تحليل الكمي متعددة الأطياف وبعد زرع الأنسجة نيون لتصور أصول الخليوي، وأنواع، والتفاعلات

الهدف من الإجراء التالي هو استخدام الاستجواب متعدد الأطياف للتركيبات الخلوية متعددة الإرسال أو التقليد لتحديد مساهمات مختلف السكان المقيمين في نخاع العظم في تطور سدى الأورام. يتم تحقيق ذلك عن طريق زرع فأر متلقي معدلة وراثيا يسمى GFP أولا مع RFP يعبر عن الخلايا الجذعية لنخاع العظم. في الخطوة الثانية ، يتم حقن الخلايا السرطانية ذات الأهمية في نفس المتلقي ثم بعد النقش ، يتم تقطيع الورم المكتوم ، وتضمينه في البارافين وتمييزه بالأجسام المضادة المناعية الفلورية.

بعد ذلك ، يتم إنشاء مكتبة طيفية لجميع الأطوال الموجية المستخدمة للحصول على صور لأقسام الورم بمجرد اكتمال المكتبة الطيفية. يتم تصوير الشرائح في الخطوة الأخيرة ، ويتم إجراء تحليل البيانات للسماح بتحديد وربط أنماط تلطيخ العلامات الخلوية ذات الأهمية. في النهاية ، يمكن تحديد الكيانات الخلوية الجديدة أو الأنماط الظاهرية بناء على وضع العلامات المتعددة للعلامات خارج الخلية والخلوية لفهم تكوين الأنسجة المعقدة بشكل أفضل مثل البيئة المكروية للورم.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على تقنيات التألق المناعي القياسية هي أن التحليل متعدد الأطياف يسمح لك بمضاعفة سبعة أو أكثر من الفلورو الأربعة على نفس الشريحة ، مما يسمح باستجواب أكثر دقة وتفصيلا للتركيب الخلوي للبيئة المكروية للورم أو الأنسجة المتجددة. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لأصل وتكوين البيئة المكروية للورم ، إلا أنه يمكن تطبيقها على أنظمة أخرى مثل الطب التجديدي والبيولوجيا التنموية والبيولوجيا المناعية. يوضح هذا الإجراء جنبا إلى جنب مع Dr.Spa كريس بوث ، مساعد باحث في مختبري بسبب قيود IU Cook في هذه المؤسسة ، سنناقش ولكن لن نظهر أي تلاعب مباشر بالفئران على الفئران.

يمكن العثور على إجراءات نخاع العظم هذه وتقنيات نقش الورم لدينا في عملنا السابق ، مثل الخلايا الجذعية للأطفال وغيرها. 2009 للبدء بعد عزل خلايا نخاع العظم عن الأطراف الخلفية المتطابقة ، يقوم النسخ بتعليق الخلايا عند 2 مليون خلية لكل 100 ميكرولتر من PBS لكل فأر. استخدم مصباحا حراريا لتوسيع أوعية ماوس GFP المتلقي للإشعاع وضع الماوس في تقييد حقن وريد الذيل.

باستخدام جانب شطبة إبرة قياس 29 لأعلى ، قم بحقن معلقات الخلية بشكل منهجي في الذيل أو الوريد خلف الحجاج. استخدم شاشا معقما لتطبيق ضغط خفيف على الذيل بعد الحقن. حقن فأر واحد ب 100 ميكرولتر PBS فقط للتحكم في النقش في يوم الحقن.

أعد تعليق الخلايا السرطانية ذات الأهمية في PBS عند 1 مليون خلية لكل 100 ميكرولتر. بعد تعقيم البطن بنسبة 70٪ من الإيثانول. استخدم إحدى يديك لكبح جماح الفأر من خلال قفص الرقبة والذيل ، ثم باليد الأخرى ، أمسك جانب الإبرة المائل لأعلى وحقن الخلايا السرطانية في التجويف بين الصفاق للفأر المتلقي.

