على

الهدف العام من التجربة التالية هو عزل الخلايا الوحيدة عن الدم المحيطي البشري وتمييزها نحو أنواع مختلفة من استقطاب البلاعم. يتم تحقيق ذلك عن طريق عزل خلايا الدم المحيطي البشرية أحادية النواة أولا عن طريق الطرد المركزي المتدرج الكثافة. كخطوة ثانية ، يتم إجراء عزل الخرزة السلبية للحصول على الخلايا الوحيدة الإيجابية CD 14 النقية.

بعد ذلك ، يتم استزراع الخلايا الوحيدة في ظل ظروف محددة من أجل إحداث البلاعم المستقطبة على وجه التحديد. في النهاية ، يمكن تحديد التعبير التفاضلي لعلامات استقطاب البلاعم استجابة لظروف استزراعها عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في تشريح تمايز البلاعم نحو أنواع الاستقطاب المختلفة.

ميزة مهمة للغاية في الأمراض الالتهابية مثل تصلب الشرايين. بعد سحب 30 مل من الدم الكامل من الوريد الساعد من أحد المتطوعين ، قسم الدم بالتساوي إلى أنبوبين مخروطيين غير بوليسترين سعة 50 مل. ثم قم بتخفيف الدم في كل أنبوب ب 10 ملليلتر من PBS.

بعد ذلك ، أضف 25 مل من عبوة هيستو إلى 25 مل من الدم الكامل و PBS في كل أنبوب ، مع الحرص على عدم اختلاط العبوة النسيجية والدم. ثم قم بالطرد المركزي للأنابيب لمدة 30 دقيقة عند 400 جي ثانية ودرجة حرارة الغرفة دون انقطاع. بعد الدوران ، قم أولا بشفط طبقة البلازما ثم انقل طبقة الواجهة غير الشفافة إلى أنبوب جديد سعة 50 مل.

اغسل الخلايا من الواجهة في 20 مل من PBS بالإضافة إلى CDTA لمدة خمس دقائق عند 250 Gs وأربع درجات مئوية. ثم بعد التخلص من الريسوس الطافي ، قم بتعليق الحبيبات في 10 ملليلتر من PBS بالإضافة إلى CDTA واخلط الخلايا جيدا عن طريق الدوامة لمدة 10 ثوان. الآن قم بتخفيف 200 ميكرولتر من تعليق الخلية في 300 ميكرولتر من PBS بالإضافة إلى EDTA ، و 500 ميكرولتر من اللون الأزرق الأزرق.

لتحقيق حوالي 200 إلى 500 خلية لكل 10 مربعات ومقياس الخلوي الدموي ، ابدأ العزل السلبي عن طريق تدوير الخلايا ثلاث مرات لمدة 10 دقائق عند 120 جيجاس: بعد الغسيل الثاني ، نعلق الحبيبات في تسعة ملليلتر من الماء المعقم لمدة ثلاث ثوان. ثم أضف ملليلترا واحدا من 10 XPBS بعد غسل الخلايا وعدها مرة أخرى ، وقم بتخفيفها في مخزن مؤقت سهل الضبط عند خمسة في 10 من الخلايا السبع لكل مليلتر. الآن احتضان الخلايا لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية في 50 ميكرولتر لكل مليلتر من كوكتيل تخصيب الخلايا الأحادية.

خلال الدقيقة الأخيرة من دوامة الحضانة ، يتم تخصيب حبات تخصيب الخلايا الأحادية لمدة 30 ثانية. ثم أضف 50 ميكرولترا لكل مليلتر من الخرزات إلى الخلايا واحتضن الخرزة في معلق الخلية لمدة خمس دقائق أخرى. بعد الحضانة الثانية ، ارفع حجم محلول الخلية إلى 2.5 ملليلتر.

مع المزيد من المخزن المؤقت eep ، سيظهر المحلول الآن بلون بني. بعد ذلك ، ضع الأنبوب في مغناطيس eep لمدة دقيقتين ونصف في درجة حرارة الغرفة. بعد أن تتاح للخلايا المرتبطة بالخرزة فرصة الالتصاق ، اسكب المخزن المؤقت الذي يحتوي على الخلايا الوحيدة غير الملزمة في أنبوب معقم جديد.

