الكالسيوم في الجسم الحي التصوير الخلايا العصبية في C. ايليجانس
أبريل 10, 2013
مع صغر الجسم التشريح العصبي شفافة موثقة جيدا، ومجموعة من التقنيات الجينية قابلة والكواشف، C. ايليجانس يجعل الكائن الحي النموذج المثالي لل في الجسم الحي التصوير باستخدام الخلايا العصبية بسيطة نسبيا، وانخفاض التكلفة التقنيات. نحن هنا وصف واحد التصوير داخل الخلايا العصبية سليمة باستخدام الحيوانات البالغة المشفرة وراثيا مؤشرات الكالسيوم الفلورسنت.
الهدف العام من التجربة التالية هو استخدام الفلورو فور المشفرة وراثيا لقياس ديناميكيات الكالسيوم للخلايا العصبية المفردة داخل الدودة الخيطية. انظر إلى الأناقة ، يتم تحقيق ذلك من خلال تركيب وتفريغ أناقة C السليمة التي تعبر عن فلوروفور حساس للكالسيوم في الخلايا العصبية ذات الأهمية على شريحة مجهر قياسية. بعد ذلك ، يتم تصوير الخلايا العصبية الفردية في الجسم الحي باستخدام الفحص المجهري بالفيديو وتقنيات التصوير الفلوري الموسع القياسية.
ثم يتم تحليل الفيديو لقياس شدة التألق في مواقع محددة في الخلايا العصبية لاثنين من معسكر Fluor fours G شائع الاستخدام ، مما يعطي إشارة قوية ذات سعة كبيرة أحادية القناة وحرباء قائمة على الحنق ، والتي تولد نسبة قناة مزدوجة. يتم الحصول على نتائج القياس المتري للنشاط العصبي الموضح استجابة لمحفزات حسية معينة ، بالإضافة إلى فسيولوجيا الكالسيوم الخلوية استجابة للتلف الخلوي ، وكلاهما يعتمد على القياس البصري لمستويات الكالسيوم النسبية داخل الخلايا العصبية المصورة. تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية على الطرق المماثلة في أنظمة الفقاريات أو الفيزيولوجيا الكهربية التقليدية في أن CL elgan يمثل نظاما قويا ومرنا وقابلا للتتبع وراثيا للتصوير العصبي في الجسم الحي وهو بسيط تقنيا وفعال من حيث التكلفة.
يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجموعة واسعة من بيولوجيا الخلايا العصبية القائمة على المجال ، مما يسمح بقياسات كل من النشاط والجيب مع الخلايا العصبية الفردية في الجسم الحي. ابدأ بمجهر مركب قياسي مع إمكانات التصوير الفلوري لبرنامج epi للحصول على أفضل جودة للصورة والإشارة. استخدم تكبيرا عاليا وهدفا لفتحة عددية عالية وكاميرا CCD مبردة عالية الحساسية من أجل زيادة دقة الصورة وحساسيتها مع تقليل ضوضاء الخلفية لأربعة نباتات أحادية اللون.
استخدم مجموعة مرشح التألق المجهري القياسية المصممة للطول الموجي المعين للفلور أربعة لمعسكر G. استخدم مجموعة مرشح GFP قياسية محسنة للإثارة عند 488 نانومتر والانبعاث عند 525 نانومتر ، وأربعة نباتات مترية ، مثل الحرباء ، تستخدم نظام تصوير مزدوج ، بحيث يمكن التقاط الصور المتطابقة في وقت واحد بطولين موجيين منفصلين. يمكن تحقيق ذلك باستخدام نظام متاح تجاريا أو محلي الصنع يعرض صورا مزدوجة جنبا إلى جنب على الكاميرا بالطريقة التالية.