بعد 15 إلى 30 يوما ، قتل الفئران واستئصال الورم من بطنها. ثم قم بإصلاح الأورام في فورمين 10٪ لمدة 24 ساعة. ثم قم بتقسيم الأنسجة الثابتة إلى شرائح من خمس إلى 10 ميكرومتر لإجراءات التلوين اللاحقة.

بعد تثبيت أقسام الأنسجة في البارافين ، اخبز العينات لمدة ساعة واحدة عند 56 درجة مئوية. ثم اغسل الشرائح وفقا للتسلسل التالي بعد آخر غسل للإيثانول ، اشطف الشرائح بالماء لمدة دقيقتين. غمر ببطء ورفع رف التلوين داخل وخارج الماء 10 مرات.

بعد ذلك ، ضع مخزن سترات الصوديوم في الميكروويف للتسخين. بعد غلي الشرائح لمدة 20 دقيقة في مخزن سترات الصوديوم ، اترك العينات تبرد في المخزن المؤقت لمدة 30 دقيقة. ثم اغسلها بالماء المتأين لمدة خمس دقائق أخرى.

ثم اضغط على الشريحة للسماح لأي قطرات كبيرة من الماء بالتدحرج ، وتوخي الحذر حتى لا تجفف قسم المناديل. استخدم قلما حاجزا مسعورا لتمييز الأقسام حول أقسام الورم ثم ضع على الفور حاجزا حاجب على العينة لمنع جفاف قسم الأنسجة. بعد ساعة ، احتضان الشرائح بالجسم المضاد الأساسي محل الاهتمام في صندوق غرفة الرطوبة على شاكر بطيء الدوران عند أربع درجات بين عشية وضحاها.

في صباح اليوم التالي ، اغسل الشرائح مرتين في PBST لمدة 10 دقائق في كل مرة مع رج لطيف أثناء غسل الأقسام. تمييع الأجسام المضادة الثانوية عند واحد إلى 1000 جسم مضاد لنسبة المخزن المؤقت المنع. ثم احتضان الأقسام في الأجسام المضادة الثانوية المناسبة في صندوق غرفة الرطوبة المغطى بورق الألمنيوم على شاكر دوار بطيء في درجة حرارة الغرفة بعد ساعتين.

اغسل الشرائح مرتين في PBST لمدة خمس دقائق مع رج لطيف واحميها من الضوء. ثم قم بتلطيخ الشريحة الرقيقة فقط وتنزلق التحليل باستخدام DPI لمدة دقيقة واحدة ، مع إبقاء الشرائح مغطاة أثناء الحضانة. ضع زلة غطاء فوق كل عينة ، وأغلق حواف كل زلة غطاء باستخدام مقوي الأظافر.

الآن لإجراء التصوير متعدد الأطياف ، استخدم هدفا زيتيا لالتقاط صورة أولية لشريحة التحليل للحصول على أوقات التعرض المناسبة لكل نطاق من النطاقات الطيفية في المكتبة الطيفية. على سبيل المثال ، يوضح هذا الجدول بروتوكولات المكتبة الطيفية المقترحة بناء على عدد الطوابق الأربعة المستخدمة في التجربة. ثم قم بتصوير الشريحة غير الملوثة لشريحة الخلفية في المكتبة الطيفية لهذه التجربة.

الصورة التالية ، الشريحة غير الملوثة لتحقيق صورة الخلفية للمكتبة الطيفية. الآن قم بتصوير كل شريحة ملونة بأربعة شرائح ملونة بطابق واحد ، مع حفظ الصور تحت اسم الجسم المضاد الثانوي المستخدم لكل شريحة. بمجرد اكتمال المكتبة المشتبه بها ، اجمع صورا للمناطق ذات الأهمية على شريحة التحليل لتحليل صور أنسجة الورم.

أولا ، قم باستيراد تشكيلة تمثيلية من الصور الدقيقة المكتسبة باستخدام برنامج إعلام. ثم افتح المكتبة الطيفية الآمنة وفقا لتوجيهات البرنامج. بعد ذلك ، حدد مناطق الأنسجة ذات الأهمية المراد تحليلها.

