عزل الكائنات الدقيقة في التربة الأصلية مع المحتملة لتحطيم القابلة للتحلل أفلام الجرثومة البلاستيكية المستخدمة في الزراعة

الهدف العام من التجربة التالية هو عزل فطريات التربة والبكتيريا التي تستعمر وتتحلل أغشية المهاد القابلة للتحلل. يتم تحقيق ذلك عن طريق احتضان أغشية المهاد القابلة للتحلل الحيوي أولا في أكياس شبكية في التربة لفترة كافية للسماح بالاستعمار الكبير من قبل ميكروبات التربة الأصلية. بعد الحضانة ، يتم استخراج المهاد وطلاءه بالتخفيف ، مما ينتج عنه مستعمرات معزولة مفردة من كل نوع قابل للزراعة من الميكروبات المرتبطة ارتباطا وثيقا.

ثم يتم ترقيع الميكروبات المعزولة على سطح جديد ، ومهاد موبوءة ، وقابل للتحلل ، وكذلك على ألواح أجار مع أو بدون مصدر كربون. من أجل مقارنة النمو ، يتم تأكيد النتائج بعد ذلك في وسط سائل. تظهر النتائج الاستعمار و / أو التدهور بواسطة بعض العزلات بناء على الفحص المجهري الإلكتروني الماسح ويمكن التحقق منه عن طريق كروماتوغرافيا نفاذية الهلام.

لا تنس أن العمل مع عزلات فطرية وبكتيرية مجهولة الهوية يمكن أن يكون خطيرا ، ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات أثناء تنفيذ هذا الإجراء مثل ارتداء القفازات وإغلاق أنابيب وأطباق الزراعة والعمل في خزانة السلامة البيولوجية. بعد احتضان قطع المهاد في التربة وإعداد الوسائط والكواشف وفقا لبروتوكول النص ، قم بتقطيع قطع نشارة جديدة إلى مربعات 4.25 سم لتطهير قطع المهاد. قم بتعقيمها إذا لم يغيرها أو يحطمها لقطع المهاد غير القابلة للتعقيم مثل تلك المصنوعة من البلاستيك.

بعد تحضير خزانة السلامة الحيوية وفقا للبروتوكول النصي ، ضع قطع النشارة في الغطاء النظيف في صفوف واحتضان قطع النشارة تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة ساعتين ، باستخدام ملقط نظيف معقم وابدأ بالصف الأمامي والعمل باتجاه الخلف لتجنب وضع اليدين والذراعين على الأسطح المطهرة حديثا. اقلب قطع النشارة ، ضع الجانب المصاب لأسفل على منطقة نظيفة ، معرضة للأشعة فوق البنفسجية ، ولكن لم يكن ملامسا للنشارة من قبل. بعد ساعتين من العلاج بالأشعة فوق البنفسجية على كل جانب ، مرة أخرى ، العمل من الأمام إلى الخلف.

استخدم ملقطا معقما لإزالة قطع النشارة من خزانة السلامة الحيوية ووضعها في حاويات معقمة وجافة مغطاة مثل الأكواب المغطاة بورق الألمنيوم. قم بتخزينها في درجة حرارة الغرفة في الظلام تحت غطاء نقل معقم. باستخدام تقنية معقمة ، ضع قطع المهاد الموبوءة بالأشعة فوق البنفسجية على سطح ألواح الأجار مع وضع زاوية واحدة أولا وبرفق ، مع ترك ما تبقى من المربع يتلامس مع الأجار.

بالنسبة للأغشية غير المنفذة للماء ، ضع أربع قطرات سعة 10 ميكرولتر من الوسط شبه الصلب المنصهر فوق زوايا قطع المهاد لتوفير مصدر للماء والمغذيات للاستعمار الأولي للبلاستيك الكارهة للماء. لا تلمس سطح قطع المهاد. باستخدام طرف الماصة ، سوف تتصلب القطرات إلى خرز.

احتضان الألواح المغطاة في وضع مستقيم طوال الليل في درجة حرارة الغرفة لتتجمد. ثم قم بتخزين جانب أجار الألواح في الظلام عند أربع درجات مئوية. تم الآن إعداد جميع المواد اللازمة للفحوصات الحيوية وأنت جاهز لبدء عزل الفطريات المهينة المحتملة من قطع المهاد التي تم دفنها في التربة.

احفر الأكياس الشبكية من التربة وقم بإزالة قطع المهاد من الأكياس الشبكية. استخدم ملعقة معقمة وملقط لإزالة التربة الزائدة برفق من المهاد دون إزعاج التربة التي تتشبث بالسطح. قطع فيلم BDM إلى قطع مربعة واحدة سنتيمتر مربع حتى يتم استرداد 0.5 جرام من المواد.

لكل نقل عينة مكرر ، 0.5 جرام من قطع المهاد والتربة المرفقة في 25 ملليلترا. تضيف أنابيب الاستزراع التي تحتوي على 9.5 مل من PBS 0.5 جرام من التربة إلى التربة فقط أنابيب التحكم أو إلى العينات التي يتحلل فيها المهاد تماما لتفكيك أي أغشية حيوية وفصل الخلايا عن قطع المهاد. دوامة الأنابيب لمدة 30 ثانية بسرعة عالية ، ثم صوتنة لها في حمام مائي لمدة 10 دقائق ودوامها مرة أخرى.