سيظهر المحلول الآن بلون أبيض بعد غسل الخلايا غير المرتبطة مرة واحدة باستخدام PBS plus EDTA ، ونقل الخلايا إلى صفيحة متعددة الآبار ، ثم إضافة مليلتر واحد من وسائط الثقافة لكل مرة واحدة في 10 إلى الخلايا الست إلى لوحة الثقافة. أخيرا ، قم بزراعة الخلايا في ظل الظروف التجريبية ذات الأهمية لمدة ستة أيام للحث على تمايز البلاعم. استبدال نصف وسائل الإعلام بعد ثلاثة أيام بوسائط جديدة بعد ستة أيام.

حصاد الخلايا للتحليل التجريبي المطلوب. باستخدام البروتوكول الموصوف أعلاه ، يتم الحصول على حوالي 25 مرة من الخلايا الوحيدة الستة بشكل روتيني من 100 مل من نقاء الخلايا الوحيدة في الدم ، كما هو محدد من خلال تلطيخ قياس التدفق الخلوي ل CD 14 يكون بشكل روتيني أكبر من 95٪ عند إضافته لأول مرة إلى المزرعة. تكون الخلايا الوحيدة مستديرة الشكل في البداية وتطفو في غضون ساعات قليلة.

ومع ذلك ، فإنهم يلتزمون بإعطائهم بيضة مقلية أو مظهر يشبه المغزل بعد ستة أيام. في الثقافة مع MCSF وحده أو مع إضافة LDL المؤكسد خلال ال 24 ساعة الماضية أو ما يقرب من 80٪ من الخلايا غير المعرضة للكولي الدهني منخفض الكثافة المؤكسد قابلة للحياة على النحو الذي يحدده يوديد البروبيديوم. من ناحية أخرى ، يؤدي علاج التلوين باستخدام LDL المؤكسد إلى بقاء الخلية بنسبة 70٪ بعد ستة أيام من الزراعة.

مع تدفق MCSF ، يوضح تحليل CYTOMETRIC أنه بينما تستمر الخلايا في التعبير عن علامة الكريات البيض CD 45 ro ، فإنها تقلل من تنظيم علامة الخلية الوحيدة CD 14. اعتمادا على الظروف المحددة التي قد تؤدي إلى استقطاب البلاعم أثناء زراعة الخلايا ، فإن العلامات الإضافية ضرورية لتبرير الاستقطاب الناجح. قد تؤدي ظروف معينة إلى استقطاب البلاعم.

على سبيل المثال ، تعبر البلاعم المستقطبة M1 عن علامات نموذجية مثل IL six و TNF alpha ، في حين أن M اثنين من البلاعم المستقطبة تعبر عن CD 36 و CD 2 0 6 ، يمكن دراسة البلاعم بشكل أكبر في التجارب الوظيفية. على سبيل المثال ، يمكن دراسة امتصاص LDL المؤكسد باستخدام LDL المسمى بالفلورسنت. في هذه التجربة ، تعرضت الخلايا ل 10 ميكروغرام لكل مليلتر من DII المسمى LDL المؤكسد لمدة أربع ساعات ، وتلطخ النوى بنقطة في البوصة.

يوضح الرسم البياني قياس التدفق الخلوي لامتصاص LDL المؤكسد DII بواسطة البلاعم المستحثة MCSF مع الرسم البياني الرمادي الصلب الذي يمثل خلايا التحكم غير المعالجة والرسم البياني الأسود المفتوح. تمثيل الضامة المعالجة بالبروتين الدهني منخفض الكثافة المؤكسدة بعد تطورها. تمكن هذه التقنية الباحثين من دراسة التمايز وعدم تجانس البلاعم البشرية.

وبالتالي يمكنهم من دراسة الأمراض الالتهابية مثل تصلب الشرايين لتحديد آليات المرض الجديدة والأهداف العلاجية الجديدة.