مجموعة مرشح المجهر مع مرشح إثارة 440 زائد أو ناقص 20 نانومتر و 455 نانومتر تمرير iic مرآة قناع صورة يوضع في مستوى الصورة الأولي مباشرة خارج منفذ التصوير المجهر حيث يجلس مستشعر CCD للكاميرا عادة في مجموعة عدسات الترحيل الأولى ، بعد بؤري واحد بعيدا عن مستوى الصورة الأولي بحيث يقوم بتجميع الضوء ، مرآة ثنائية اللون تقسم الضوء إلى طولين موجيين منفصلين للتصوير أو قناتين يعكسان لونا واحدا أثناء نقل مرشحات الانبعاث الأخرى. زيادة تقييد الضوء المرسل إلى الأطوال الموجية للتصوير المحدد. عدسات الترحيل الثانية ، واحدة لكل قناة موضوعة في مسارات الشعاع بحيث تعيد تركيز الضوء إلى مستوى صورة ثان في كاميرا CCD.
يقومزوج من المرايا ومرآة ثانية ثنائية اللون بتوجيه مسارات الشعاع بحيث يتم إعادة تجميع الصورتين ويتم عرضهما جنبا إلى جنب على الكاميرا. مستشعر CCD. فيما يلي مثال على الصورة الناتجة.
بمجرد الإعداد ، يمكن ضبط الصور وضبطها بالطريقة التالية ، حرك موضع الكاميرا بحيث تغطي الصورة المرسلة نصف مجال رؤية الكاميرا. حرك الصورة المنعكسة لتغطية النصف الآخر من مجال الرؤية عن طريق ضبط المرآتين الأخيرتين في مسار الشعاع الخاص بها وتحسين التركيز البؤري عن طريق تحريك عدسة الترحيل الثانية لكل قناة ذهابا وإيابا على طول مسار الحزمة. اكتساب التي تعبر عن فلوروفور حساس للكالسيوم في الخلايا العصبية ذات الأهمية من المركز الوراثي Citis أو مصادر أخرى.
بدلا من ذلك ، قم ببناء معدلة وراثيا باستخدام تقنيات ختم elgan القياسية. ثم استخدم إحدى التقنيات التالية لتثبيت أناقة الختم للشلل الدوائي عند 0.05٪ ليال إلى 2٪ أروس وعمل ضمادات للتصوير عن طريق الضغط على قطرة من الآروس المنصهر بين شريحتين زجاجيتين تحتوي على قطعتين من شريط المختبر كفواصد. بعد إزالة الشريحة العلوية ، اختر خمسة إلى 10 وانقلها إلى الوسادة.
قم بتغطية الوسادة بزلة غطاء وقم بتطبيق كميات صغيرة من خليط ساخن واحد لواحد من شمع البارافين والفازلين على الزوايا لتثبيتها في موضعها. اترك خمس إلى 10 دقائق حتى يصبح الليميسول ساري المفعول وتصبح ساكنة تماما. لشل حركة باستخدام طريقة aros الصلبة ، اصنع 10٪ وسادات aros.
أضف حوالي ثلاثة ميكرولترات من محلول كري من البوليسترين من واحد إلى 10 إلى سطح الوسادات واختر بسرعة خمسة إلى 10 أناقة بحرية نظيفة في بركة محلول البنجر. قم بتغطيتها برفق بزلة غطاء وقم بتطبيق الشمع المنصهر على الزوايا. تتطلب التجارب النموذجية إدارة محفزات أو حالة معينة للحيوان أثناء تسجيل استجابة خلية عصبية واحدة بالفيديو.
للحصول على الفيديو. كثيرا ما نصور بمعدل إطار واحد في الثانية تقريبا مع حوالي 300 مللي ثانية من أوقات التعرض. يجب تحليل الفيديو لقياس شدة التألق لكل إطار داخل منطقة الاهتمام أو عائد الاستثمار للخلايا العصبية المصورة بالنسبة لمنطقة خلفية قريبة.