يجب أن ينتج عن هذا تعليق متجانس للخلايا الميكروبية التي كانت مرتبطة بقطع المهاد. للتخفيف التسلسلي للعينات. قم بإعداد أنبوب ثقافة واحد يحتوي على 4.5 مل من PBS المعقم واملأ ثلاثة آبار من صفيحة بئر عميقة ب 450 ميكرولتر من PBS لكل عينة من أنابيب التعليق الأصلية.

انقل 0.5 مل إلى 4.5 مل من PBS المعقم للحصول على 5.0 في 10 إلى التخفيف الثالث السالب بعد الدوامة بسرعة عالية لمدة 30 ثانية ، أضف 50 ميكرولتر إلى 450 ميكرولتر من PBS في مزيج لوحة البئر 96 عن طريق سحب العينات برفق لأعلى ولأسفل 10 مرات حتى تكتمل التخفيفات التي تصل إلى 5.0 في 10 إلى سالب ستة. استخدم قضبان زجاجية مثنية معقمة باللهب لتوزيع 100 ميكرولتر بالتساوي من كل من التخفيفات عبر سطح أجار ألواح القناة الشريانية السالكة التي تحتوي على الكلورامفينيكول لمنع نمو البكتيريا. قم بتخزين الأطباق في وضع مستقيم لمدة 30 دقيقة للسماح للسائل بالنقع.

ثم أغلق الألواح بالشكلي لتجنب هروب الجراثيم من عزلات مجهولة الهوية. احتضان الصفائح المقلوبة عند 20 درجة مئوية في الظلام لمدة خمسة أيام للسماح لكل من الفطريات سريعة النمو وبطيئة النمو بتكوين مستعمرات في خزانة السلامة الحيوية. افحص ألواح التخفيف بحثا عن مستعمرات مفردة معزولة باستخدام عود أسنان معقم واحد.

المس مستعمرة برفق ثم المس أجار الوسط الفطري الأدنى ، والوسط الفطري البسيط بالإضافة إلى البلاستيك والجلوكوز المتوسط الصغير في هذا الترتيب لتلقيح حبات الأجار فوق الأغشية البلاستيكية. افركي عود الأسنان برفق على سطح نقطة أجار ثم اسحبه عبر الفيلم البلاستيكي. كرر التلقيح من نفس مستعمرة المصدر حتى يكون هناك أربعة.

بتكرار الخطوط على كل لوحة بعد احتضان الألواح عند 20 درجة مئوية في الظلام لمدة خمسة أيام. قارن الألواح لتحديد العزلات التي تنمو على قطع المهاد بشكل أفضل مما تنمو على الحد الأدنى من الوسط الذي لا يحتوي على كربون مضاف بخلاف أجار. هذه هي متحللات المهاد المحتملة.

يجب أن تحتوي لوحة GMM على أكبر قدر من النمو لأنها لوحة تحكم إيجابية يحتوي فيها الوسط على الجلوكوز. قد لا تكون عزلات التربة نقية تماما في هذه المرحلة ، لذا استخدم عود أسنان معقم لكشط اللقاح من الفطريات ، واستعمار المهاد وخطه للعزل على أجار سكر العنب للبطاطس ، ثم أغلق الطبق واحتضانه لمدة خمسة أيام. بعد الحضانة لمدة خمسة أيام ، ستظهر مستعمرات معزولة واحدة.

تأكد من أن هذه المستعمرات المنقاة الجديدة تظهر استعمار نشارة في الاختبار الحيوي للصفيحة على غرار ذلك ، الذي لوحظ مع العزلات الأصلية التي يحتمل أن تكون غير نقية. بمجرد تحديد متحللات المهاد المحتملة بواسطة المقايسة الحيوية للوحة ، تحقق من استخدام المقايسة الحيوية السائلة في هذا الاختبار التأكيدي النهائي ، حتى أجار يفتقر إلى المهاد. القطع هي حقا مصدر الكربون الوحيد للنمو الميكروبي في هذا الوسط المعد بدقة لبدء الفحص عند قطعة نشارة موبوءة بالسطح إلى وسط فطري يفتقر إلى أي كربون مضاف آخر لكل تكرار من العزلة الميكروبية.

تحضير ثلاثة أنابيب للتلقيح. أحدهما ، أنبوب تجريبي يحتوي على خمسة ملليلتر من الحد الأدنى من الوسط المسمى هنا FMM يحتوي على قطعة نشارة بالحجم المحدد مسبقا. ثانيا ، تحكم سلبي بخمسة ملليلتر من الحد الأدنى من المتوسط بدون مصدر كربون.

وثالثا، تحكم إيجابي بخمسة ملليلتر من الجلوكوز المحتوي على سائل. هنا المسمى GMM. بالإضافة إلى ذلك ، قم بإعداد أنبوب مكرر من الحد الأدنى من الوسط يحتوي على كل نشارة ليتم اختبارها ، ولكن لا تقم بتلقيحها.