تحديد الخلايا الفردية بناء على تلطيخ DAPI. سيتم تحديد السيتوبلازم تلقائيا بناء على شكل النواة. اختر الآن قراءة شدة الفلورسنت المفضلة لكل معلمة فلورية ، ثم قم بمطابقة الصور المكتسبة ، مما يسمح للبرنامج بمعالجة البيانات باستخدام الخوارزمية المقترحة.

عند الانتهاء من معالجة الصورة ، ادمج الملفات الناتجة. بعد ذلك ، باستخدام تقنية التصوير متعددة الأطياف هذه لتحليل الأورام ورسم بياني لها في نموذج فأر زرع نخاع العظم المعدل وراثيا ، تم تمييز مكونات الورم اللحمي ذات الأصل نخاع العظم عن طريق قياس التدفق الخلوي بعد ثلاثة أسابيع من زرع نخاع العظم. ثم بعد ستة أسابيع من أقسام الحقن الأولية من أورام المبيض المحقونة غير المسماة ، تم تحليلها بعد إنشاء مكتبة طيفية مع شرائح تحكم أحادية اللون ، وتم تحليل صور قسم ورم المبيض الملطخ ب GFP DPI وعلامتين أخريين.

الممكن إضافة المزيد من العلامات. على سبيل المثال ، هنا ، يتم عرض المكتبة الطيفية والصورة المصاحبة لقسم الورم مع ست علامات بالإضافة إلى بقعة نووية باستخدام البرنامج المستنير. يمكن تصنيف مناطق الأنسجة ذات الأهمية داخل قسم الورم كما هو موضح في الصور التمثيلية الموضحة هنا.

على سبيل المثال ، توضح هذه الصورة تصنيف أجزاء الأنسجة متبوعا بتجزئة الخلايا. بناء على وصمة عار نووية نقطة في البوصة. يمكن بعد ذلك قياس كمية ملصقات الفلورسنت في النواة والسيتوبلازم لكل خلية وتصديرها لمزيد من التحليل.

خوارزمية تجزئة الأنسجة قادرة على تحديد الأنواع الفرعية للأنسجة بناء على بنية الأنسجة وليس فقط على تحديد الفلوروكروم ، مما يوفر أداة تحليلية أكثر قوة لتصنيف التلوين إلى مناطق مميزة من الأنسجة. في هذه الصورة ، تم تدريب الكمبيوتر على تحديد خمس مناطق فرعية بناء على الأنماط المعمارية داخل الأنسجة. يتم تحديد الخلفية بمساحة فارغة.

يتم تعريف الورم الانحلالي من خلال وفرة خلايا الدم الحمراء داخل الأنسجة. يتم تعريف الورم بواسطة الخلايا المكتظة بالسكان. يتم تعريف الدهون من خلال المقصورات الخلوية الفارغة الكبيرة المتماثلة والعضلات المحددة بنمط مخطط.

باستخدام هذه الطريقة ، يمكن تحليل مجموعة الخلايا الموجبة المزدوجة بناء على عتبة شدة الفلورسنت المحددة. على سبيل المثال ، بالنسبة للخلايا الإيجابية للأكتين في العضلات الملساء والخلايا الموجبة للعضلات الملساء ألفا ، كما هو موضح هنا للكشف الطيفي الإضافي الذي يتجاوز أربعة ألوان ، يرجى الاطلاع على مستندات النصائح والحيل المرتبطة لتعدد إرسال خمسة مجسات أو أكثر. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن جودة الصور تعتمد بشكل كبير على شرائح التحكم في اللون الفردي المناسبة المستخدمة.

بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل التهجين الفلوري في الموقع من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل المقصورات الخلوية وأنسجة البيئة الدقيقة للورم. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لتقنية المحاكاة الخاصة بنا ، والاستجواب متعدد الأطياف للمكونات متعددة الخلايا ، وعند الانتهاء من ذلك ، يجب أن يكون لديك فهم شامل لكيفية تحديد أهداف خلوية متعددة في شريحة واحدة. كيفية حساب Unix تلك الأهداف الخلوية والحصول على فهم جيد لتطور سدى الورم أو الأنسجة المتجددة ، أو الأنسجة التي تهمك.