يعرض برنامج التحليل الخاص بنا صورة مضغوطة لجميع الصور في الفيلم يتم من خلالها تحديد حد تقريبي يشمل الكائن محل الاهتمام في جميع الإطارات يدويا وتحديد منطقة خلفية مستقلة. لأول مرة ، يتم تحديد عائد الاستثمار يدويا من داخل المنطقة الحدودية. لكل إطار لاحق ، يختار البرنامج ألمع وحدات البكسل من داخل المنطقة الحدودية لتوليد عائد استثمار بالحجم الصحيح للصور المترية للنسبة التي تم إنشاؤها باستخدام الحرباء ، وتحديد عائد استثمار تقريبي مماثل ومنطقة خلفية لكل صورة أو قنوات مزدوجة ، ثم عائد الاستثمار من صورة واحدة على الإطار الأول ، يتم حساب إشارة الفلورسنت F لكل رتل على أنه متوسط شدة البكسل في عائد الاستثمار مطروحا منه متوسط الشدة في منطقة الخلفية.
يتم حساب مستوى الكالسيوم النسبي لكل إطار كنسبة مئوية للتغير في الشدة التي يتم تطبيعها إلى قيمة خط الأساس الأولية المقاسة من الإطار الأول أو سلسلة من الإطارات. يتم حساب قيم مقياس النسبة كنسبة القناتين. يولد عائد الاستثمار المحدد داخل جسم الخلية أقوى الإشارات وأكثرها قوة ، ولكن من الممكن أيضا تحديد وقياس الإشارات من عائد الاستثمار على طول العمليات العصبية.
يمكن أن يتسبب التعرض لضوء الإثارة في تبييض النباتات الأربعة ويتميز بانخفاض مطرد في الإشارة التي تعتمد على مستويات التعرض في حالة حدوث التبييض. قلل أوقات التعريض الضوئي و / أو شدة الإثارة باستخدام مرشحات الكثافة المحايدة لتقليل الضوضاء الناتجة عن حركة أناقة البحر أثناء التسجيل. استجابة للتعرض للضوء والمحفزات التجريبية ، قم بتنفيذ إجراءات الشلل بعناية باستخدام مستحضرات نظيفة.
لتحليل الصور بنجاح ، اختر مناطق خلفية موحدة بشكل معقول أغمق من الصورة للخلايا العصبية وبعيدة بما يكفي لتجنب الضوء المتناثر. يظهر هنا أناقة C واحدة ، وهي خلية عصبية SJ تعبر عن معسكر G تستجيب لمجال كهربائي خارجي بثلاثة فولت لكل سنتيمتر لثلاث تجارب منفصلة تستمر كل منها لمدة 10 ثوان. تم تجميد باستخدام الكميزول ، لكن الفيديو يعرض أخطاء طفيفة في كل من الحركة والتركيز.
تم قياس شدة مضان الانجراف في جسم الخلية. الإشارة قوية على الرغم من أن أخطاء الفيديو تظهر زيادة كبيرة بنسبة 250٪ في التألق استجابة لكل من المحفزات الأولى والثالثة. يتم تقليل نتيجة المحفزات الثانية بشكل كبير.
إن إظهار التباين في تبييض الاستجابة العصبية ضئيل للغاية كما يتضح من العودة إلى مستوى خط الأساس الثابت. تؤدي الإصابة الخلوية الرضحية إلى ظهور كالسيوم كبير عابر داخل الخلايا العصبية التي تلعب دورا أساسيا في الاستجابة الفسيولوجية للخلية. يظهر هذا الفيديو الاستجابة الناجمة عن الضرر لإلقاء اللواط بالليزر لخلية عصبية واحدة.
تم استخدام بصريات التصوير المزدوج لتسجيل الإشارات من كل من قنوات التألق CFP و YFP لمراسل الحرباء. يوضح هذا الشكل إشارة الحنق الناتجة كما تم قياسها في جسم الخلية على مدار تجربة جراحة الليزر. استجابة لتلف الليزر وزيادة الكالسيوم السيتوبلازمي عند T يساوي صفر ثانية.
