إسكات طويلة الأجل من Intersectin-1S في الرئتين الماوس عن طريق المتكررة تسليم سيرنا محددة عبر الليبوزومات الموجبة. تقييم تأثيرات ضربة قاضية بواسطة المجهر الإلكتروني

الهدف العام من التجربة التالية هو تقييم آثار التثبيط طويل الأمد للتعبير عن البروتين Intersectin-1 في رئة الفأر على بنيتها ووظيفتها. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تحضير معقدات ليبوزومية محددة من DNA مزدوج الخيوط لاستهداف الأوعية الدموية في رئة الفأر كخطوة ثانية. يتم إيصال معقدات الليبوزوم هذه عن طريق الحقن خلف المدار، وتتكرر هذه العملية كل 72 ساعة لمدة 24 يوماً متتالية لتحقيق تثبيط فعال للتعبير عن Intersectin-1.

بعد ذلك، يتم أخذ عينات من أنسجة الرئة للفئران المحقونة لإجراء تحليلات كيميائية حيوية ومسوحات بالمجهر الإلكتروني (EM) بهدف تقييم مستويات بروتين وmRNA لـ intersect in one وإجراء تحليلات مورفولوجية شاملة للرئتين. وتُظهر النتائج التي تم الحصول عليها عن طريق تحليل لطخات ويسترن (western blot) لنواتج تحلل الرئة باستخدام أجسام مضادة محددة لـ intersect in one وتحليلات Q-R-T-P-C-R حدوث تثبيط (knockdown) نوعي وفعال لـ intersect in one لمدة 24 يومًا متتالية. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالمنهجيات الحالية مثل rymers أو الفيروسات البطيئة (lentiviruses)، في أن إيصال الليبوزومات الأيونية إلى الرئة عملية قابلة للتكرار، وآمنة، وغير سامة، وفعالة للغاية في بطانة الرئة.

لقد خطرت لنا الفكرة الأولى لهذه الطريقة عندما قررنا تقييم آثار تقاطع N down في الجسم الحي (in vivo) وعندما لم تنجح الطرق الأخرى لإيصال SRNA. لتحضير الليبوزومات الموجبة، أضف 315 µL من محلول مخزون من بروميد ثنائي ميثيل ديويديسال الأمونيوم، أو DOAB، إلى دورق مستدير القاع، يليه 200 µL من محلول الكوليسترول المخزون و9.5 mL من الكلوروفورم مع الخلط عن طريق التدوير. قم بتوصيل الدورق بجهاز المبخر الدوار المضبوط على 37 °C و100 دورة في الدقيقة أو أكثر.

افتح الصمام الأول الخاص بغاز الأرجون بالكامل عن طريق تدويره في اتجاه عقارب الساعة. افتح وأغلق هذا الصمام دائماً أولاً. يتحكم الصمام الثاني في ضغط غاز الأرجون المتدفق إلى الدورق.

افتحه جزئياً لضمان ضغط خفيف. وبمجرد أن يبدأ الثلج الجاف في التساقط فوق الأنبوب الذي يربط خزان غاز Argonne بجهاز المبخر الدوار (roto vapor)، اخفض المبخر الدوار في حمام مائي حتى يلامس الدورق الماء دون أن ينغمر بالكامل. أدر قرص السرعة لرفعها إلى 100 إلى 120 RPM. وعندما يتبخر كل الكلوروفورم الموجود في الدورق، أوقف تشغيل الجهاز.

أدر قرص سرعة المبخر الدوار إلى الصفر وأغلق صمامات خزان الأرجون. انزع القارورة. أضف 2 mL من محلول glucose بتركيز 5% إلى القارورة لإعادة تعليق الدهون.

باستخدام رأس ماصة سعة 1 مل، قم بحك قاع الدورق جيداً لإذابة جميع الدهون. حضن المحلول الناتج في حمام مائي عند درجة حرارة 42 °C لمدة ساعة واحدة مع رج الدورق ببطء باستخدام جهاز الرج الميكانيكي (vortex). قم بإجراء عملية السونيكة للمحلول لمدة لا تقل عن 20 إلى 30 دقيقة مع إمساك الدورق بحيث يلامس قاعه بالكاد الماء البارد في جهاز السونيكة.

بعد ذلك، يتم تسخين الدورق في حمام الماء الخاص بجهاز المبخر الدوار لمدة 20 دقيقة عند 42 °C وبسرعة صفر مع غمر القاع المستدير في الماء. يتم ترشيح الليبوزومات عبر مرشح حقنة بمقاس 0.47 micron، يليه مرشح حقنة بمقاس 0.22 micron. وباستخدام باثق صغير، يتم ترشيح الليبوزومات عبر غشاء بمقاس 50 nanometer لتوليد مجموعة متجانسة من حويصلات الليبوزوم أحادية الطبقة.

انقل الليبوزومات إلى أنبوب إبندورف وضعه على الثلج. قم بتحضير معقدات الليبوزومات و RNA ITSN بنسبة ثماني مولات من الليبوزومات إلى 2 µg من RNA. في هذا المثال، يتم استخدام 50 µL من I-A-I-T-S-N.

