ميكروفلويديك تصنيع المعالج وطريقة للكشف عن الأنفلونزا

الهدف العام من التجربة التالية هو الكشف عن فيروس الأنفلونزا A باستخدام شريحة الموائع الدقيقة. أولا ، قم بتشغيل العينة باستخدام المخزن المؤقت للتحلل من خلال قناة SPE لتحميل الفيروس واستخراج الحمض النووي الريبي كاشف R-T-P-C-R مع الحمض النووي الريبي المستخرج وتشغيل قناة النسخ العكسي لتحويل الحمض النووي الريبي الفيروسي إلى CDNA. بعد ذلك ، قم بتشغيل الخليط في قناة PCR من أجل تضخيم نتائج الحمض النووي التي تظهر حجم وتركيز الأمبليكون بناء على إشارة التألق من الرحلان الكهربائي الشعري.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تقبل عينة المريض الخام وتدمج استخراج الحمض النووي وتنقية ونسخ عكسي وتضخيم في شريحة واحدة لإنشاء لويحتين ، قم بتوزيع ما يقرب من تسعة جرامات من كريات XN X بالتساوي في وسط صفيحة معدنية ، وضعها على مكبس ساخن 198 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. ثم اضغط ببطء على 2،500 رطل لكل بوصة مربعة لمدة خمس دقائق أخرى. الآن ، ضع لوحة واحدة على قالب الايبوكسي على درجة حرارة 157 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، واضغط ببطء على 1000 رطل لكل بوصة مربعة لمدة 10 دقائق أخرى.

بعد ذلك ، قم بارتداء القفازات الحرارية ، وقم بإزالة البلاك والعفن من المكبس الساخن ، ثم قم بإزالة البلاك من القالب قبل أن يبرد. قم بحفر ثلاثة ثقوب في الرقاقة المنقوشة ، واحدة عند كل من المدخل ومنفذ النفايات ومخرج قناة الموائع الدقيقة. ثم اغسل الرقائق باستخدام IPA متبوعا بالحمض النووي الريبي بعيدا وماء ديانا.

جفف الرقائق بالهواء لربط الرقائق أولا على حرارة 131 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، ثم اضغط على 350 رطل لكل بوصة مربعة لمدة 10 دقائق أخرى. باستخدام JB Weld Epoxy ، قم بتوصيل منافذ النانو في نفايات المدخل ومعالجة منافذ المخرج بشكل منفصل لمدة 15 إلى 24 ساعة. وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، اشطف قناة SPE ب 50 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي متبوعا ب 100 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز.

الآن قم بتحميل قناة SPE بأربعة ميكرولترات من محلول التطعيم المحضر حديثا لربط حضانة الميثاكريلات لمدة 10 دقائق في فرن الأشعة فوق البنفسجية ، وإزالة محلول التطعيم المتبقي بفراغ. قم بتفتيت حبيبات الكرة المجهرية المجففة عن طريق النقر على الأنبوب مع إغلاق الغطاء. ثم أضف 100 ميكرولتر من محلول عمود SPE الطازج والدوامة للخلط.

قم بتحميل أربعة ميكرولترات من محلول SPE في نفس القناة المتقاطعة عن طريق الأشعة فوق البنفسجية لمدة 2.5 دقيقة على كل جانب ، مما ينتج عنه عمود SPE أبيض معتم معتم. اغسل القناة ب 500 ميكرولتر من الميثانول بنسبة 100٪ لشطف المواد المتفاعلة الزائدة والمذيبات الحرارية داخل البوليمر. قم بتوصيل سخانين من الأغشية الرقيقة في الجزء السفلي من الشريحة بشريط موصل حراريا.

لاحظ أن جوانب السخانات يجب أن تكون محاذاة مع حافة القنوات العريضة لمدة Dene والركوع بشكل منفصل ، ضع خمسة مزدوجات حرارية في الشريحة من خلال القنوات الجانبية المفتوحة المسدودة لكل شريط شريحة. لإصلاح موقع المزدوجات الحرارية ، أضف أربعة ميكرولترات من 25 XRNA آمنة إلى 96 ميكرولترا من 70٪ من الإيثانول في أنبوب واحد ، وإلى 100٪ إيثانول في أنبوب ثان. أيضا ، قم بإعداد 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت للقناة و 316 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل.

