التصوير ثلاثي الأبعاد من مسبب الألياف العصبية داخل البشرة في خزعات الجلد البشري

الهدف العام من هذا الإجراء هو إجراء صبغ كيميائي نسيجي مناعي على مقاطع خزعة من جلد بشري لدراسة التغيرات المورفولوجية للألياف العصبية داخل البشرة المرتبطة بالاعتلال العصبي المؤلم من خلال التصوير ثلاثي الأبعاد. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تنفيذ بروتوكول صبغ كيميائي نسيجي مناعي للمقاطع العائمة لمدة ثلاثة أيام على مقاطع فردية من خزعة الجلد البشري. وتتمثل الخطوة الثانية في تصوير مقاطع الجلد التي يبلغ سمكها 50 micron باستخدام مجهر بؤري.

بعد ذلك، يتم تشغيل ملفات صور عرض التدفق باستخدام برنامج MRS لإنشاء ملف فيديو ثلاثي الأبعاد لصور التألق المناعي الأصلية. وتتمثل الخطوة النهائية في استخدام برنامج vdw أو برنامج مشابه لضغط ملف الفيديو. وفي النهاية، تتيح نتائج التصوير ثلاثي الأبعاد فرصة لدراسة التغيرات المورفولوجية المرتبطة بالاعتلال العصبي المؤلم.

في الوقت الحالي، تُستخدم كثافة الألياف العصبية البشرية أثناء الجراحة كطريقة كمية لتشخيص الاعتلال العصبي. ومن شأن الوسم المشترك لهذه الألياف العصبية داخل الجلد مع المؤشر الحيوي لاستقبال الألم أن يسلط الضوء على الألم المرتبط بهذه المضاعفات. غير أن بروتوكول التصوير ثنائي الأبعاد الحالي يواجه قيوداً متعددة، بما في ذلك تداخل الألياف العصبية.

وفي المقابل، يوفر التصوير ثلاثي الأبعاد فرصة لإجراء المزيد من التحليل للتغيرات المورفولوجية المرتبطة بالاعتلال العصبي، مثل تورم المحاور العصبية وشحوبها، بالإضافة إلى قياسات حجم المحاور. ومن المهم ملاحظة أنه يجب اتخاذ تدابير لضمان الحصول على صور عالية الجودة لإنتاج رسوم متحركة ثلاثية الأبعاد ذات دلالة، حيث يمكن لهذه الطريقة أن توفر رؤى حول الاعتلال العصبي المؤلم. كما يمكن تطبيقها على عينات أخرى مثل المزارع العضوية السميكة أو المزارع الخلوية ثلاثية الأبعاد لفحص وقياس التغيرات المعقدة في المورفولوجيا ثلاثية الأبعاد.

بعد تثبيت وتقطيع خزعات الجلد البشري كما هو موضح في الجزء المكتوب من هذا البروتوكول، قم بتسمية طبق يحتوي على 96 بئرًا لاستخدامه في الصبغ كما هو موضح في هذه الصورة. بعد ذلك، أضف 150 µL من signal ITFX إلى كل بئر في الصف الأول من الطبق المسمى، واستخدم الماصة لإضافة 150 µL من 1X PBS إلى جميع الآبار في الصفين الثاني والثالث. استخدم عروة تلقيح لنقل مقطع بحجم 50 mm مأخوذ من خزعة الساق القاصية لمريض إلى أحد الآبار التي تحتوي على image.

يتم بعد ذلك نقل مقطع بطول 50 مليمتر مأخوذ من الجزء القريب من ساق المريض نفسه إلى البئر التالي الذي يحتوي على image. وتكرر هذه العملية مع مقاطع الساق البعيدة والفخذ القريبة من ثلاثة مرضى آخرين. يتم تحضين المقاطع في image على هزاز مسطح لمدة 30 دقيقة، وبينما يتم تحضين مقاطع الخزعة في image، يتم تحضير محلول حجب بنسبة 5% ومزج المحلول بواسطة جهاز vortex حتى تذوب BS A تماماً بعد مرور 30 دقيقة.

