التصوير ثلاثي الأبعاد من مسبب الألياف العصبية داخل البشرة في خزعات الجلد البشري

من أجل دراسة التغيرات من الألياف العصبية داخل البشرة مسبب (IENFs) في اعتلال الأعصاب المؤلم (PN)، قمنا بتطوير البروتوكولات التي يمكن أن تفحص مباشرة التغيرات المورفولوجية ثلاثي الأبعاد لوحظ في IENFs مسبب. تحليل ثلاثي الأبعاد للIENFs لديه القدرة على تقييم التغيرات المورفولوجية للIENF في PN.

الهدف العام من هذا الإجراء هو إجراء الكيمياء النسيجية المناعية على أقسام خزعة جلد الإنسان لدراسة التغيرات المورفولوجية للألياف العصبية داخل البشرة المرتبطة بالاعتلال العصبي المؤلم من خلال التصوير ثلاثي الأبعاد. يتم تحقيق ذلك عن طريق إجراء بروتوكول الكيمياء المناعية للقسم العائم لمدة ثلاثة أيام أولا على أقسام خزعة جلد الإنسان الفردية. الخطوة الثانية هي تصوير أقسام الجلد بسمك 50 ميكرون باستخدام مجهر متحد البؤر.

بعد ذلك ، يتم تشغيل ملفات صور عرض التدفق باستخدام برنامج MRS لإنشاء ملف فيلم ثلاثي الأبعاد للصور المناعية الفلورية الأصلية. الخطوة الأخيرة هي استخدام برنامج vdw أو ما شابه ذلك لضغط ملف الفيلم. في النهاية ، تتيح نتائج التصوير ثلاثي الأبعاد الفرصة لدراسة التغيرات المورفولوجية المرتبطة بالاعتلال العصبي المؤلم.

في الوقت الحاضر ، يتم استخدام كثافة الألياف العصبية للبشرة أثناء العملية كطريقة كمية لتشخيص الاعتلال العصبي. إن وضع العلامات المشتركة لهذه الألياف العصبية داخل الأدمة مع المؤشر الحيوي المسبب للألم لديه القدرة على إلقاء الضوء على الألم المرتبط بهذه المضاعفات. يحتوي بروتوكول التصوير ثنائي الأبعاد الحالي على قيود متعددة ، بما في ذلك تداخل الألياف العصبية.

في المقابل ، يوفر التصوير ثلاثي الأبعاد فرصة لمزيد من التحليل للتغيرات المورفولوجية المرتبطة بالاعتلال العصبي مثل المحور العصبي والتورم والتبييض ، بالإضافة إلى قياسات الحجم المحوري. من المهم ملاحظة أنه يجب اتخاذ تدابير من أجل الحصول على صور عالية الجودة لإنشاء رسوم متحركة ثلاثية الأبعاد ذات مغزى يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة للاعتلال العصبي المؤلم. يمكن أيضا تطبيقه على عينات أخرى مثل مزارع الأعضاء السميكة أو مزارع الخلايا ثلاثية الأبعاد لفحص وقياس التغيرات المعقدة في التشكل ثلاثي الأبعاد.

بعد تثبيت خزعات جلد الإنسان وتقسيمها كما هو موضح في الجزء المكتوب من ملصق البروتوكول هذا ، يجب استخدام لوحة بئر 96 للتلوين كما هو موضح في هذه الصورة. ثم أضف 150 ميكرولترا من إشارة ITFX للصورة إلى كل بئر في الصف واحد من لوحة البئر 96 المميزة والماصة 150 ميكرولترا من XPBS واحد في جميع الآبار في الصفين الثاني والثالث. استخدم حلقة تلقيح لنقل قسم 50 ملم مأخوذ من خزعة الساق البعيدة للمريض إلى أحد الآبار التي تحتوي على صورة.

ثم ينقل قسما بحجم 50 ملم مأخوذ من الخمسة القريبة لنفس المريض إلى البئر التالي الذي يحتوي على الصورة. يكرر هذا الإجراء مع أقسام الساق البعيدة والفخذ القريب من ثلاثة مرضى آخرين. احتضان الأقسام ، وقم بتصويرها على كرسي هزاز مسطح لمدة 30 دقيقة بينما يتم احتضان أقسام الخزعة في الصورة ، فهي تعد محلول حجب بنسبة 5٪ وقم بدوامة المحلول حتى يذوب BS A تماما بعد انقضاء 30 دقيقة.

