ميكروفلويديك تصنيع المعالج وطريقة للكشف عن الأنفلونزا

الهدف العام من التجربة التالية هو الكشف عن فيروس الإنفلونزا A باستخدام شريحة مائعية دقيقة. أولاً، يتم تمرير العينة مع محلول التحلل عبر قناة SPE لتحليل الفيروس واستخلاص الـ RNA، ثم يُحمّل كاشف R-T-P-C-R بالـ RNA المستخلص ويتم تشغيل قناة النسخ العكسي لتحويل الـ RNA الفيروسي إلى CDNA. بعد ذلك، يتم تمرير المزيج إلى قناة PCR لتضخيم الـ DNA، وتُستخلص النتائج التي توضح حجم وتركيز المنتج المضخم بناءً على إشارة الفلورة الناتجة عن الفصل الكهربائي الشعيري.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أنها تقبل عينة المريض الخام، وتدمج عمليات استخلاص الحمض النووي، وتنقيتها، والنسخ العكسي، والتضخيم في شريحة واحدة. ولإنشاء لوحين، يتم توزيع حوالي تسعة جرامات من حبيبات XN X بالتساوي في مركز صفيحة معدنية، ثم توضع في مكبس ساخن عند 198 درجة Celsius لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، يتم تطبيق ضغط ببطء ليصل إلى 2,500 PSI لمدة خمس دقائق أخرى. والآن، يتم وضع لوح واحد على قالب إيبوكسي تم تسخينه مسبقاً عند 157 درجة Celsius لمدة 10 دقائق، مع تطبيق ضغط ببطء ليصل إلى 1000 PSI لمدة 10 دقائق أخرى.

بعد ذلك، وباستخدام قفازات حرارية، أخرج اللوحة والقالب من المكبس الساخن، ثم افصل اللوحة عن القالب قبل أن تبرد. قم بثقب ثلاث فتحات في الشريحة البارزة، فتحة واحدة عند كل من المدخل، ومنفذ التصريف، ومخرج القناة الموائعية الدقيقة. ثم اغسل الشرائح باستخدام IPA متبوعاً بـ RNAs away ومياه dianna's.

جفف الرقاقات بالهواء، ولربط الرقاقات قم بالتسخين المسبق أولاً عند 131 degrees Celsius لمدة 10 دقائق، ثم اضغط عند 350 PSI لمدة 10 دقائق أخرى. باستخدام JB Weld Epoxy، قم بتثبيت المنافذ النانوية عند منافذ دخول النفايات ومنافذ الخروج بشكل منفصل، واتركها لتتصلب لمدة تتراوح من 15 إلى 24 ساعة. وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة، اشطف قناة SPE بـ 50 µL من RNAs away متبوعة بـ 100 µL من الماء الخالي من النوكلياز.

قم الآن بتعبئة قناة SPE بـ 4 µL من محلول التطعيم المُحضّر حديثاً لربط الميثاكريلات تشابكياً، ثم حضنها لمدة 10 دقائق في فرن UV، وأزل محلول التطعيم المتبقي باستخدام المفرغة. قم بتفكيك كتلة الكرات الدقيقة المجففة عن طريق النقر على الأنبوب وغطاؤه مغلق. بعد ذلك، أضف 100 µL من محلول عمود SPE المُحضّر حديثاً واستخدم جهاز vortex للمزج.

قم بتحميل 4 µL من محلول SPE في نفس القناة، ثم أجْرِ الربط التشابكي عن طريق التشعيع بالأشعة فوق البنفسجية لمدة 2.5 دقيقة على كل جانب، مما يؤدي إلى تكوين عمود SPE مبلمر أبيض معتم. اغسل القناة بـ 500 µL من الميثانول بتركيز 100% لشطف المتفاعلات الزائدة والمذيبات المسببة للحمى داخل البوليمر. قم بتثبيت سخانين ذوي غشاء رقيق في الجزء السفلي من الشريحة باستخدام شريط موصل حرارياً.

لاحظ أنه يجب محاذاة جوانب السخانات مع حافة القنوات الواسعة لضمان المدة، وبشكل منفصل، ضع خمسة مزدوجات حرارية في الشريحة من خلال القنوات الجانبية المفتوحة والمسدودة لكل شريط شريحة. لتثبيت موقع المزدوجات الحرارية، أضف 4 µL من 25 XRNA secure إلى 96 µL من ethanol بتركيز 70% في أنبوب واحد، وإلى ethanol بتركيز 100% في أنبوب ثانٍ. قم أيضًا بتحضير 300 µL من channel buffer و 316 µL من lysis buffer.

