وهناك طريقة عالية الإنتاجية لقياس معدل الترشيح الكبيبي في الفئران وإدراكا

الهدف العام من هذا الإجراء هو إظهار المحققين الآخرين كيفية تحديد وظائف الكلى في الفئران المستيقظة. يتم تحقيق ذلك عن طريق غسيل الكلى أولا أو إيزوثيوسيانات الفلورسين أو الأنسولين FSE لمدة 24 ساعة وتحديد تركيزه للحقن. الخطوة الثانية هي وزن الماوس ، وإعداد كميات دقيقة من الأنسولين الفيتزي للحقن خلف البصيلة ، وتخدير الماوس.

بعد ذلك ، يتم إجراء حقن الأنسولين Retrobulbar Fitzy ويتم أخذ ثماني عينات دم على مدى 75 دقيقة. تتمثل الخطوة الأخيرة في قياس Fitz Nulin باستخدام مقياس طيف فلورو صغير الحجم وحساب وظائف الكلى من خلال استخدام نموذج اضمحلال أسي ثنائي الطور. في نهاية المطاف ، يسمح الجمع بين حساسية طريقة حقن البلعة المفردة Fiti Nulin وقدرة الحجم الصغير لمقياس الطيف الفلوري باكتشاف الاختلافات في وظائف الكلى الناتجة عن التعديلات الجينية في الفئران أو التغييرات الغذائية أو تطبيقات الأدوية.

تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل التسريب المستمر وظروف التخدير ، وزرع المضخات الصغيرة التناضحية باستخدام الأنسولين المشع في عدم الحاجة إلى جراحة. إنها ليست تجربة نهائية. لا يجب جمع البول ، ومن الممكن قياس ما يصل إلى 24 مترا في اليوم.

سأعرض هذا الإجراء مع ماريا أزيمو ، باحثة مشاركة في مختبري لتحضير محلول حقن فيتزي نولين. قم بوزن ما يكفي من الأنسولين ZI لمليلترين من محلول 5٪ ، قم بإذابة الأنسولين المسمى في محلول كلوريد الصوديوم بنسبة 0.85٪ عن طريق التسخين إلى 90 درجة مئوية حتى يذوب تماما. ضع قطعة من غشاء غسيل الكلى 20 سم في ماء مقطر مزدوج لمدة 30 دقيقة لإزالة حمض الصوديوم المتبقي من الغشاء ، وشطف الغشاء عدة مرات بعد ذلك ، واملأ غشاء غسيل الكلى بختم الأنسولين المذاب بشكل صحيح مع الإغلاق ، ثم قم بوزن الغشاء بالكامل.

اسمح للإينولين المذاب فيتزي بغسيل الكلى في لتر واحد من محلول كلوريد الصوديوم 0.85٪ وحركه ببطء محمي من الضوء لمدة 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة بعد غسيل الكلى ، وقم بوزن غشاء غسيل الكلى بالكامل مرة أخرى وحساب التركيز الجديد. سوف ينتقل الماء بشكل تناضحي إلى الغشاء وسيتحرك FSI غير المرتبط من الغشاء. وبالتالي ، سينخفض تركيز الأنسولين FSI بشكل كبير.

احسب ملاءمة جديدة e تركيز الأنسولين باستخدام هذه الصيغة حيث C هو التركيز الجديد. N هي كمية الأنسولين E الأولية ، و V هو الحجم الجديد ، وهو الفرق في وزن أنابيب غسيل الكلى قبل وبعد غسيل الكلى ، بالإضافة إلى حجم محلول الأنسولين الأولي. بعد ذلك ، قم بتعقيم المحلول المخلل عن طريق الترشيح من خلال مرشح حقنة 0.22 ميكرون.

تذكر دائما الحفاظ على فيتزي إينولين محميا من الضوء لتجنب التبييض الضوئي قبل التجربة. خذ وزن جسم الفئران بعد تخدير الفئران لفترة وجيزة باستخدام أربعة إلى 5٪ فلور ISO. تحقق من عمق التخدير عن طريق شفط انعكاس التوين ميكرولترين لكل جرام من وزن الجسم من نولين فيتزي المخلل باستخدام حقنة هاميلتون سعة 100 ميكرولتر بإبرة قياس نصف بوصة بطول 26 لإزالة فقاعات الهواء ، ثم قم بالتبديل إلى إبرة بطول نصف بوصة وقياس 30 للحقن.