ينخفض CFP بسرعة ويزداد YFP مما يؤدي إلى زيادة فورية بحوالي 200٪ في إشارة متري النسبة ، والتي تستمر لمدة 90 ثانية تقريبا قبل أن تنخفض مرة أخرى إلى مستويات قريبة من خط الأساس. التبييض ضئيل كما يتضح من خط الأساس المتسق. يوضح هذا الشكل إشارة الحنق الناتجة كما تم قياسها في مقطع المحور العصبي بالقرب من نقطة القطع هنا.
تختلف الكمية المحلية من الفلورو أربعة على مدار التجربة. تؤدي جراحة الليزر المعقدة إلى قطع المحور العصبي وتمزق الغشاء لفترة وجيزة ، مما يسمح للفلورا الرابعة بالهروب وتقليل تركيزها السيتوبلازمي المحلي مؤقتا. يتضح هذا من الانخفاض الأولي في تتبع YFP في نقاط زمنية لاحقة.
تتضخم النهاية المقطوعة كجزء من تعافيها المستمر ، مما يؤدي إلى المزيد من الفلورو الرابع الموضعي وزيادة الكثافة. يتضح هذا بشكل أكبر في تتبع CFP المتزايد ببطء ، ومع ذلك ، فإن هذه الاختلافات تؤثر على كلتا القناتين بالتساوي وتعوض نسبة الحنق بشكل فعال عن إعطاء إشارة قوية. يظهر القياس الناتج استجابة مشابهة لجسم الخلية مع زيادة فورية تبلغ حوالي 150٪ في الإشارة ، وانتعاش دراماتيكي إلى ما يقرب من خط الأساس في حوالي 90 ثانية ، ثم استجابة ثانوية إضافية أصغر في حوالي 150 ثانية.
تتوفر مرفقات المجهر التجاري للتصوير المتري النسبي ، وكذلك برنامج تحليل الصور الأكثر تعقيدا الذي يولد قياسات مترية لنسبة البكسل بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنيات بسهولة نسبية وبدون تقنيات تشريح الأنسجة أو التصوير المعقد لتحضير العينة التي تتطلبها أنظمة أو طرق نموذجية أخرى. يمكن إجراء تجارب كاملة في غضون ساعة أو ساعتين إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية شل حركة أناقة التصوير ، وإجراء نسخ قصوى للفيديو على الخلايا العصبية الفردية في الجسم الحي ، وتحليل الفيديو الناتج لقياس مستويات الكالسيوم النسبية بناء على الخلايا العصبية.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تناقش هذه المقالة استخدام المؤشرات الكالسيومية الفلورية المشفرة وراثيًا لقياس ديناميكيات الكالسيوم في الخلايا العصبية الفردية لدود الحلقي C. elegans. تتيح التقنية التصوير في الجسم الحي للنشاط العصبي وعلم وظائف الأعضاء للكالسيوم في الخلايا استجابةً للمحفزات الحسية والتلف الخلوي.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا الخلية
- تقنيات التصوير
الخلفية
- C. elegans هو كائن حيوي نموذجي مثبت لدراسات الخلايا العصبية.
- يتميز بجسم شفاف وتشريح عصبي موثق جيدًا.
- تتيح التقنيات الوراثية التعبير المستهدف للمؤشرات الكالسيومية.
- يوفر التصوير في الجسم الحي رؤى حول وظيفة الخلايا العصبية وصحتها.
غرض الدراسة
- لقياس ديناميكيات الكالسيوم في الخلايا العصبية الفردية.
- لتحليل استجابات الخلايا العصبية للمحفزات الحسية.
- للتحقيق في الاستجابات الخلوية للتلف.
الطرق المستخدمة
- تركيب وتفكيك C. elegans التي تعبر عن الفلوروفورات الحساسة للكالسيوم.
- التصوير في الجسم الحي باستخدام التصوير المجهري بالفيديو وتقنيات الفلورة الجانبية.
- تحليل شدة الفلورة في مواقع عصبية محددة.
- مقارنة بين الفلوروفورين: GCaMP والفلوروفورات Chameleon القائمة على FRET.
النتائج الرئيسية
- قياس متين لنشاط الخلايا العصبية استجابةً للمحفزات.