يُضاف من محلول مخزون بتركيز 50 µM إلى 100 µL من الليبوزومات المُحضرة حديثاً باستخدام أنبوب EOR خالٍ من A-R-N-A-D-N-A. يُحفظ الخليط على الثلج حتى يتم حقنه في الفئران. تبلغ أعمار الفئران المستخدمة في هذه الدراسة حوالي أربعة إلى ستة أسابيع، وتزن حوالي 25 g.

تأكد من خلال قرص إصبع القدم أن الحيوان تحت التخدير الكامل قبل الحقن. المحاقن المستخدمة هي محاقن توبيركولين بسعة واحد ملليلتر مع الإبرة متصلة بها بإحدى اليدين. أمسك أذني الفأر وأدر الفأر على جانبه لكشف الزاوية الداخلية للعين.

وجه الحقن إنسياً بالنسبة للأهلة شبه الدائرية لـ PIKA وتجنب لمس مقلة العين. اقترب من القناة الدمعية للعين باستخدام المحقنة المملوءة بزاوية 45 درجة في جميع المحاور الثلاثة. احقن الخليط ببطء، ثم أعد الفأر إلى قفصه واتركه ليتعافى من جانب الحقن.

يتم علاج الفأر باستخدام SIR NA الذي يستهدف جين ITSN one كل 72 ساعة لمدة 24 يوماً. لبدء هذا الإجراء، تحقق من تخدير الفأر بشكل كامل من خلال غياب منعكس السحب. ابدأ بإجراء عملية فتح بطن واستئصال الحجاب الحاجز.

ثم قم بإجراء عملية بضع الصدر لكشف الرئتين والقلب. قم بإزالة الغدة الزعترية باستخدام مجهر StereoZoom لتحقيق دقة أفضل. قم بقسطرة الشريان الرئوي.

بعد ذلك، قم بإجراء عملية بضع الرغامي وإدخال أنبوب تنفس للفأر عبر فتحة الرغامي. اضبط جهاز التنفس الاصطناعي على معدل 150 ضربة في الدقيقة وحجم ضربة يبلغ 150 µL. وكـمنفذ، افتح الأذين الأيسر باستخدام مضخة تمعجية مضبوطة على 1.5 mL في الدقيقة وبمحلول Hank's مُدفأ إلى 37 °C.

قم بإجراء تروية للأوعية الدموية في رئة الفأر الخالية من الدم لمدة خمس دقائق، يلي ذلك التروية باستخدام المادة التتبع لمدة 10 دقائق. بعد غسل المادة التتبع غير المرتبطة، قم بإجراء تثبيت في الموقع للرئتين عن طريق التروية لمدة 10 دقائق باستخدام 4%formaldehyde و2.5%gluar aldehyde و1%tannic acid. اجمع الرئتين وأزل الأنسجة الزائدة.

قطع الرئتين إلى قطع صغيرة وانقلها إلى قارورة وميضية مصنفة تحتوي على 2 mL من خليط التثبيت. لبدء معالجة أنسجة الرئة للفحص بالمجهر الإلكتروني، اغسل قطع الرئة أولاً في محلول منظم من صوديوم خلات بتركيز 0.1 molar لفترة وجيزة ثلاث مرات.

بعد ذلك، يتم تثبيت العينات في 4%aldehyde 2.5%glutaraldehyde في 0.1 Pipee buffer لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة، ثم يتم التثبيت اللاحق باستخدام 1%Pilate Osmium لمدة ساعة واحدة داخل غطاء السحب على الثلج في الظلام بعد الشطف مرة واحدة بـ Callen burger buffer. تُحضن العينات في Callen burger buffer لمدة تتراوح من ساعتين إلى طوال الليل في درجة حرارة الغرفة. تُشطف العينات مرة واحدة في 50%ethanol ثم تُجفف باستخدام سلسلة متدرجة من ethanol.

إيثانول 70% لمدة خمس دقائق، ثم إيثانول 95% لمدة خمس دقائق، وبعد ذلك مرتين في إيثانول 100% لمدة 15 دقيقة في كل مرة. بعد ذلك، يتم الانتقال إلى أكسيد البروبيلين 100% لمرتين من الحضن لمدة 15 دقيقة.

قم بإزالة أكسيد البروبيلين وأضف خليطاً يتكون من 50% من أكسيد البروبيلين و 50% من epon 812. يتم التحضين طوال الليل مع التدوير على عجلة في درجة حرارة الغرفة، وفي صباح اليوم التالي، يتم إزالة الخليط وإضافة epon 812 طازج، ثم يُترك لمدة أربع إلى خمس ساعات على الأقل على العجلة.

