وهناك طريقة للماوس البنكرياس جزيرة العزلة وبين الخلايا المخيم تقدير

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل جزر لانجرهانز السليمة لقياس الاختلافات في إنتاج cyclic A MP استجابةً لمعالجات تجريبية مختلفة. يتم تحقيق ذلك عن طريق نفخ البنكرياس أولاً ثم إزالته في الخطوة الثانية. وتُعزل جزر لانجرهانز السليمة من خلال سلسلة من عمليات الطرد المركزي والغسيل.

بعد ذلك، يتم التقاط العيينات الحيوية ووضعها في وسط استزراع جزر جديد، وتُترك لتحضن طوال الليل. وفي الخطوة النهائية، تُعرض العينات للمعالجات التجريبية المطلوبة ويتم إجراء مقايسة لـ cyclic AMP. وفي النهاية، يُستخدم المقايسة المناعية الإنزيمية لقياس التغيرات في إنتاج cyclic AMP استجابةً للمعالجات المختلفة المطبقة على العينات.

بشكل عام، قد يواجه الأشخاص الجدد في هذه الطريقة صعوبة لأن تحقيق نفخ كامل للبنكرياس يتطلب الكثير من الممارسة. أولاً، قم بتعبئة محقنة وكانيولا بخمسة milliliters من محلول collagenase. ثم ثبّت إبرة غير مدببة بمقاس 30 gauge على الكانيولا وضع المحقنة والكانيولا على الثلج.

بعد تحريك الأمعاء الدقيقة إلى الجانب الأيمن من الفأر، حدد موقع عضلة أودي العاصرة، والتي تقع في نهاية القناة الصفراوية المشتركة وتتفرع فوق الأمعاء الدقيقة لتشكل مثلثاً أبيض اللون. وبمجرد تحديد موقع العضلة العاصرة، استخدم ملقط ديمونت (Dumont) رقم 5 ومرر طرفه أسفل القناة الصفراوية المشتركة في أقرب نقطة ممكنة من الأمعاء الدقيقة، مع الحرص على عدم ثقب القناة.

بعد الثقب عبر الأمعاء الدقيقة والأنسجة الضامة، استخدم طرف ملقط dumont للإمساك بالخيط الجراحي وسحبه أسفل القناة الصفراوية المشتركة. اربط القناة الصفراوية المشتركة في أقرب نقطة ممكنة من sphincter of OD، مع التأكد من إحكام العقدة لمنع التسرب. بعد ذلك، أمسك بطرفي الخيط الجراحي واسحبهما باتجاه الذيل لإحداث بعض الشد على القناة الصفراوية المشتركة.

بعد ذلك، وبيد حرة، قم بإجراء شق صغير باستخدام مقص دقيق في القناة الصفراوية المشتركة فوق التشعب الأخير المؤدي إلى الكبد مباشرةً، مع إبقاء طرفي الخيط مشدودين لضمان شد القناة الصفراوية المشتركة. أخرج المحقنة والقنية من وعاء الثلج. ضع المحقنة جانباً وأدخل الإبرة ذات القياس 30 gauge والمجهزة بطرف غير مدبب في الشق.

القناة الصفراوية المشتركة. مع الحرص على عدم ثقب جدار القناة. ويعد تحقيق نفخ كامل للبنكرياس الجزء الأكثر صعوبة.

نستخدم إبرة توفر إحكاماً جيداً. إذا لم توفر الإبرة الأولى إحكاماً جيداً، فاستخدم إبرة أكبر، مثل إبرة مقاس 27 gauge. الآن، اضغط على مكبس المحقنة ببطء لتفريغ الضغط بشكل نبضي حتى ينتفخ الجزء الأول من البنكرياس.

اتبع ذلك بتطبيق ضغط ثابت وخفيف حتى لا يعود البنكرياس قابلاً للانتفاخ. في حالة النفخ الناجح، يتوزع النسيج الإفرازي بشكل متساوٍ، ويكون جزء البنكرياس الموجود فوق المعدة منتفخاً. لإزالة البنكرياس، استخدم ملقطاً في إحدى اليدين للإمساك بالأمعاء الدقيقة عند sphincter of od.

