تصميم مفاعل حيوي ذو محورين الميكانيكية جار للهندسة الأنسجة

الهدف العام من التجربة التالية هو تصنيع مركبات حيوية وظيفية مهندسة أنسجياً لغرض الزرع. ويتم تحقيق ذلك من خلال تطبيق إجهاد ميكانيكي دقيق أحادي المحور أو ثنائي المحور لتوفير محفزات بيوفيزيائية للخلايا داخل مركبات مواد حيوية ثلاثية الأبعاد. وفي خطوة ثانية، يتم تجهيز المفاعل الحيوي بخلية تحميل، والتي توفر تغذية راجعة للقوة واختباراً ميكانيكياً للمركبات الحيوية أثناء عملية التحميل.

تُزرع المركبات الحيوية التالية على مدى عدة أسابيع من أجل تحفيز تغيرات واسعة النطاق في المحتوى الكيميائي الحيوي للبنية، وتُظهر النتائج التي تم الحصول عليها تأثير أنواع التحميل المختلفة بناءً على الفروقات الجوهرية في محتوى الجليكوزامينوجليكان والكولاجين، وسماكة السقالة، ومعامل الاتزان. ورغم أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤية حول تأثيرات التحميل ثنائي المحور على نسيج الغضروف الهندسي، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً على الأنسجة الأخرى ذات التحمل المنخفض مثل العظام والأوتار؛ وسيقوم إيمي ماي وروب ستيفاني من مختبرنا باستعراض هذا الإجراء. لبدء هذا الإجراء، قم بإعداد مفاعل حيوي ثنائي المحور كما هو موضح هنا.

تتكون قاعدة المفاعل الحيوي من لوح ألومنيوم تبلغ أبعاده 25 سنتيمتر في 30 سنتيمتر في 12.5 مليمتر. وتتيح خيارات تحديد المواقع المتغيرة المتاحة إمكانية تثبيت مرنة لأطباق زراعة الأنسجة بمختلف أشكالها وأحجامها. بعد ذلك، تأكد من تركيب المنصات على القاعدة بحيث توفر المنصة الأفقية قصاً ديناميكياً عن طريق التذبذب على طول المحور x فقط.

وتوفر المنصة الرأسية ضغطاً ديناميكياً من خلال التذبذب على طول المحور Z فقط. الخطوة التالية هي تصنيع لوحة تحميل مخصصة من مادة البولي سلفون. وتعد مادة البولي سلفون مثالية نظراً لتوافقه الحيوي، وسهولة تشغيله آلياً، وسهولة تعقيمه.

قم بربط اللوحة بمنصة الحركة ثنائية المحور عبر كتيفة زاوية قائمة مصنعة بدقة. تحتوي المصدات الكينماتيكية المثبتة في لوحة القاعدة على براغي ضبط دقيقة للسماح بمحاذاة دقيقة لأطباق الزرع لا يمكن تحقيقها يدويًا. بعد ذلك، قم بتوصيل مشغل المحرك الخطوي بكل منصة، والذي سيوفر التغذية الراجعة الموضعية للبرنامج.

تتميز مشغلات المحرك الخطوي الموضحة هنا بقابلية تكرار ثنائية الاتجاه تبلغ 0.1 micrometer ودقة تصل إلى 20 nanometers، مما يترجم إلى دقة تقل عن ثلاثة micrometers عبر مسافة تحكم في الحركة تبلغ 50 millimeters؛ حيث يتم التحكم في حركات المنصات باستخدام برنامج تقنية تحديد المواقع المتقدم من شركة Thor Lab. يقوم البرنامج بالتحكم في المحرك الخطوي لضبط بارامترات تحميل التردد والسعة لكل من القص والضغط بشكل مستقل ومتزامن. بعد ذلك، قم بوضع خلية تحميل مصغرة بسعة خمسة pounds بين بلاتين التحميل والمنصة المتحركة لتوفير التغذية الراجعة للقوة اللازمة للكشف عن التلامس بين البلاتين والبنى، وكذلك لتقييم استجابات التحميل.

تأكد من أن خلية تحميل الوزن تتمتع بدقة عالية تتراوح من 0.15% إلى 0.25% من النطاق الكامل، وأن وحدة العرض الخاصة بخلية التحميل تحتوي على منفذ RS 2 32 للسماح بجمع البيانات على جهاز كمبيوتر. ومن أجل تثبيت العينات داخل آبار طبق يحتوي على 24 بئراً، قم بتجهيز قالب لـ aros gel بسمك 1.5 millimeter باستخدام نظام صب الجل مع فواصل بسمك 1.5 millimeter. وبمجرد التجميع، صب محلول aros بتركيز 4% بين اللوحين الزجاجيين واترك الخليط ليبرد.

بعد ذلك، قم بإزالة اللوحة العلوية واثقب قرصاً بقطر 16 مليمتر من اللوح الزراعي (agro slab). وبالنسبة لكل عينة في كل قرص، اثقب ثقباً لوضع العينة بداخله. ضع الأقراص المكتملة في آبار لوحة ذات 24 بئراً.

