مواصفات من الخلايا العصبية الجلوتاميرجي الدماغ الانتهائي من خلايا الجذعية المحفزة

الهدف العام من هذا الإجراء هو توليد الخلايا العصبية الرأسية من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية أو H ESCs من خلال المرور عبر نقاط التفتيش التي تشبه تلك التي لوحظت أثناء التطور البشري. يتم تحقيق ذلك من خلال السماح أولا ل HSCs بالتمايز تلقائيا في التعليق في وسط HESC ، ثم نقلها إلى وسط الحث العصبي للتمايز بشكل أكثر انتقائية. بعد ذلك ، يسمح لأجسام الأجنة أو مجاميع PSC بالالتصاق بالصفائح المعالجة بزراعة الأنسجة حيث تتوسع الخلايا وتتمايز إلى طبقة أحادية.

مع المراكز التي تشكل خلايا ظهارية عصبية تشبه شكليا خلايا الكيلومتر. بعد ذلك ، يتم عزل الخلايا الظهارية العصبية ووضعها في مزارع معلقة حيث تشكل المجالات العصبية. أخيرا ، يتم طلاء المجالات العصبية على زلات الغطاء حيث يمكنها التمايز بشكل أكبر.

في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج توضح أنواعا معينة من الخلايا العصبية التي تشكلت من خلال التلوين المناعي أو الفيزيولوجيا الكهربية. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو مجموعة متنوعة من الأمراض الموروثة وراثيا لأنه يمكن أيضا إنشاء خلايا عصبية خاصة بالمريض من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات حيث يمكن توضيح آلية العمل وكذلك العلاجات المحتملة. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لتطور الأنواع الفرعية العصبية الرأسية من الخلايا الجذعية متعددة القدرات.

يمكن تطبيقه أيضا على أنظمة أخرى مثل الأمراض البشرية المتعلقة بالخلايا العصبية الرأسية في الحلون لتوليد مجاميع الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات ، ابدأ بزراعة الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات على مغذيات الخلايا الليفية الجنينية للفأر في وسط HESC المكمل ب FGF الأساسي لمدة خمسة إلى سبعة أيام ، ستكون المستعمرات كبيرة ، لكنها لا تزال غير متمايزة. عندما تصل المستعمرات إلى المرحلة الصحيحة في أنبوب سعة 50 مل. قم بإعداد محلول واحد ملليغرام لكل مليلتر من فتحات التفريغ في وسط D-M-E-M-F 12 وفقا لبروتوكول النص.

استنشق الوسط من الخلايا ثم اشطفها مرة واحدة باستخدام D-M-E-M-F 12. بعد إزالة الغسول ، أضف ملليلترا واحدا من الخلجان إلى كل بئر واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث إلى خمس دقائق. عند علامة الثلاث دقائق ، تحقق تحت المجهر بحثا عن حواف ملتفة تبدو أغمق قليلا.

إذا لزم الأمر ، احتضان الخلايا لفترة أطول. عندما تكون الخلايا جاهزة ، قم بإزالة محلول الداسي وغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام D-M-E-M-F 12 قبل استبدال الغسيل ب 1.5 مل من وسط HESC لفصل الخلايا وتفتيتها. ضع طرف ماصة زجاجية سعة 10 ملليلتر على الخلايا باتجاه الجدار الأيمن السفلي للبئر ، وبحركة صغيرة لأعلى ولأسفل ، تحرك عبر البئر إلى الجانب الآخر قبل العودة في الاتجاه المعاكس.

بمجرد تعليق جميع الخلايا ، ضعها في أنابيب سعة 15 مليلتر وقم بطردها عند 200 جم لمدة دقيقتين قبل إزالة الوسط من الحبيبات. باستخدام وسيط HESC ، انقل الخلايا إلى قارورة للزراعة. على سبيل المثال ، بالنسبة للخلايا من ستة آبار من HSCs ، استخدم قارورة T 75 واحدة مع 50 مل من HESC. متوسط.

احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 12 ساعة. بجانب إزالة أي بقايا خلية ، انقل الخلايا والوسط إلى أنبوب سعة 50 مليلتر واغسل الخلايا مرة واحدة قبل نقلها ب 50 مل من الوسط الطازج إلى قارورة جديدة. استمر في إطعام الخلايا بهذه الطريقة حتى اليوم الخامس.

في اليوم الخامس ، قم بتدوير الزنازين ونقلها إلى قارورة T 75 جديدة. مع 50 مل من وسط الحث العصبي أو NIM ، احتضنها لمدة يومين إلى ثلاثة أيام لتحل محل نصف NIM كل يوم بعد لوحة الحضانة ، تستخدم الخلايا إما laminin أو FBS لمساعدتها على الالتصاق بالألواح باللوحة. باستخدام FBS ، أضف 1.5 مل من الوسط مع الخلايا لكل منها.

قم بهز اللوحة برفق لنشر الركام والسماح للخلايا بالالتصاق طوال الليل. عند 37 درجة مئوية في اليوم التالي ، استبدل كل الوسط بملليلترين من NIM لكل بئر. بعد يوم أو يومين من الحضانة ، سينتشر كل ركام لتشكيل طبقة أحادية وفي غضون يومين ، ستظهر مراكز معظم هذه الخلايا شكليا مشابهة لخلايا الكولومر.

في حوالي أيام ، ستظهر خلايا كولومر من 14 إلى 17 أكثر إحكاما. في بعض الأحيان تشكل الخلايا حواف أو حلقات بداخلها تجويف مرئي. قبل عزل الخلايا ، افحصها بحثا عن وجود أي خلايا ظهارية خارج الاتحاد الأوروبي واستخدم طرف ماصة لكشطها.

لعزل الخلايا الظهارية العصبية الموجودة في وسط المستعمرات. استخدم ماصة صغيرة وماصة معقمة مفلترة سعة ملليلتر واحد للضغط على مركز المستعمرة حتى تنطلق من العمر. احرص على عدم ترك الجزء الخارجي من المستعمرة ينفصل أيضا.

انقل طبقتين من الخلايا المعزولة إلى أنبوب سعة 15 مليلتر وقم بالدوران عند 200 جم لمدة دقيقتين. بعد إزالة الوسط ، انقل الخلايا إلى قارورة T 25 غير مزرعة نسيجية تحتوي على 10 مل من NIM. مع إضافة B 27 تحتضن بين عشية وضحاها في اليوم التالي ، يجب أن يكون للخلايا مظهر يشبه الكرة.

في بعض الأحيان يتم أيضا عزل الخلايا المحيطية وعادة ما تلتصق بقاع القارورة. إذا حدث هذا ، انقل الخلايا الكروية إلى قارورة جديدة ، تاركا الخلايا المرفقة خلف المزرعة. المجالات العصبية والتعليق لمدة أسبوع واحد في NIMB 27 لتعزيز تحمل الخلايا وتكاثرها.

أضف دوري A MP وعامل النمو الشبيه بالأنسولين واحد. في نهاية الأسبوع ، ستحتوي المجالات العصبية على أسلاف رأسية وتكون جاهزة للطلاء على زلات الغطاء للتمايز النهائي. لتحضير زلات الغطاء المطلي بالبولي يوريثين في 24 ، تبدأ ألواح الآبار بطلاء زلات الغطاء النظيفة بمحلول 0.1 ملليغرام لكل مليلتر من البولي يوريثين عند 37 درجة مئوية طوال الليل لطلاء زلات الغطاء بطبقة من اللامينين عند 50 ميكرولتر من 20 ميكروغرام لكل مليلتر من اللامينين في التمايز العصبي.

متوسط لكل زلة غطاء معالجة بالبولي يوريثين. الحرص على أن يلمس السائل الغطاء نفسه فقط. احتضنها عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة إلى ساعتين.