وباستخدام اليد الأخرى، أدخل الطرف المغلق لمقص منحني لفصل جزء من البنكرياس عن الأمعاء الدقيقة. حرك الطرف لأسفل الأمعاء الدقيقة وصولاً إلى النسيج الضام الوردي. ثم ارفع الأمعاء الدقيقة بالقرب من نقطة اتصالها بالمعدة واقطع البنكرياس بعيداً عن بقية الأمعاء الدقيقة.

أمسك أكبر قدر ممكن من البنكرياس وارفعه برفق. وباستخدام المقص المنحني، اقطع الروابط المتبقية بين البنكرياس والتجويف الصدري.

لإزالة البنكرياس بالكامل، يُحفظ كل بنكرياس مستأصل في حوالي 2.5 milliliters من محلول الكولاجيناز. تُستخدم أنابيب مخروطية سعة 50 milliliter فردية على الثلج لغسل البنكرياسات. أولاً، يُنقل كل بنكرياس إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 50 milliliter يحتوي على 25 milliliters من الكولاجيناز.

بعد ذلك، ضع أنابيب مخروطية سعة 50 milliliter تحتوي على البنكرياس بشكل رأسي في حمام مائي هزاز عند درجة حرارة 37 degrees Celsius، قادر على التذبذب بسرعة 220 إلى 250 RPM مع إيقاف تشغيل الهزاز. والآن، قم بتعريض كل أنبوب مخروطي سعة 50 milliliter لتدفق غاز مكون من 95% oxygen و 5% carbon dioxide لمدة خمس دقائق.

باستخدام ماصة باستور، أحكم إغلاق كل أنبوب وضع الأنابيب بشكل أفقي في حمام مائي هزاز تحت سطح الماء. بدءًا من الدقيقة السادسة، هز الأنابيب بسرعة تتراوح بين 220 و250 RPM لمدة 20 ثانية كل دقيقة بديلة لمدة تصل إلى 16 دقيقة. بعد الهز، قم بتدوير الأنابيب بقوة 400 إلى 500 Gs في درجة حرارة الغرفة، مع إيقاف تشغيل جهاز الطرد المركزي فور وصوله إلى السرعة القصوى.

بعد ذلك، ودون تحريك الراسب، استخدم مصيدة تفريغ لسحب حوالي 22.5 milliliters من محلول collagenase من كل أنبوب. ثم أعد تعليق الرواسب في 12.5 milliliter من HBSS وقم برج الأنابيب باستخدام جهاز vortex برفق لتفتيت الرواسب. بعد غسل الخلايا ورجها بمزيد من HBSS، صب كل معلق خلوي عبر مصفاة بمسام 1000 micron في أنابيب مخروطية جديدة سعة 50 milliliter.

بعد ذلك، وبعد عملية الطرد المركزي لمعلقات الخلايا مرة أخرى، استخدم مصيدة تفريغ لسحب كل محلول HBSS بعناية دون تعكير الراسب. وبمجرد إزالة كل محلول HBSS، أضف 4.8 milliliters من محلول 25%F إلى كل أنبوب. وبعد استخدام جهاز الرج (vortex) لتفتيت الراسب، وزع بعناية 2.4 milliliters من محلول 23%20.5%and 11%fial على طول جانب الأنبوب المخروطي سعة 50 milliliter مع تدويره.

لضمان تدرج الطبقات بشكل متجانس بعد طرد محلول استدعاء FI مركزياً، صب كل محلول استدعاء FI في أنبوب مخروطي جديد سعة 50 milliliter، مع الحرص على ترك كتلة النسيج الإفرازي في القاع. أضف محلول HBSS مبرداً بالثلج إلى الأنبوب الجديد حتى علامة 50 milliliter. بعد ذلك، أغلق الأنبوب واقلبه من أربع إلى ست مرات.

لمزج نداء FI مع HBSS معاً. استخدم مصيدة التفريغ لسحب معظم خليط قارورة HBSS بعناية دون تحريك الراسبة السائبة. ثم انقل الراسبة إلى أنبوب جديد.