انقل المقاطع إلى محلول PBS في الصف الثاني وقم بهزها لمدة 10 دقائق، يتبع ذلك شطفها في محلول PBS في الصف الثالث لمدة 10 دقائق. مع الاستمرار في الهز، قم بسحب 150 µL من محلول حجب 5% BSA باستخدام الماصة في كل بئر من آبار الصف الرابع، ثم انقل المقاطع إلى هذه الآبار؛ احضن المقاطع في محلول الحجب 5% BSA لمدة تتراوح من ساعة إلى ساعتين في درجة حرارة الغرفة على هزاز مسطح. وأثناء هذه الحضنة، قم بتحضير محلول شطف بتركيز 1% عن طريق الرج بجهاز الفورتكس حتى يذوب BSA تمامًا، ثم خفف الأجسام المضادة الأولية إلى التركيز المطلوب في هذا المحلول.

ثم أضف 150 µL من الأجسام المضادة الأولية المخففة إلى الآبار الموجودة في الصف الخامس من صفيحة 96 بئرًا. وبعد انقضاء فترة الحضانة، انقل المقاطع من محلول الحجب إلى آبار الأجسام المضادة الأولية المناسبة. بعد ذلك، أغلق الصفيحة بإحكام باستخدام البارافيلم ورقائق الألومنيوم لتجنب الجفاف والتعرض للضوء، وتحضنها طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C على هزاز مسطح. وفي اليوم التالي، أضف 150 µL من محلول شطف 1%BSA إلى كل بئر في الصفوف السادس والسابع والثامن، ومرر المقاطع عبر عمليات الغسل هذه لمدة ساعة واحدة مع الهز في درجة حرارة الغرفة، مع التأكد من حماية الصفيحة من الضوء أثناء كل غسلة. وأثناء تحضن المقاطع في الغسلة الأخيرة من محلول شطف 1%BSA، قم بتخفيف الأجسام المضادة الثانوية في محلول شطف 1%BSA وفقًا للتعليمات الواردة في الجزء المكتوب من البروتوكولات.

بمجرد انقضاء وقت الحضن، أضف 150 µL من الأجسام المضادة الثانوية المخففة في الآبار المحددة في الصف التاسع من طبق الـ 96 بئرًا. انقل القطاعات إلى هذه الآبار وقم بتغطية الطبق بالبارافورم ورقائق الألومنيوم، ثم احضنها طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C على جهاز هزاز مسطح. في اليوم التالي، أضف 150 µL من محلول شطف 1% BSA في كل بئر من الصفوف 10 و11 و12، واشطف القطاعات في هذا المحلول لمدة ساعة واحدة لكل منها كما سبق.

بينما يتم تحضين مقاطع الخزعة في الشطفة الأخيرة من محلول الشطف 1%BSA، قم بتجهيز شرائح المجهر عن طريق سحب 50 µL من محلول الشطف 1%BSA ووضعها على شريحة واحدة في كل مرة. قم بإخراج المقطع من الشطفة الأخيرة وضعه في قطرة الـ 50 µL من محلول الشطف 1%BSA الموجودة على شريحة المجهر المحددة. بعد تحسين موضع المقطع، قم بإزالة محلول الشطف 1%BSA الزائد باستخدام ماصة زجاجية ذات بصلة، مع اتخاذ الاحتياطات اللازمة لتجنب لمس العينة.

ضع قطرة واحدة من كاشف التثبيت Prolonged Gold المضاد للتلاشي مع DPI بالقرب من الخزعة على شريحة المجهر. ثم خذ غطاء شريحة زجاجي بمقاس 22 في 22 مليمتر وضعه برفق فوق الخزعة وقطرة كاشف التثبيت. قم بإزالة أي فقاعات هوائية باستخدام طرف ماصة وامسح أي كمية زائدة من Prolonged Gold.

كاشف Antifa. كرر العملية لكل مقطع واترك شرائح المجهر تجف طوال الليل في درجة حرارة الغرفة وفي الظلام حتى اليوم التالي. قم بتصوير الإشارات الفلورية باستخدام مجهر بؤري (confocal)، حيث استُخدم هنا مجهر Olympus flow view 500 الماسح بالليزر مع عدسة زيتية 40 x وتقريب بمقدار مرتين وباستخدام برنامج flow view الإصدار 5.0.