- رؤى حول فسيولوجيا الكالسيوم أثناء التلف الخلوي.
- تبيان مزايا استخدام C. elegans للتصوير.
- البساطة التقنية وفعالية التكلفة للطريقة.
الاستنتاجات
- C. elegans هو نموذج قوي للتصوير العصبي في الجسم الحي.
- التقنية مرنة وقابلة للمعالجة وراثيًا.
- توفر بيانات قيّمة حول وظيفة الخلايا العصبية وصحتها.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
In vivo neuronal calcium imaging in C. elegans provides a cost-effective, genetically tractable system for early-stage target validation and mechanistic de-risking in neuroscience drug discovery. The transparent organism enables direct observation of neuronal activity and calcium physiology in response to stimuli, supporting predictive confidence in target engagement and pathway modulation. This approach reduces biological ambiguity in preclinical screening by linking molecular interventions to functional neuronal outputs in a whole-animal context.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by measuring neuronal calcium dynamics as a functional readout of target modulation in intact neural circuits.
- Operational Value: Supports biological de-risking through direct visualization of target engagement effects on neuronal physiology without invasive electrophysiology.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by providing quantitative, activity-based data on compound effects in a genetically defined neuronal system.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, reproducible fluorescence intensity and ratio metric outputs suitable for high-content screening of neuroactive compounds.
- Scalability: Immobilization and imaging protocols allow extended time-lapse acquisition, enabling dose-response and kinetic analysis in multi-well formats.
- Platform Reuse: Compatible with multiple genetically encoded indicators (GCaMP, cameleon) and stimuli paradigms, supporting assay adaptation across target classes.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models conserved neuronal injury and stress responses, enabling preclinical evaluation of neuroprotective or neuromodulatory agents.
- Translational Continuity: Calcium dynamics serve as a biomarker-aligned readout bridging discovery phenotypes to mechanistic pathways relevant to human neurodegeneration or hyperexcitability disorders.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables early detection of off-target neuronal effects or lack of pathway modulation, reducing late-stage attrition due to mechanistic failure.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows as a functional screening tool following target identification and preceding lead optimization, providing mechanistic insight before significant investment in medicinal chemistry.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by linking genetic or pharmacological perturbations to real-time neuronal activity changes in vivo.
- Screening: Delivers quantitative, normalized fluorescence readouts (ΔF/F or ratio metric) that enable comparison across conditions and compounds in a standardized format.
- Analytics: Provides ratiometric and single-channel intensity measurements that correct for expression variability and motion artifacts, enhancing data reliability for cross-functional interpretation.
- Translational Research: Connects to preclinical work through conserved calcium signaling pathways implicated in axonal injury, excitotoxicity, and sensory processing disorders.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for iterative target validation across neuroscience indications, leveraging standardized worm strains and immobilization techniques.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity through direct, whole-animal observation of neuronal calcium flux as a proximal biomarker of target engagement.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability via standardized immobilization (e.g., levamisole or agarose pads) and ratiometric imaging that minimizes artifacts from movement or expression drift.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision efficiency by delivering early functional data on neuronal phenotype modulation, decreasing reliance on surrogate assays with low translational fidelity.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization by identifying compounds that fail to modulate neuronal calcium dynamics despite target binding, redirecting resources to mechanistically validated candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in C. elegans handling, transgenic strain maintenance, and fluorescence microscopy for ratiometric or single-channel imaging.
- Dependent on access to fluorescence filter sets, dual-image optics for cameleon, and sensitivity-optimized cameras (e.g., cooled CCD) for low-light neuronal detection.
- Necessitates standardization of immobilization methods and ROI selection protocols across teams to ensure inter-lab comparability of calcium transient metrics.
- Adaptation considerations include promoter-driven expression specificity, indicator kinetics (e.g., GCaMP6f vs. GCaMP7), and stimulus delivery precision for reproducible neuronal activation.
- Practical limitations include potential photobleaching during prolonged acquisition and signal variability in neurites versus soma, which require background subtraction and ratiometric correction for accurate interpretation.
