيل إذا لزم الأمر، ثم سجل النشاط الكهربائي الأساسي في محلول ملحي طبيعي للأسماك لمدة خمس دقائق تقريبًا قبل تطبيق أي معالجات. يجب إضافة الأدوية أو الهرمونات أو الببتيدات، وما إلى ذلك، عبر التروية الحمامية إلى تحضير الدماغ، بتدفق قدره 200 µL في الدقيقة.

بعد ذلك، استخدم محلول ملحي طبيعي للأسماك لفترة غسيل بعد تحديد خلية للفحص، وراقب مقاومة القطب الكهربائي في وضع تثبيت الجهد (voltage clamp). عندما يكون طرف القطب على سطح العصبون وتتغير مقاومة القطب بشكل طفيف، حرر الضغط الموجب وقم بتطبيق قدر ضئيل من الضغط السلبي لتكوين سدادة عالية المقاومة على العصبون.

قم بتطبيق شفط فموي خفيف. قم بتمزيق غشاء الخلية المرقع. ستنخفض المقاومة فوراً إلى حوالي 120 إلى 250 mega ohms عند تمزق الغشاء.

انتقل الآن إلى وضع تثبيت التيار (current clamp mode) وقم بتسجيل جهد الغشاء بشكل مستمر باستخدام المخطط البياني دون إدخال أي تيار. ومرة أخرى، اضبط مقياس الجهد ومعدل التسجيل حسب الحاجة. بعد إجراء تسجيل أساسي للنشاط الكهربائي في محلول ملحي طبيعي للأسماك لمدة خمس دقائق تقريبًا، قم بتطبيق المعالجات متبوعة بفترة غسيل. تم تسجيل الأنشطة الكهربائية التلقائية للعصب الطرفي moca وعصبونات GNRH three في وضع تثبيت التيار (current clamp mode).

يتراوح معدل الإطلاق النموذجي بين 0.5 إلى 6 هرتز. عادةً ما تُطلق الجهود الفعلائية بنمط توتري أو نابض مع فاصل زمني منتظم نسبياً بين النبضات، ويبلغ متوسط جهد الغشاء بين النبضات حوالي -48 ميلي فولت. كما ينجح هذا النهج التجريبي في التسجيل من عصبونات GNRH الموصومة بـ GFP والموجودة في الدماغ الأمامي للفئران المعدلة وراثياً البالغة.

تم تسجيل النشاط الكهربائي لعصبونات سمكة الزيبرا في الدماغ السليم المستأصل لسمكة زيبرا معدلة وراثياً، وذلك بطريقة مشابهة لتلك الموصوفة لـ DACA باستخدام تقنية الرقعة السائبة (loose patch). كما وفرت التقنيات ذاتها إمكانية التسجيل من الخلية الكاملة (whole cell recording) أيضاً.

على عكس عصبونات GnRH في العصب الطرفي ميكا، غالبًا ما يكون نمط إطلاق جهد الفعل التلقائي لعصبونات GnRH في منطقة ما قبل البصرية، والرأس البطني، والوطاء في سمك الزيبرا غير منتظم. بمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون ساعة واحدة من أجل تسجيل لمدة 15 دقيقة إذا تم أداؤها بشكل صحيح. حظاً موفقاً.