انقل الأقسام إلى PBS في الصف الثاني وصخور لمدة 10 دقائق ، متبوعا بالشطف في PBS في الصف الثالث لمدة 10 دقائق. مرة أخرى مع هزاز الماصة التالية 150 ميكرولتر من 5٪ BS ، محلول مانع في كل بئر من الصف الرابع ونقل الأقسام إلى هذه الآبار تحتضن الأقسام في محلول حجب BSA بنسبة 5٪ لمدة ساعة إلى ساعتين في درجة حرارة الغرفة على هزاز مسطح. أثناء هذه الحضانة ، قم بإعداد محلول الشطف بنسبة 1٪ حتى يذوب BSA تماما ثم قم بتخفيف الأجسام المضادة الأولية إلى التركيز المطلوب في هذا المحلول.

ثم أضف 150 ميكرولترا من الأجسام المضادة الأولية المخففة إلى الآبار في الصف الخامس من لوحة البئر 96. وبعد انقضاء فترة الحضانة ، انقل الأقسام من محلول الحجب إلى آبار الأجسام المضادة الأولية المناسبة. بعد ذلك ، أغلق اللوحة بورق الألمنيوم ورقائق الألومنيوم لتجنب الجفاف والتعرض للضوء واحتضانها طوال الليل عند أربع درجات مئوية على كرسي هزاز مسطح في اليوم التالي ، أضف 150 ميكرولترا من محلول الشطف BSA بنسبة 1٪ في كل بئر في الصف السادس والسابع والثامن ، وقم بتمرير الأقسام عبر هذه الغسالات لمدة ساعة واحدة مع هزها في درجة حرارة الغرفة مع التأكد من حماية اللوحة من الضوء أثناء كل غسل أثناء يتم احتضان الأقسام في الشطف الأخير لمحلول الشطف BSA 1٪ تخفيف الأجسام المضادة الثانوية في محلول شطف BSA بنسبة 1٪ وفقا للتعليمات الواردة في الجزء المكتوب من البروتوكولات.

بمجرد انقضاء وقت الحضانة ، أضف 150 ميكرولترا من الأجسام المضادة الثانوية المخففة في الآبار المخصصة للصف التاسع من 96. تنقل لوحة البئر الأقسام إلى هذه الآبار وتغطي اللوحة برقائق الألومنيوم وتحتضن طوال الليل عند أربع درجات مئوية على هزاز مسطح. في اليوم التالي ، أضف 150 ميكرولترا من محلول الشطف BSA بنسبة 1٪ في كل بئر في الصف 10 و 11 و 12 ، واشطف الأقسام الموجودة في هذا المحلول لمدة ساعة واحدة كما كان من قبل.

أثناء احتضان أقسام الخزعة في الشطف الأخير لمحلول شطف BSA بنسبة 1٪ ، قم بإعداد شرائح المجهر عن طريق سحب 50 ميكرولترا من محلول الشطف BSA بنسبة 1٪ على شريحة واحدة في كل مرة. قم بإزالة القسم من آخر شطف وضعه في قطرة 50 ميكرولتر من محلول شطف BSA بنسبة 1٪ على شريحة المجهر المخصصة. بعد تحسين موضع القسم ، قم بإزالة محلول الشطف الزائد بنسبة 1٪ BSA باستخدام ماصة زجاجية لمبة مع اتخاذ الاحتياطات اللازمة لتجنب لمس العينة.

ضع قطرة واحدة من كاشف التثبيت الذهبي المطول المضاد للبهتان مع DPI بالقرب من الخزعة على شريحة المجهر. ثم خذ زلة غطاء زجاجي مجهر مقاس 22 × 22 ملم وضعها برفق فوق الخزعة وإسقاط كاشف التركيب. قم بإزالة أي فقاعات هواء باستخدام طرف ماصة وامسح الذهب الزائد لفترات طويلة.

كاشف أنتيفا. كرر لكل قسم واترك شرائح المجهر تجف طوال الليل في درجة حرارة الغرفة في الظلام في اليوم التالي. صور إشارات الفلورسنت باستخدام مجهر متحد البؤر ، يتم استخدام مجهر متحد البؤر للمسح الضوئي بالليزر Olympus flow view 500 مع هدف غمر الزيت 40 × والتكبير مرتين باستخدام برنامج عرض التدفق الإصدار 5.0 هنا.