سخني المحاليل على حرارة 60 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. لتنشيط الحمض النووي الريبي الآمن ، ثم موازنة قناة الموائع الدقيقة. قم بتشغيل المخزن المؤقت للقناة عبر قناة SPE بمعدل تدفق يبلغ 0.8 ملليلتر في الساعة.

الآن عينة اختبار سريعة للمدمس في VTM عند 37 درجة مئوية. قم بإزالة العينة بمجرد إذابتها. الطرد المركزي العينة عند 13 ، 000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق.

انقل 100 ميكرولتر من المادة الطافية إلى 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل ، وأضف ستة ميكرولتر من ميكروغرام واحد لكل حامل ميكرولتر ، دوامة الحمض النووي الريبي للخلط. ثم تدور لمدة خمس ثوان وقم بتحميل المحللة بالكامل في قفل إغراء حقنة CC واحدة. قم بتشغيل المحللة عبر قناة SPE بمعدل تدفق 0.8 مل في الساعة.

ثم اغسل قناة SPE ب 100 ميكرولتر من 70٪ إيثانول ، متبوعا ب 100 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪ بمعدل مليلتر واحد في الساعة. ضع حقنة فارغة عند علامة 0.5 مليلتر وادفع الهواء عبر القناة لتجفيفها بمعدل واحد مليلتر في الساعة. الآن قم بتشغيل 67.5 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز عبر القناة لتصفية الأحماض النووية المرتبطة بمعدل 0.5 مل في الساعة وجمع 13.5 ميكرولتر من منفذ النانو في منفذ النفايات.

قم بتحميل 36.5 ميكرولتر من R-T-P-C-R master. امزج منفذ النانو في منفذ النفايات واخلطه مع قالب الحمض النووي الريبي للحصول على تفاعل 50 ميكرولتر R-T-P-C-R. ثم قم بتحميل خليط R-T-P-C-R في قناة RT بواسطة فراغ لطيف.

أغلق منفذ النانو بتركيب مغلق. ضع 35 فولت على سخان واحد. احتفظ بالكواشف في قناة RT لمدة 30 دقيقة بعد أن يوازن السخان عند 50 درجة مئوية.

احتفظ بالكواشف في قناة RT لمدة 15 دقيقة بعد أن يتوازن السخان عند 95 درجة مئوية. بعد ذلك ، قم بتطبيق 27 فولت على السخان واحد و 50 فولت على السخان ، واثنان لموازنة السخان ، وواحد عند 60 درجة مئوية وسخان اثنين عند 95 درجة مئوية. ادفع الكواشف إلى قناة PCR بسرعة 0.5 ميكرولتر في الدقيقة.

بعد حوالي 20 دقيقة عندما اقتربت الكواشف من نهاية قناة السربنتين ، اجمع منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل من المخرج باستخدام ماصة ذات حجم مناسب وطرف لاختبار الحمض النووي عالي الحساسية من Agilent. قم بإزالة مجموعة الحمض النووي عالية الحساسية من Agilent من الثلاجة قبل 30 دقيقة من الاختبار. قم بتشغيل المحلل الحيوي وافتح برنامج 2 ، 100 خبير.

قم بتحميل ميكرولتر واحد من منتجات PCR للاختبار واتبع بروتوكول Agilent. تحليل البيانات وتسجيلها في سير العمل هذا. يتم خلط عينة البلعوم الأنفي للمريض مع عازلة التحلل وتطبيقها على الشريحة.

يتم تشغيل الشريحة وتكون منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل لفيروس الأنفلونزا حمراء باستخدام شريحة الرحلان الكهربائي الشعري التجارية. نظرا لاختلاف كميات فيروس الأنفلونزا في عينة كل مريض ، سيختلف التركيز النهائي لمنتج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). يجب أن تحتوي النتيجة الجيدة على ضوضاء منخفضة لمسح قمم السلم عند 35 و 10 ، 380 زوجا أساسيا وذروة منتج واحدة بحجم المنتج المصمم البالغ 107 زوجا أساسيا للعينة الموجبة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصنيع وتشغيل شريحة السوائل الدقيقة للكشف عن فيروس الأنفلونزا A.