عالية الإنتاجية، استخراج الآلي من DNA و RNA من العينات السريرية باستخدام تكنولوجيا TruTip على الروبوتات مناولة السائل المشترك

الهدف العام من التجربة التالية هو عزل DNA الجينومي البشري من الدم الكامل، باستخدام تقنية الاستخلاص عبر الرؤوس الماصة (true tip) بواسطة محطة عمل هاميلتون ستار (Hamilton Star) لمناولة السوائل. ولتحقيق ذلك، يتم سحب وتوزيع الخلايا المحللة في محلول يتكون من محلول تحليل عينة الدم وproteinase K والإيثانول عبر الرؤوس الماصة لعدة مرات، مما يؤدي إلى ربط DNA بمصفوفة الرأس الماص. بعد ذلك، يتم تمرير محلولي غسيل منفصلين عبر الرؤوس الماصة لإزالة البروتينات المتبقية، ومحلول التحليل، والملوثات الأخرى من الأحماض النووية المرتبطة.

في الخطوة الثالثة، يتم تجفيف مصفوفة الارتباط للطرف الحقيقي (true tip) عن طريق سحب وتفريغ الهواء عدة مرات لتبخير أي محلول غسيل متبقٍ؛ وفي الخطوة النهائية، يتم تمرير محلول الشطف (elusion buffer) ذهاباً وإياباً عبر مصفوفة الارتباط لتحرير DNA من المصفوفة. وباستخدام تقنية الطرف الحقيقي (true tip)، يتم استخلاص DNA جينومي عالي الوزن الجزيئي وخالٍ من الملوثات، ويمكن تأكيد ذلك عن طريق امتصاص الأشعة فوق البنفسجية (UV vis absorbance)، والترحيل الكهربائي للهلام (gel electrophoresis)، وتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (quantitative PCR) أو التسلسل. وتكمن مزايا الطرف الحقيقي مقارنة بطرق تحضير العينات الأخرى القائمة على أعمدة الطرد المركزي أو الجسيمات المغناطيسية في أن الطرف الحقيقي يسهل أتمتته.

إن هذه الطريقة لا تتطلب أنظمة مكلفة تحتوي على أجهزة طرد مركزي وقضبان مغناطيسية، كما أن سير العمل البسيط يوفر مساحة قيمة على سطح الجهاز. وعلى الرغم من تركيزنا اليوم على الدم الكامل، إلا أنه يمكن تطبيق Tru Tip على تطبيقات عينات الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (gDNA) الأخرى، بالإضافة إلى الحمض النووي الريبوزي (RNA) الفيروسي من عينات المسحات السريرية، أو عزل الحمض النووي الخالي من الخلايا (cfDNA) من البلازما، على سبيل المثال لا الحصر. سيقوم باستعراض هذا الإجراء دان برادي، وهو مهندس أتمتة من مختبرنا كان له دور فعال في تطوير إجراء الاستخلاص باستخدام Tru Tip على محطة هاميلتون لتداول السوائل (Hamilton Liquid Handling Workstation).

في هذا البروتوكول، يقوم روبوت مناولة السوائل Hamilton Star باستخلاص الحمض النووي DNA في وقت واحد من 96 بئرًا من الدم الكامل. يحتوي Hamilton Star على وحدة هزاز تسخين اختيارية على المنصة، وهي مهمة للهضم الإنزيمي لبعض المصفوفات السريرية مثل الدم الكامل. ونظرًا لإمكانية تزويد النظام برأس ماصة ذو 96 قناة، فهناك لوحة مخصصة مكونة من 96 بئرًا لكل خطوة من خطوات رؤوس الماصات الحقيقية والكواشف.

قم أولاً بتشغيل المعدات المرتبطة بروبوت Hamilton Star وجهاز الكمبيوتر. افتح برنامج Hamilton Run Control في البرمجيات. افتح ملف التشغيل المقدم من ACON لـ 96 عينة.

قم الآن بتجهيز تخطيط سطح منصة star وفقاً للمخطط. ضع رؤوس ماصات مرشحة سعة 1 mL في جميع المواضع التي تحمل الرقم 1، وفي الموضع 2 ضع رؤوس ماصات غير مرشحة سعة 1 mL، وفي الموضع 3 ضع رؤوس Conni Hamilton LPT سعة 1 mL مقاس 2 mm. استمر في الرجوع إلى الجدول لملء المواضع المتبقية من 5 إلى 12 بالأدوات المختبرية المطلوبة، ولكن لا تقم بتحميل العينات بعد.

قم الآن بتوزيع الكواشف، حيث يتم وضع 75 milliliters من محلول التحلل والربط F في موضع الحوض الخامس. بدلاً من ذلك، يمكن استخدام ألواح مملوءة مسبقاً بالمحاليل المنظمة لتسريع عملية التحضير وتبسيط تخطيط منصة العمل.

استمر في تحميل الروبوت وفقاً لذلك. وأخيراً، قم بإزالة الأغطية من أنابيب الدم وضعها في رفوف حامل العينات أو في الموضع الرابع من المنصة. ضع العينة 1 في الجزء الخلفي من الحامل الموجود في أقصى اليسار، ثم تحرك بالتتابع عبر كل حامل وصولاً إلى العينة 96 التي تنتهي في الموضع الأمامي الأيمن.

بمجرد تحميل جميع العينات، اتركها حتى تتوازن وتصل إلى درجة حرارة الغرفة. ونظراً لأن البروتوكول مؤتمت بالكامل، فإن فرصة حدوث خطأ من قبل المشغل تكون ضئيلة. يجب وضع العينات بالترتيب الصحيح في الحامل، ولكن يمكن تطبيق نظام الترميز الشريطي (bar coding) لضمان تتبع العينات بشكل سليم.