المضي قدما في حقن الأنسولين فيتزي المخلل في الضفيرة خلف الحجاج. اسمح للفئران بالتعافي تلقائيا في قفص منزلها. كوب ملليمتر واحد من ذيل الفأر بالمقص مرة واحدة واجمع الدم في نقاط زمنية متعددة بعد الحقن في الشعيرات الدموية الصغيرة هيبارين الصوديوم.

ختم الشعيرات الدموية الصغيرة بعد جمع الدم بختم تشا والحفاظ على العينات محمية من الضوء. ضع الشعيرات الدموية الصغيرة محكمة الغلق داخل الشعيرات الدموية والطرد المركزي لمدة خمس دقائق بعد الطرد المركزي. قم بكسر الشعيرات الدموية الصغيرة باستخدام قاطع الماس ونقل البلازما بأكملها عن طريق سحب العينات إلى أنبوب سعة 0.2 مل.

قم بعمل تخفيف من واحد إلى 10 باستخدام ميكرولترين من البلازما و 18 ميكرولترا من أكوام 0.5 مول لكل لتر في أنبوب جديد سعة 0.2 مل. بعد ذلك ، قم بقياس ميكرولترين من العينة المخففة باستخدام NanoDrop 3 ، 300 في النسخ المكررة للحصول على إنتاجية عالية لستة فئران. يرجى اتباع بروتوكول المخطط الانسيابي الموجود في البروتوكول النصي لقياس GFR الكلوي بالكامل بطريقة حقن البلعة الواحدة: يجب جمع ثماني عينات دم في 3 و 5 و 7 و 10 و 15 و 35 و 56 و 75 دقيقة بعد حقن النولين FSE.

في هذا المخطط الانسيابي، تشير الأرقام إلى نقاط زمنية للتجميع بينما تشير الأرقام الموجودة بين قوسين إلى نقاط زمنية لعدد العينة يسار الخط الأحمر العمودي تشير إلى نقاط وقت الححق. يتم تمييز كل ماوس بلون مختلف. للحصول على مجموعات دم متسلسلة ، اتبع الأسهم.

تشير المربعات الرمادية إلى الوقت الذي يجب فيه تحضير الماوس التالي لتخدير الفلور قبل الحقن باستخدام هذا البروتوكول. الحد الأدنى للوقت بين جمعيتين للدم من فئران مختلفة هو محلول حقن النولين المخفف لمدة دقيقة واحدة مع بلازما الفأر المخففة للحصول على التخفيفات القياسية المدرجة في بروتوكول النص. يعتمد تركيز المعايير على غسيل الكلى وسيكون دائما مختلفا لكل تحضير من FSI nulin.

لذلك ، من الضروري إدخال تركيز المنحنى القياسي في كل مرة. قم بتحليل البيانات لحساب معدل الترشيح الكبيبي أو GFR باستخدام البرنامج المناسب باستخدام وظيفة الاضمحلال الأسي على مرحلتين كما هو موضح بالتفصيل في بروتوكول النص لقياس GFR في الفئران الواعية. يتم استخدام حركية البلازما للإينولين ZI بعد الحقن الوريدي بجرعة واحدة لحساب نموذج GFRA المكون من جزأين في نموذج الجزءين.

تمثل مرحلة الاضمحلال السريع الأولية إعادة توزيع الأنسولين الفيتزي من الحيز داخل الأوعية الدموية إلى السائل خارج الخلية. تعكس المرحلة اللاحقة مع التحلل البطيء في تركيز الأنسولين الفيتزي في الغالب التصفية الجهازية من البلازما. تم إحداث داء السكري من النوع الأول عن طريق تطبيق الستربتوزوتوسين داخل الصفاق.

تم تحديد GFR قبل وبعد خمسة أسابيع من تحريض مرض السكري من النوع الأول تظهر السكرية بوضوح فرط الترشيح الكبيبي. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية قياس معدل الترشيح الكبيبي في الفئران الكبيرة باستخدام تقنية حقن بلعة واحدة واستخدام نموذج DK الأسي على مرحلتين.