التجسيمي حقن ناقل للتلاعب الجيني الفيروسي شرطي في الحبل الشوكي ماوس

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحقيق التعبير الجيني المقيد مكانيا في الحبل الشوكي للفأر عن طريق حقن ناقل فيروسي في القرن الظهري القطني. تتمثل الخطوة الأولى في الإجراء في تحديد موقع الفقرة القطنية وفضحها. الخطوة الثانية هي إزالة الجزء الظهري من الفقرة للكشف عن الحبل الشوكي.

إجراء يسمى استئصال الصفيحة الفقرية. بعد ذلك ، يتم وضع ماصة زجاجية متصلة بمضخة حقنة صغيرة فوق القرن الظهري ويتم إنزالها في الحبل الشوكي. الخطوة الأخيرة هي حقن معلق المتجه ببطء.

بعد أسبوعين ، تم إثبات تعدي الخلايا العصبية للقرن الظهري من خلال التعبير عن بروتين الفلورسنت الأخضر ، مما يسمح بتتبع توزيع الفيروس. تساعد هذه الطريقة في توضيح وظيفة الخلايا العصبية في بعض المسار الحسي. نستخدمه في الدراسات التي تركز بشكل خاص على تطور الألم الالتهابي أو الاعتلال العصبي.

العرض المرئي أمرا بالغ الأهمية لتعلم كيفية وضع الماوس في الإطار التجسيمي. من الضروري لنجاح الإجراء أن يتم إصلاح العمود الفقري بشكل صحيح لأن استئصال الصفيحة الفقرية هو تقنية دقيقة. مارتن مول ، طالب دراسات عليا من مختبري ، سيوضح الإجراء.

سيساعده جون وانغ ، مساعد باحث ، قبل يوم أو يومين من الإجراء. ماصات زجاجية للحصول على قطر طرف يبلغ 40 ميكرومتر وشطبة الطرف بزاوية 20 درجة في يوم الجراحة. ابدأ الإجراء بتطهير المعدات الجراحية وإعداد الأدوات الجراحية المعقمة لإعداد الإطار التجسيمي.

قم بتركيب حاقن الحقنة الدقيقة على المعالج وقم بتوصيل الجهاز. قم بتوصيل إحدى الماصات الزجاجية بالمحقنة الدقيقة باستخدام تركيبة الضغط. الآن قم بإزالة المكبس من المحقنة الصغيرة.

املأ المحقنة بالزيت المعدني ، ثم أعد إدخال المكبس وادفعه حتى الطرف. تجنب بعناية تكوين أي فقاعات هواء. ثم أدخل المحقنة الصغيرة في الحامل الموجود على الحاقن.

بعد ذلك ، قم بإزالة الفيروس من الفريزر وقم بإعداد معلق جزيئات الفيروس قبل الاستخدام مباشرة عن طريق تخفيفه بمحلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات إلى تركيز الجسيمات المطلوب. ماصة خمسة ميكرولترات من تعليق الفيروس على قطعة صغيرة من البارام. ثم اخفض طرف الماصة الزجاجية في القطرة واسحب المكبس لملء المحقنة الدقيقة.

في النهاية. قم بإنشاء فقاعة هواء صغيرة عند طرف الماصة لمنعها من الانسداد. في هذه الخطوة ، قم بإعداد منطقة الجراحة عن طريق مسح المقعد في وسادة التدفئة بمطهر.

ثم تخدير الفأر عن طريق استنشاق الفلور. بعد ذلك ، ضع مادة التشحيم على كل عين لحمايتها من الجفاف أثناء العملية بعد ذلك ، احلق الفراء من أسفل الظهر إلى عنق الفأر. تطهير الجلد بمناديل متناوبة من مطهر موضعي ، مثل الكلورهيكسيدين أو بوفيدون اليود ، و 70٪ إيثانول.

ثم تسلل إلى موقع الشق مع 0.25٪ بوبيفاكائين مخفف من واحد إلى 10 مع محلول ملحي فسيولوجي. بعد ذلك شق الجلد في نهاية القفص الصدري ، من سنتيمترين إلى ثلاثة سنتيمترات على طول خط الوسط وفصل اللفافة التي تغطي العمود الفقري. حدد الفقرة L one ، التي تقع مدللة على الفقرة ، ممسكة بآخر زوج من الأضلاع وفضحها عن طريق إزالة عضلات العمود الفقري الصغيرة والأربطة المتصلة بسطحها الظهري.