استخدم Alexa floor 4 88 و Alexa floor 6 47 لإثارة ليزر النيون الأخضر الهيليوم 543 نانومتر وليزر النيون الأحمر الهيليوم 633 نانومتر على التوالي. اضبط الفتحات البؤرية لكل كاشف على 400 ميكرون لتحسين الإشارات. وينبغي إجراء عمليات المسح التسلسلي بدقة 10 24 × 10 24.

لتعظيم فصل الإشارة ، التقط سلسلة Z ثلاثية الأبعاد باستخدام فواصل زمنية خطوة 1.2 ميكرون Z بناء على وحدة المسح المثلى ، المحسوبة بواسطة برنامج عرض التدفق باستخدام إطارين كالمان بمتوسط ملفات عرض التدفق المفتوح الأولى في برنامج MRSX 64 أو ما شابه ذلك. لتصور مجموعات الصور ثلاثية الأبعاد، اضبط الشاشة حسب الحاجة لتحسين تباين الإشارة الخاصة بالعصب. قم بإنشاء سطح لتصور حدود البشرة الجلدية.

استخدم أداة الكنتور في وضع الرسم لرسم الحدود. قم بتعيين سطح شبه شفاف للحدود من أجل رؤية إشارات الفلورسنت الأساسية والتقاط صور ثابتة لإشارات الفلورسنت ثلاثية الأبعاد. لإنشاء صور لقطة للفيلم ثلاثي الأبعاد، استخدم ميزة الرسوم المتحركة لإنشاء مجموعة أفلام ثلاثية الأبعاد لإنشاء أفلام تتكون من 200 إطار، متحركة بمعدل 15 إطارا في الثانية.

احفظ كل فيلم كملف A VI خام ، وقم بضغط فيلم A VI النهائي باستخدام برنامج دبلجة افتراضي أو ما شابه. يعرض هذا الفيديو صورا ثلاثية الأبعاد للألياف العصبية داخل البشرة المسببة للألم. تظهر هذه الصورة الأولى ألياف عصبية داخل البشرة إيجابية PGP تحمل علامة خضراء ، وتمثل إجمالي الألياف العصبية داخل البشرة ، وأيضا تتبع الألياف العصبية الإيجابية داخل البشرة المسمى باللون الأحمر ، والتي تمثل الألياف العصبية داخل البشرة المحفزة للألم.

وأخيرا ظهرت صورة توضح PGP إيجابية للألم داخل البشرة في عينة جلدية من الحالة الأولى ، يمثل شريط المقياس 20 ميكرون. يظهر الفيديو التالي صورا ثلاثية الأبعاد للتورمات المحورية في الألياف العصبية داخل البشرة للاعتلالات العصبية المؤلمة. يمكن رؤية التورمات المحورية المشار إليها برؤوس الأسهم على طول الألياف العصبية داخل البشرة المسماة بواسطة PGP بإشارة خضراء داخل الضفيرة تحت الجلد.

في عينة جلدية من الحالة الثانية ، يمثل شريط المقياس 10 ميكرون. تظهر هذه الصورة ثلاثية الأبعاد التفرع المحوري في الألياف العصبية داخل البشرة للاعتلال العصبي المؤلم. يمكن رؤية التفرع المحوري المشار إليه بواسطة رؤوس الأسهم على طول الألياف العصبية داخل البشرة المسماة بواسطة PGP مع إشارة خضراء في عينة جلدية من الحالة الثالثة.

يمثل شريط المقياس 20 ميكرون بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال هذه التقنية على مدار أربعة أيام ، ثلاث ساعات ونصف كل يوم للكيمياء المناعية و 35 دقيقة لكل عينة للتصوير متحد البؤر والرسوم المتحركة ثلاثية الأبعاد. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر نقل الأنسجة وتركيبها بشكل صحيح ، مع اتخاذ الاحتياطات اللازمة لتجنب تمزيق عينات العينة أو تمزيقها باتباع هذا الإجراء. يمكن إجراء طرق أخرى مثل تحليل التريكي ثلاثي الأبعاد لتقييم الابتكار الجلدي من أجل الإجابة على أسئلة إضافية.

مثل ، هل يلعب تفرع الألياف العصبية البطنية دورا مهما في تطور الاعتلال العصبي المؤلم؟