استخدم Alexa floor 4 88 و Alexa floor 6 47 لاستثارة ليزر الهيليوم-نيون الأخضر بطول موجي 543 nanometer وليزر الهيليوم-نيون الأحمر بطول موجي 633 nanometer على التوالي. اضبط فتحات البؤرة المجهرية (confocal apertures) لكل كاشف عند 400 microns لتعزيز الإشارات. يجب إجراء عمليات مسح متسلسلة بدقة 10 24 في 10 24.

لتحقيق أقصى قدر من فصل الإشارات، قم بالتقاط سلسلة Z ثلاثية الأبعاد باستخدام فواصل خطوة Z بمقدار 1.2 micron بناءً على وحدة المسح المثلى، والتي يتم حسابها بواسطة برنامج flow view من خلال متوسط إطاري kalman عند فتح ملفات flow view أولاً في برنامج MRSX 64 أو ما يماثله. ولعرض مجموعات الصور ثلاثية الأبعاد، قم بضبط العرض حسب الحاجة لتعزيز تباين الإشارة الخاصة بالأعصاب. قم بإنشاء سطح لتصور الحدود بين البشرة والأدمة.

استخدم أداة تحديد الخطوط الخارجية (contour tool) في وضع الرسم لرسم الحدود. قم بتعيين سطح شبه شفاف للحدود من أجل رؤية إشارات الفلورسنت الأساسية والتقاط صور ثابتة لإشارات الفلورسنت ثلاثية الأبعاد. لإنشاء صور لقطات من الفيلم ثلاثي الأبعاد، استخدم ميزة الرسوم المتحركة لإنشاء مجموعة رسوم متحركة لفيلم ثلاثي الأبعاد لإنتاج أفلام تتكون من 200 إطار، وتتحرك بمعدل 15 إطاراً في الثانية.

احفظ كل مقطع فيديو كملف AVI خام، ثم قم بضغط ملف AVI النهائي باستخدام برنامج Virtual Dub أو برنامج مماثل. يعرض هذا الفيديو صوراً ثلاثية الأبعاد للألياف العصبية داخل البشرة الحسية. تُظهر الصورة الأولى أليافاً عصبية داخل البشرة إيجابية لـ PGP ملونة باللون الأخضر، وهي تمثل إجمالي الألياف العصبية داخل البشرة، كما تُظهر أليافاً عصبية داخل البشرة إيجابية لـ track a ملونة باللون الأحمر، وهي تمثل الألياف العصبية داخل البشرة الحسية.

وأخيراً، تظهر الصورة الناتجة ألياف الأعصاب داخل البشرة الحسية الموجبة لـ PGP في عينة جلدية من الحالة الأولى، ويمثل شريط المقياس 20 microns. يوضح الفيديو التالي صوراً ثلاثية الأبعاد للتورمات المحورية في ألياف الأعصاب داخل البشرة في حالات الاعتلالات العصبية المؤلمة. يمكن رؤية التورمات المحورية المشار إليها برؤوس الأسهم على طول ألياف الأعصاب داخل البشرة المحددة بـ PGP بإشارة خضراء ضمن الضفيرة تحت الجلد.

في عينة جلدية من الحالة الثانية، يمثل شريط المقياس 10 microns. تُظهر هذه الصورة ثلاثية الأبعاد تفرع المحاور العصبية في الألياف العصبية داخل البشرة في حالة الاعتلال العصبي المؤلم. يمكن رؤية تفرع المحاور العصبية المشار إليها برؤوس السهام على طول الألياف العصبية داخل البشرة المحددة ببروتين PGP بإشارة خضراء في عينة جلدية من الحالة الثالثة.

يمثل شريط المقياس 20 microns. بمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إكمالها على مدار أربعة أيام، بواقع ثلاث ساعات ونصف يومياً للكيمياء النسيجية المناعية و35 دقيقة لكل عينة للتصوير البؤري والرسوم المتحركة ثلاثية الأبعاد. أثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر نقل وتثبيت الأنسجة بشكل صحيح، مع اتخاذ الاحتياطات اللازمة لتجنب تمزيق أو قطع عينات العينات. بعد اتباع هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل تحليل tric ثلاثي الأبعاد لتقييم الابتكار الجلدي من أجل الإجابة على أسئلة إضافية.

هل يلعب تفرع ألياف الأعصاب البطنية دوراً هاماً في تطور الاعتلال العصبي المؤلم؟