ثم ارفع قليلا وأمسك الفقرة L واحدة بزوج من الإضافات والملقط. بعد ذلك ، استخدم ملقطا مخصصا لاستئصال الصفيحة الفقرية لإزالة الجزء الظهري من الفقرة ، بما في ذلك العملية الشائكة والصفيحة لكشف الحبل الشوكي. تجنب إتلاف الأم الجافية أو الحبل الشوكي أثناء هذا الإجراء.

ثم انقل الماوس إلى لوحة تسخين في الإطار التجسيمي وراقب درجة حرارة الماوس أثناء العملية اللاحقة. استخدم الآن مسامير الشق الخامس لتثبيت العمود الفقري حتى لا تتحرك الفقرة أثناء التنفس. بعد ذلك، قم بتقريب المحقنة الدقيقة بحيث يكون طرف الماصة فوق موقع استئصال الصفيحة الفقرية.

اخفض المكبس حتى ترى تعليق الفيروس يخرج من الماصة. قم بإزالة القطرة بشاش معقم. ثم ضع طرف الماصة في الجزء المنقاري الأكبر من الحبل الشوكي المكشوف.

الماصة في المنتصف فوق التلم المتوسط الخلفي وحرك الطرف 500 ميكرومتر بشكل جانبي. بعد ذلك ، قم بخفض الطرف إلى سطح الحبل وثقب الأم الجافية. بعد ذلك ، قم بخفض طرف الزجاج ، وقم بإدخال الماصة 300 ميكرومتر في الحبل الشوكي.

حقن ميكرولتر واحد من تعليق الفيروس بمعدل 200 نانولتر في الدقيقة. في نهاية الحقن، انتظر دقيقتين على الأقل قبل سحب الماصة ببطء. كرر إجراء الحقن في الجزء الأكثر من الحبل الشوكي المكشوف لتحقيق التوزيع الكامل للناقل الفيروسي في الجزء الفقري L أربعة.

موقعا الحقن المنقاري والتدليل على الجزء L الأربعة. لتجنب تلف الأنسجة في المنطقة المستهدفة بعد تحرير الحقن ، تغلق الفقرة L من الشق V وقم بإزالة الماوس من الإطار التجسيمي. بعد ذلك ، قم بخياطة اللفافة بخمسة أوه فيكريل.

توفر اللفافة المغلقة غطاء لموقع استئصال الصفيحة الفقرية. ثم أغلق الجلد بخيوط نايلون أو دبابيس جراحية. توفير تسكين ما بعد الجراحة لمدة 72 ساعة مع الحقن اليومية تحت الجلد من الكاربروفين بمعدل خمسة ملليغرام لكل كيلوغرام.

انقل الماوس إلى قفص استرداد مع فراش ناعم وغير خاص. ضع الماوس على الجانب للتنفس المريح. ثم راقب حتى يصبح في حالة تأهب تام.

سيارة إسعاف وتبدأ في الشرب. مراقبة التعافي بعد الجراحة عن طريق الفحص اليومي للأيام الثلاثة الأولى. ثم كل يومين أو ثلاثة أيام في الأسبوع حتى تكتمل التجربة.

بعد سبعة إلى 10 أيام من العملية عند اكتمال التئام الجروح. قم بإزالة خيوط الجلد أو الدبابيس. يوضح هذا الشكل التعبير عن بروتين مراسل الفلورسنت الأخضر المحسن أو EGFP في القرن الظهري الأيسر للحبل الشوكي L four.

بعد أسبوعين من الحقن التجسيمي للخلايا العصبية R-A-A-V-E-G-F-P كانت صبغة مناعية للنوى العصبية البروتين الموضح في رأس السهم الأحمر. أشر إلى الخلايا الدبقية المتناثرة المنقولة في العمود الظهري. أصيب ما يقرب من 80٪ من الخلايا العصبية في القرن الظهري الإنسي بالممارسة.

يمكن إكمال الإجراء في 30 إلى 40 دقيقة ، ويرجى تذكر الحفاظ على ظروف معقمة أثناء العملية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء الحقن الشبكي داخل الصنوبر في جرعة الحبل الشوكي للفأر. نحن نستخدم هذه التقنية للتلاعب بالجينات، ولكن يمكنك تكييفها لأغراض أخرى مثل استخدام الأدوية داخل العمود الفقري.