استخدم ماصة باستير لنقل العيينات إلى طبق بتري يحتوي على وسط زراعة العيينات، مع الحرص على تجنب نقل حطام أنسجة ASIN art. ضع طبق بتري تحت مجهر تشريحي مزود بإضاءة خلفية.

ستكون العيون الصحية كروية الشكل ولها مركز يتراوح لونه من البني الذهبي إلى البني الداكن. ولا ينبغي استخدام أي عيون متصلة بـ ASIN أو بالأنسجة، والتي ستظهر باهتة ورمادية اللون، بل يجب التخلص منها. علاوة على ذلك، يجب التخلص من العيون الأكبر حجماً التي يتطور فيها مركز نخر داكن بعد التحضين طوال الليل لأنها لا تعمل بشكل صحيح.

إذا كانت تحضيرات العيينة تحتوي على كمية كبيرة من الحطام، قم بنقل العينات يدوياً مرتين إلى وسط غذائي جديد، وأضف DNA إلى محلول الهضم للمساعدة في الحد من تكتل العينات. ابدأ هذه الخطوة بتحريك العينات بشكل دائري نحو منتصف طبق بيتري. باستخدام ماصة P 20، انقل العينات إلى طبق بيتري جديد من البوليسترين بمقاس 15 مليمتر في 60 مليمتر يحتوي على 5 مل من محلول ما قبل التحضين لغسل الوسط الزرعي المحتوي على الجلوكوز من العينات.

بعد ذلك، استخدم الماصة P 20 لنقل ما لا يقل عن 13 حلقة من حلقات العين إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة منفصلة تحتوي على 1 milliliter من محلول كرِبْس رينجر بيكربونات المنظم المشبع حديثاً بالغاز، مع الحفاظ على اتساق حجم الحلقات بين الأنابيب. وبعد تحضين العينات عند 37 °C و 5%CO2 لمدة 45 دقيقة، قم بتغطية أنابيب الطرد المركزي بسرعة، ثم رجها بجهاز vortex، ثم قم بتدويرها في جهاز طرد مركزي مكتبي في درجة حرارة الغرفة بسرعة تصل إلى 7,000 إلى 7,500 Gs. وإذا كان الإنسولين أو أي مستخلص أيضي آخر مطلوباً لتطبيقات لاحقة، فاستخدم الماصة P 1000 لجمع جزء من الوسط في أنبوب طرد مركزي دقيق. أما إذا لم يكن هناك حاجة لجمع أوساط التحفيز، فيمكن التخلص منها.

استخدم ماصة P 1000 لإزالة معظم محلول Krebs من كل أنبوب طرد مركزي دقيق، مع ترك حوالي 10 إلى 15 µL من محلول Krebs فوق كتلة العينية. بعد ذلك، استخدم ماصة P 20 لإزالة الجزء الأقرب إلى الكتلة. وأخيرًا، بمجرد أن يتبقى أقل من 10 إلى 15 µL من محلول Krebs على العينية، قم بتجميد كتل العينية تجميدًا سريعًا في النيتروجين السائل.

ثم تُخزن الكريات المجمدة سريعاً عند درجة حرارة 80- درجة مئوية حتى يتم قياس cAMP الدوري. وعادةً ما يرتبط تأثير أي عامل على إنتاج cAMP الدوري ارتباطاً مباشراً بتأثيره على إفراز الإنسولين. في هذه التجربة، تم تحفيز جزر لانجرهانز المعزولة من فئران من النوع البري (Wildtype) أو فئران مُعطلة جينياً باستخدام 11.1 millimolar من الجلوكوز وقياس cAMP داخل الخلايا.

تم قياس إنتاج cyclic AMP ومعايرته بالنسبة لإجمالي البروتين الخلوي. كما تم قياس الإنسولين المفرز باستخدام مقايسة ELISA قياسية للإنسولين، ومعايرته أيضاً بالنسبة لإجمالي البروتين الخلوي. وكما كان متوقعاً، ارتبط التغير في إنتاج cyclic AMP ارتباطاً مباشراً بالزيادة في إفراز الإنسولين المحفز بالجلوكوز.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون قادرًا على عزل واستزراع وقياس مستويات cyclic a و p في عيون الفئران السليمة.