سيكشف أنبوب التحكم هذا عن أي نمو ميكروبي ناتج عن التلوث بعد نمو وجمع الجراثيم الطازجة. وفقا لبروتوكول النص ، في غطاء نقل معقم ، قم بتلقيح أنابيب الثقافة المعدة مسبقا بمليون جراثيم أو خلية خميرة ، وأغلق الأغطية واحتضانها في الظلام دون اهتزاز عند 20 درجة مئوية. راقب العينات أسبوعيا للنمو.

قد يكون النمو الفطري للفطريات على قطع المهاد مرئيا خلال الأسبوع الأول بعد التلقيح ، خاصة عند حواف قطع المهاد لمراقبة الخميرة العوالق نمو عن طريق قراءات الكثافة الضوئية عند 600 نانومتر لأن الفطريات الخيطية من المحتمل أن تلتصق مباشرة بقطع المهاد. تقييم النمو بالعين وتأكيده عن طريق المجهر الضوئي و / أو الفحص المجهري الإلكتروني المسح الضوئي في الحد الأدنى من الضوابط المتوسطة فقط. ابحث عن مرونة بيضاء صغيرة جدا بحيث لا يمكن تسجيل تغيير في الكثافة البصرية.

باستخدام طرق القياس الضوئي الطيفي. استخدم ماصة لصق لشفط المرن ومراقبته باستخدام التداخل التفاضلي. الفحص المجهري على النقيض بعد عزل ثلاث عزلات محتملة مهينة للنشارة في الاختبار الحيوي للوحة من كل من نشارة السليلوزية تسمى حارس الحشائش بالإضافة إلى ذلك والتي كانت سيطرتنا الإيجابية ونشارة بلاستيكية قائمة على النشا تسمى Biore.

تم احتضانها في المقايسة الحيوية السائلة لمدة 68 يوما وحصادها قبل إخضاعها للفحص المجهري الإلكتروني الماسح. كما هو متوقع. لوحظ وجود hyphy فطري في جميع العينات باستثناء XX و YY حيث لوحظت خلايا على شكل قضيب للعزلات الموجودة على نشارة التحكم في السليلوز.

لم يلاحظ أي نمو في ضوابط FMM فقط كما هو موضح هنا في الضوابط الملقحة للأمم المتحدة لواقي الحشائش بالإضافة إلى عناصر القصبة الهوائية المتبقية من المهاد للألياف المشتقة من النبات لم يكن من الممكن اكتشافها إلا كعلامات طفيفة للثقب شوهدت في صفوف على بعض الألياف ، على الرغم من ملاحظة الغطاء الفطري في جميع العينات الثلاث الملقحة من نشارة التحكم في السليلوز. كانت عناصر القصبة الهوائية مرئية بوضوح فقط في عينات SS مما يشير إلى أن هضم المواد السليلوزية كشف عن عناصر القصبة الهوائية الخشنة الموجودة أسفل SS المعزول تم تحديدها مبدئيا باستخدام 18 ثانية ريبوسومية ، الحمض النووي كصودا داخل المشروبات الغازية للنشارة البلاستيكية القائمة على النشا. لم يلاحظ نمو كبير في العزلات الدنيا للوسط ، فقط الضوابط ، والمواصفات البيضاء المفردة المرئية عند الدوران في أنابيب استزراع العزلات ، ولوحظ VV و ZZ باستخدام الفحص المجهري لتباين التداخل التفاضلي لعزل vv.

كانت المواصفات عبارة عن كتلة بوغية ، يفترض أنها متبقية من التلقيح الأولي. لعزل zz. كانت الكتلة تتكون من شبكة فضفاضة من hyphy ، يبلغ قطرها حوالي 0.2 ملم ، مما يشير إلى أن لقاح البوغ الأصلي قد نبتت ولكنها لم تنمو إلى ما وراء الكتلة الموضحة هنا.

كما هو موضح هنا في الضوابط الملقحة للأمم المتحدة للنشارة البلاستيكية القائمة على النشا ، لوحظ وجود نسيج وعرة. هوية الملامح البيضاء غير معروفة ، لكنها غائبة في فيلم استعمره معزول VV الموضح هنا. اختفت كل من الجسيمات البيضاء والنتوءات في فيلم مستعمر بواسطة zz المعزول.

بالإضافة إلى ذلك ، أظهرت العينة الأخيرة حدوث شقوق منتظمة عبر عزلات سطح BDM. تم تحديد VV و ZZ مبدئيا باستخدام الحمض النووي الريبوزومي في s مثل Penicillium و ACE ضمن ترتيب hypo على التوالي. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة حول التحلل البيولوجي للنشارة البلاستيكية للصناعة الزراعية ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على أي بلاستيك آخر يكون تحلله البيولوجي في البيئة موضع تساؤل.

على سبيل المثال ، البلاستيك الذي قد ينتهي به المطاف في البيئة البحرية. هل تستخدم تلك في صناعة المواد الغذائية؟ أنا.