بعد ذلك، اضغط بنيات نسيجية بسماكة 2.25 millimeter وقطر 5 millimeter في كل حامل من حوامل الهلام. يجب أن تبرز العينة من أعلى كل حامل aeros. ثم أضف 1.5 milliliters من وسط الزرع إلى كل بئر وأعد الغطاء.

بعد ذلك، قم بإعادة الطبق إلى الحاضنة حتى يحين وقت تحميل العينات. لبدء التحميل الميكانيكي للمستنسخات النسيجية، قم بتثبيت اللوح الألمنيوم في خلية الحمل، وقم بتثبيت مجموعة البلاتين المعقمة في المرحلة الرأسية في جميع الأوقات. يجب تشغيل الحاضنة في ظروف رطوبة منخفضة لمنع تعطل الجهاز.

بعد ذلك، قم بتشغيل وحدة تحكم المحرك الخطوي وجهاز الكمبيوتر. افتح برنامج المستخدم الخاص بتقنية تحديد المواقع المتقدمة، ثم انتقل إلى علامة تبويب التحكم الرسومي في كلتا الشاشتين. اضغط على زر التصفير (home zero) لإرسال كلا المحركين الخطويين إلى وضع الصفر، والذي يتم تحديده على أنه الموضع العلوي والأقصى جهة اليمين.

قم بتجهيز العينات للتحميل عن طريق إزالة جزء من الوسط من كل بئر لمنع الفيضان أثناء التحميل الميكانيكي. بعد ذلك، ضع الطبق ذو الـ 24 بئراً في المفاعل الحيوي وقم بمحاذاة الطبق بعناية مع البلاتين باستخدام أربعة محددات حركية قابلة للتعديل، مع التأكد من ضبط محاذاة الطبق. قم بعملية التطهير (Flush) باستخدام الواجهة الأمامية لقاعدة المفاعل الحيوي في علامة تبويب التحكم الرسومي.

قم بضبط المحاذاة يدويًا بدقة من خلال النقر على مربع الموضع لتحريكه أفقيًا. وعندما تتم محاذاة اللوحة مع آبار اللوحة، ابدأ في خفض اللوحة حتى تلامس العينات لأول مرة.

بمجرد الوصول إلى وضع البداية، انتقل إلى علامة تبويب متسلسل الحركة (move sequencer) وقم بتحميل تسلسل الحركة المطلوب بالضغط على "تحميل" (load) أو أنشئ برنامجك الخاص كما هو موضح في البروتوكول النصي المرفق بهذا الفيديو. بعد ذلك، اضغط على "تشغيل" (run) لبدء البرنامج. سيقوم البرنامج بتوجيه المحركات لتطبيق نظام التهيئة المطلوب على العينات.

عندما ينتهي البرنامج، ارفع الطبق يدويًا بحيث يتجاوز الجزء العلوي من طبق زراعة الأنسجة. ثم قم بإزالة الطبق ذي الـ 24 عجلة من المفاعل الحيوي واستبدل الوسط الغذائي. وأخيرًا، قم بإزالة البلاتين بعناية من خلية تحميل الوزن ثم أوقف تشغيل الأجهزة.

كان لاستخدام المفاعل الحيوي ثنائي المحور الموضح في هذا الفيديو تأثير ملحوظ على كمية الجليكوزامينوجليكان والكولاجين التي تفرزها الخلايا داخل البنى المهندسة نسيجياً. جرى التكييف خمسة أيام في الأسبوع لمدة ثلاث ساعات يومياً، مع سلالة ضغط بنسبة 10% وسلالة قص بنسبة 5% عند تردد واحد هرتز. وبعد 30 يوماً من الزرع، كانت كمية الجليكوزامينوجليكان والكولاجين التي أفرزتها الخلايا الغضروفية المعرضة للتحميل ثنائي المحور أعلى بكثير من عينات الضبط. أما التحميل أحادي المحور فقد أدى فقط إلى زيادة ملحوظة في كمية الجليكوزامينوجليكان.

بالإضافة إلى ذلك، أدى التحميل ثنائي المحور إلى تكوين بنى أكثر سمكاً، ولكنه لم يظهر أي تأثير على مرونة هذه البنى. وباعتماد بروتوكول الجرعات هذا، وبعد 30 يوماً من التكييف والزراعة، صُبغت المقاطع العرضية للبنى النسيجية باستخدام علامات الغضروف النموذجية، بما في ذلك الزعفران الأزرق والكولاجين من النوع الثاني. وتضمنت المجموعات الثلاث المختلفة: عدم التكييف، والتحميل أحادي المحور، والتحميل ثنائي المحور.

بينما تظهر جميع المجموعات صبغاً إيجابياً بـ alium Blue وSaffron وO، تظهر العينات التي خضعت لتحميل ثنائي المحور كميات متزايدة من الكولاجين من النوع الثاني مقارنة بالعينات التي لم تخضع للتحميل والعينات التي خضعت لتحميل أحادي المحور. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تطبيق أحمال أحادية أو ثنائية المحور على بنى هندسة الأنسجة النامية.