أضف العينات المختارة إلى قوالب مزدوجة مستدقة مملوءة إلى المنتصف بـ 100%Epon eight 12 طازج. ضع العينات عند الحواف، ثم انقل القوالب إلى حاضنة بدرجة حرارة 60 درجة Celsius واتركها لتتصلب لمدة تتراوح بين 48 إلى 72 ساعة. يؤدي التثبيط المزمن للتعبير عن ITSN one s لمدة 21 يوماً متتالية عن طريق التوصيل المتكرر لمركبات siRNA liposome الخاصة بـ I TSN one s إلى انخفاض مستويات بروتين I TSN one بشكل ملحوظ في رئتي الفئران، كما يظهر في هذه النتائج التمثيلية هنا؛ حيث تم إجراء تحليل لطخة (blotting) لمستخلصات الرئة من مجموعة ضابطة غير معالجة ومن فئران معالجة باستخدام أجسام مضادة ضد I TSN one وactin في نقاط زمنية متعددة بعد توصيل irna كما هو موضح.

يؤكد التحليل القياسي لعينات مختارة من أغشية اللطخة الغربية (blot CL films) والقياس الكمي لـ R-T-P-C-R لـ I TSN one s mRNA أن المعالجة بمركبات ليبوسوم siRNA الخاصة بـ I TSN one s تعمل على خفض تنظيم بروتين I TSN one s بفعالية في رئتي الفئران. ويؤدي انخفاض مستويات intersect in one إلى نقص في عملية الالتقام الخلوي واضطراب في النقل البطاني T للحاجز بين البطانات وحدوث وذمة رئوية. وتظهر هذه الصور المجهرية الإلكترونية التمثيلية لأنسجة الرئة وجود وصلات بين بطانية مفتوحة أو IJs محددة على طول امتدادها بواسطة جزيئات ذهب ألبومين بحجم 8 nanometer.

اللوحة A1 هي تكبير للوحة A، وتشير رؤوس السهام إلى ثلاث إلى أربع جزيئات ذهب-ألبومين تقع بالقرب من بعضها البعض في نفس المستوى، وهو ما يشير إلى الفتحة الواسعة لـ IEJ. ترتبط جزيئات الذهب أيضاً بالمخرج اللمعي لـ IJs كما تشير الأسهم في اللوحتين A1 و B. لاحظ أيضاً العدد المحدود من CVE A وتوسع الحيز حول الشعيري الذي تشير إليه النجمة في اللوحة a؛ حيث يؤدي التثبيط الحاد للتعبير عن intersect in one إلى زيادة تنظيم مسارات النقل البديلة لتعويض نقص عملية الالتقام الخلوي.

تظهر صور المجهر الإلكتروني (EM) هذه حلقات غشائية في اللوحتين A وA، وأنيبيبات متعددة الأشكال في اللوحة B، وإندوسومات متضخمة ملتحمة مع أجسام متعددة الفجوات (cve) نموذجية في اللوحة C، وهي تشارك بنشاط في امتصاص ونقل ألبومين الذهب. كما يُلاحظ وجود تمدد شديد في الحيز حول الوعائي ووذمة بروتينية. وقد أدى التثبيط المطول لبروتين intersect في تعبير واحد لمدة 24 يوماً إلى تقليل الوذمة الرئوية في الفئران عن طريق استعادة سلامة الحاجز بين البطانيات جزئياً.

أظهرت الدراسات المورفولوجية باستخدام المجهر الإلكتروني أن متتبع ألبومين الذهب بحجم ثمانية نانومتر لم يتمكن من اختراق الـ IEJ في هذه النقطة الزمنية، وبدلاً من ذلك شكل رواسب ترشيح في المدخل اللمعي للوصلة المشار إليها برأس السهم. ومع ذلك، أظهرت المساحات حول الأوعية أو PVS بعض التوسع ووذمة خفيفة، مما يشير إلى أن الوصلات غير نفاذة للجزيئات بهذا الحجم، ولكن لا تزال الأجسام متعددة الحويصلات أو MVB المسربة والموجودة على مقربة من الغشاء البلازمي تحتوي بعض حويصلاتها الداخلية الصغيرة على وسم بجزيئات ألبومين الذهب بحجم ثمانية نانومتر. يوضح هذا الجدول عدد الهياكل السيتوبلازمية الناقلة للالتقام الخلوي في الخلايا البطانية لرئة الفأر في المجموعتين الضابطة والناقصة.

تتمثل إحدى النتائج الهامة في انخفاض عدد الـ cavi في بطانة رئة الفئران التي تعاني من نقص في ITSN1. وقد أدى التثبيط المزمن للتعبير عن ITSN1 إلى تنشيط مسارات خلوية بديلة لالتقام الخلايا، وزيادة جزئية في عدد الـ cavi، وهي عبارة عن حلقات أو أنابيب غشائية تم وسمها بجزيئات ألبومين الذهب. كما زاد عدد الـ cavi في بطانة رئة الفئران التي تعاني من نقص مزمن في ITSN1 بمقدار 14 ضعفاً مقارنة بالمجموعات الضابطة.

بعد اتباع هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل مقايسة Eliza على نواتج تحلل الرئة للفأر من أجل التقدير الكمي للنقل عبر البطانة الغشائية لمقتفيات hnic المختلفة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية توصيل معقدات onic liposome و SRNA بشكل محدد إلى بطانة رئة الفأر من أجل تثبيط البروتين المستهدف وتقييم وظيفته.