بعد حضانة اللامينين ، اجمع واغسله المجالات العصبية في D-M-E-M-F 12. إذا كانت الخلايا كبيرة جدا بحيث لا يمكن ربطها بشكل صحيح ، أضف حوالي ملليلترين من Accutane واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق. بعد ذلك ، أضف حجما متساويا من مثبط التربسين وبعد التمركز للخلايا عند 200 جم لمدة ثلاث دقائق ، استبدل المحلول ب NDM واستخدم P 200 لتفتيت الخلايا للمجموعات الصغيرة.

ضعها على زلات غطاء مغلفة مسبقا ، واستنشق معظم الوسط وانقل الخلايا إلى طبق بتري بطول ستة سنتيمترات في بضع قطرات من الوسط بحيث يصبح اختيارها أسهل دون إزالة اللامينين من زلات الغطاء المطلية مسبقا. انقل حوالي أربعة إلى خمسة مجالات عصبية لكل منها. اسمح للمجالات العصبية بالالتصاق لمدة ساعتين إلى أربع ساعات على الأقل قبل إضافة 0.5 مل من وسط التمايز العصبي المكمل ب 27 دوري.

يحل MP والعوامل العصبية محل نصف الوسيط كل يومين. يمكن الحفاظ على الخلايا لعدة أشهر كما هو موضح هنا. يصف هذا البروتوكول كيفية التمييز بين الخلايا العصبية الجذعية العصبية البشرية إلى الخلايا العصبية الجلوتاماتية الرأسية من خلال عدة خطوات حاسمة.

يجمع تكوين PSC تحريض الخلايا الظهارية العصبية ، وتوليد أسلاف رأس المخالب ، والتمايز النهائي لهذه الأسلاف إلى الخلايا العصبية الرأسية في تالون. هذا النظام قوي وفعال في توليد الخلايا العصبية الرأسية والأسلاف والجلوتاماتيرجيك ، على سبيل المثال. بدون إضافة عوامل التشكيل ، تمايزت الخلايا الجذعية السرطانية إلى النسب العصبي وبعد 24 يوما من التمايز.

كانت غالبية السلائف العصبية إيجابية ل Fox G one ، وهو عامل نسخ يعبر عنه الرأس ، ولكنه سلبي ل HOKs B four ، وعلامة لخلايا الدماغ الخلفي والحبل الشوكي مما يشير إلى أن أسلاف telon cephalic قد تم إنشاؤها بنجاح. تمتلك أسلاف تيلون الرأسية نمطا ظاهريا ظهريا كما يتضح من التعبير عن PAC ستة. علامة يعبر عنها الأسلاف الظهرية ، ولكن ليس NK X 2.1 علامة للأسلاف البطنية.

بعد مزيد من التمايز ، تمايزت هذه الأسلاف الظهرية الرأسية إلى خلايا عصبية جلوتاماتيرجيك ، والتي كانت إيجابية لعلامة الجلوتاماتيرجيك. TBR ، كانت الخلايا العصبية الواحدة التي حافظت إيجابية ل TBR ، واحدة ، إيجابية أيضا للعلامات العصبية بيتا ثلاثة توبولين أو خريطة اثنين. عبرت هذه الخلايا أيضا عن ناقل الغلوتامات الحويصلي واحد أو V glut one ، وهي علامة للخلايا العصبية الغلوتاميتية الناضجة التي تشير إلى التوليد الفعال للخلايا العصبية الجلوتاماتية الرأسية في الثقافة.

بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل الفيزيولوجيا الكهربية من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل ما إذا كانت هذه الخلايا العصبية يمكنها إجراء اتصالات متشابكة مع الخلايا الأخرى. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد. كان عليها أن تفرق بين الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات وإلى الخلايا العصبية الجلوتاماتية الرأسية من خلال عدة خطوات حاسمة.

يجمع تكوين الخلايا الجذعية متعددة القدرات تحريض الخلايا الظهارية العصبية ، وتوليد الأسلاف الرأسية ، والتمايز النهائي لهذه الأسلاف إلى خلايا عصبية رأسية.