لبدء تشغيل نص برمجياً مؤتمتاً، اختر زر التشغيل في الزاوية العلوية اليسرى من نافذة ملف التشغيل وأدخل عدد العينات التي يتم معالجتها. تتمثل الخطوة الأولى التي ينفذها النص البرمجي في نقل 80 µL من proteinase K إلى لوحة الحضن في الموضع 14 على وحدة الهزاز المسخن. بعد ذلك، يقوم النص البرمجي بتوزيع 200 µL من العينة في كل بئر عينة من لوحات الحضن باستخدام الذراع ثماني القنوات.

يتبع ذلك توزيع 600 µL من محلول التحلل (lysis buffer F) في كل بئر من طبق الحضن باستخدام الذراع المكون من 96 قناة. ثم يقوم البرنامج بمزج المحلول لمدة 10 دورات وتحضين العينات لمدة 20 دقيقة عند 70 °C وبسرعة 500 RPM في طبق الآبار العميقة؛ علماً أن درجة الحرارة هي 60 °C فقط، وهي تقع ضمن نطاق نشاط proteinase K. وأثناءما تخضع العينات للحضن، يستمر نظام مناولة السوائل في العمل عن طريق توزيع كواشف الاستخلاص والاسترداد من أحواض الكواشف السائبة إلى ألواح الـ 96 بئراً المقابلة لها، حيث يتم إضافة 100 µL من محلول الاسترداد (Elucian buffer A) إلى كل بئر في طبق الآبار العميقة.

عند الموضع 13، يتم وضع 800 µL من الإيثانول في كل بئر من بئر اللوحة العميقة. وعند الموضع 10، يتم إضافة 1.6 mL من محلول غسيل K إلى كل بئر من بئر اللوحة العميقة عند الموضع 12، وإضافة 1.6 mL من محلول غسيل J إلى كل بئر من بئر اللوحة العميقة عند الموضع 11. وبعد فترة تحضين لمدة 20 دقيقة، يتم نقل خليط العينة من لوحة التحضين إلى اللوحة العميقة التي تحتوي على الإيثانول عند الموضع 10، حيث يتم خلطها عن طريق 12 دورة من السحب والضخ بالماصة.

يتم التخلص من رؤوس نقل الكواشف في حاوية النفايات حسب الحاجة طوال هذه العملية. وينتقل البرنامج من عملية التحلل إلى استخلاص DNA عن طريق تحميل 96 رأساً حقيقياً (true tips) أولاً من موضع السطح الثالث. والخطوة التالية هي سحب وتوزيع العينات في الموضع 10 على مدار 10 دورات، وبذلك يتم ربط الأحماض النووية بكتلة الرأس الحقيقي الأحادية (true tip monolith).

بعد ذلك، تنتقل الرؤوس الحقيقية إلى الموضع 11 حيث يتم تمرير محلول الغسيل Buffer J فوق المونوليث خمس مرات لإزالة بقايا عملية التحلل والمحلول المنظم ومصفوفة العينة. ثم تنتقل الرؤوس الحقيقية إلى الموضع 12 حيث يمر محلول الغسيل Buffer K من خلالها خمس مرات لإزالة البروتينات والملوثات الأخرى من الأحماض النووية المرتبطة. بعد ذلك، تجف الرؤوس الحقيقية بالهواء عن طريق التدوير 80 مرة بسرعة عالية فوق لوحة الغسيل.

الآن، تتحرك الرؤوس الحقيقية إلى الموضع 13 حيث يمر محلول الاستخلاص (elucian buffer) بدورتين من خلالها خمس مرات، مما يؤدي إلى تحرير الـ DNA في صفيحة الآبار العميقة. يتم الآن قذف الرؤوس الحقيقية في حاوية النفايات. وبهذا يكون البرنامج قد انتهى.

قم بإزالة لوحة الاستخلاص من الجهاز وانقل العينات المستخلصة إلى الأنابيب المناسبة للتخزين أو للتطبيقات اللاحقة. يمكن أيضاً تخصيص البرنامج لنقل العينات النهائية تلقائياً إلى الأنبوب أو اللوحة المطلوبة في غضون ساعة واحدة فقط. قام النظام الآلي باستخلاص DNA جينومي من 96 عينة دم باستخدام الروبوت.

تمت معالجة مخططات الامتصاص لـ 45 عينة دم إيجابية بالتزامن مع 45 عينة فارغة من الكاشف. بلغ متوسط نسبة الامتصاص عند 260 إلى 280 مقدار 1.96، وبلغ متوسط النسبة عند 260 إلى 230 مقدار 1.93، مما يشير إلى نقاء العينات على هلام agarose بتركيز 1%. وقد تم تشغيل عينات عشوائية بوزن جزيئي مرتفع مع حد أدنى من التقصص.

كان متوسط الحصيلة حوالي 5 µg من الـ DNA لكل 200 µL من الدم الكامل. وعند تحسين بروتوكول الرؤوس الآلية (automated true tip)، يتم توخي الحذر الشديد لضمان عدم حدوث تلوث خلطي بين الآبار. ويظهر تحليل الـ Real-time PCR فصلاً واضحاً بين العينات الإيجابية والسلبية كما هو موضح هنا.

بالنسبة لاستخلاصات الـ RNA، يمكن إتمام عملية الاستخلاص الكاملة لـ 96 عينة في أقل من ساعة واحدة مع الحاجة إلى حد أدنى من التدخل اليدوي. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يتكون لديك فهم جيد لكيفية عزل الـ DNA الجينومي البشري من الدم الكامل باستخدام تقنية TRU Technology Automated على محطة عمل Hamilton Star لتناول السوائل.