سخن المحاليل عند 60 °C لمدة 15 دقيقة، وذلك لتنشيط الـ RNA secure، ثم لموازنة القناة الموائعية الدقيقة. مرر منظم القناة عبر قناة SPE بمعدل تدفق 0.8 ml/h.

الآن، يتم وضع عينة اختبار fava السريعة في وسط نقل الفيروسات (VTM) عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. تُخرج العينة فور ذوبانها. يتم طرد العينة مركزياً بسرعة 13,000 RPM لمدة 10 دقائق.

انقل 100 µL من السائل الطافي إلى 300 µL من محلول التحلل (lysis buffer)، وأضف 6 µL من حامل RNA بتركيز 1 µg/µL، ثم استخدم جهاز المزيج الدوامي (vortex) للمزج. بعد ذلك، قم بالطرد المركزي لمدة خمس ثوانٍ، ثم حمّل كامل المُحلل (lysate) في حقنة Luer-lock سعة 1 CC. مرر المُحلل عبر قناة SPE بمعدل تدفق قدره 0.8 mL/h.

بعد ذلك، اغسل قناة SPE بـ 100 µL من الإيثانول بتركيز 70%، يليه 100 µL من الإيثانول بتركيز 100% بمعدل تدفق 1 mL/h. ضع حقنة فارغة عند علامة 0.5 mL وادفع الهواء عبر القناة لتجفيفها بمعدل 1 mL/h. الآن، قم بتمرير 67.5 µL من الماء الخالي من النوكلياز عبر القناة لاستخلاص الأحماض النووية المرتبطة بمعدل 0.5 mL/h، واجمع 13.5 µL من المنفذ النانوي عند منفذ النفايات.

قم بتحميل 36.5 µL من المزيج الرئيسي لـ R-T-P-C-R. اخلط المزيج في منفذ النانو عند منفذ النفايات مع RNA القالب للحصول على تفاعل R-T-P-C-R بحجم 50 µL. ثم قم بتحميل مزيج R-T-P-C-R في قناة RT عن طريق تفريغ هوائي لطيف.

أغلق المنفذ النانوي (nano port) باستخدام وصلة إغلاق. قم بتطبيق 35 فولت على السخان الأول. احتفظ بالكواشف في قناة RT لمدة 30 دقيقة بعد وصول السخان الأول إلى حالة التوازن عند 50 °C.

احتفظ بالكواشف في قناة RT لمدة 15 دقيقة بعد وصول السخان الأول إلى حالة التوازن عند 95 درجة مئوية. بعد ذلك، قم بتطبيق جهد كهربائي قدره 27 فولت على السخان الأول و50 فولت على السخان الثاني، وذلك لضبط السخان الأول عند 60 درجة مئوية والسخان الثاني عند 95 درجة مئوية. ادفع الكواشف إلى قناة PCR بمعدل 0.5 µL في الدقيقة.

بعد حوالي 20 دقيقة، وعندما تصل الكواشف إلى نهاية القناة المتعرجة، اجمع نواتج PCR عند المخرج باستخدام ماصة ورأس ماصة بحجم مناسب لاختبار Agilent high sensitivity DNA. أخرج مجموعة Agilent high sensitivity DNA من الثلاجة قبل 30 دقيقة من الاختبار. قم بتشغيل جهاز bioanalyzer وافتح برنامج 2, 100 expert.

قم بتحميل 1 µL من نواتج PCR الخاصة بالفحص واتبع بروتوكول Agilent. قم بتحليل البيانات وتسجيلها في سير العمل هذا. يتم خلط عينة البلعوم الأنفي للمريض مع محلول التحلل (lysis buffer) ثم وضعها على الشريحة.

يتم تشغيل الشريحة وقراءة نواتج PCR لفيروس الإنفلونزا باستخدام شريحة الفصل الكهربائي الشعري التجارية. ونظرًا لاختلاف كميات فيروس الإنفلونزا في عينة كل مريض، فإن التركيز النهائي لناتج PCR سوف يتفاوت. يجب أن تظهر النتيجة الجيدة ضجيجًا منخفضًا مع قمم سلم واضحة عند 35 و10، و380 زوج قاعدي، وقمة ناتج واحدة عند حجم الناتج المصمم وهو 107 زوج قاعدي للعينة الإيجابية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصنيع وتشغيل شريحة الموائع الدقيقة للكشف عن فيروس الإنفلونزا.