العزلة، معالجة وتحليل خلايا اللثة الفئران

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل ومعالجة لثة الميرين بدقة لإجراء مزيد من تحليل قياس التدفق الخلوي. ويتم تحقيق ذلك أولاً من خلال عزل اللثة جراحياً بطريقة دقيقة، ثم تتم معالجة النسيج المستأصل لإنتاج معلق من الخلايا المفردة.

بعد ذلك، يتم إجراء صبغ للخلايا من الخارج والداخل باستخدام الأجسام المضادة. وأخيراً، يتم تحليل العينة عن طريق قياس التدفق الخلوي. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج توضح مجموعات خلوية مختلفة في اللثة والتغيرات الخلوية التي تحدث في النسيج عقب التعرض لإصابة مناعية من خلال تحليل قياس التدفق الخلوي.

تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية، مقارنة بالطرق الأخرى مثل كيمياء OC أو التألق أحادي اللون، في كونها طريقة سريعة وبسيطة لتحليل عدد كبير من الخلايا، مما يسمح بالتحليل المتزامن لعدة متغيرات، فضلاً عن فرز أنواع مختلفة من الخلايا لإجراء تجارب إضافية. ويمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال المناعة، مثل كيفية تأثير الكائنات الدقيقة على التوازن اللثوي وعلاقة ذلك بفقدان العظام الناجم عن الالتهاب في نموذج تجريبي لالتهاب دواعم السن. وقد خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما بدأنا في دراسة دور خلايا RI أثناء التهاب دواعم السن. ويعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية نظراً لصعوبة تعلم تقنية تسريع جين GVA بسبب الحجم الصغير وصعوبة الوصول نسبياً إلى MU one J gva.

للبدء، قم بتحضير محاليل الأوساط والأدوات الجراحية المعقمة وفقاً للبروتوكول المكتوب. بعد القتل الرحيم للفأر، وفقاً للطرق المعتمدة من لجنة رعاية واستخدام الحيوان في مؤسستك، استخدم مقصاً مستقيماً حاداً وغير مدبب لقص كلا جانبي التجويف الفموي، بما في ذلك الخدين ورأد الفك السفلي، ثم اسحب الفك السفلي لأسفل مع توجيه مقص قياسي بشكل عمودي على مستوى العظم الحنكي. قم بقطع الأنسجة الرخوة والصلبة في خط وهمي يبعد 1 mm خلف الأضراس الثالثة.

بعد ذلك، قم بإجراء شق في الأنسجة الرخوة والصلبة، على بعد 2 mm خلف القواطع. ثم اسحب الجزء الأمامي من الفم لتعريض التجويف الأنفي مع جعل المقص موازياً للحنك. ضع قطعة شاش واحدة في التجويف الأنفي واستخدم القطعة الأخرى لإجراء شق عند الدهليز وصولاً إلى الشق الخلفي.

كرر الشق على الجانب الآخر من الفك العلوي لفصله عن الجمجمة. ثم قم بقصه من المنتصف وقم بتقليم أنسجة الحنك من كل نصف فك علوي للوصول إلى العظم السنخي باستخدام الملاقط والمقصات. قم بتقشير الأنسجة اللثوية من الحافة الأمامية ووضعها في طبق يحتوي على PBS و2%fetal calf serum أو FCS لمعالجة اللثة، ثم انقلها إلى طبق زراعة يحتوي على 1 mL من PBS و2 mg/mL من collagenase type two و1 mg/mL من DNAs.

قم بالتقطيع باستخدام شفرة جراحية معقمة رقم 15. افرم النسيج جيداً قبل نقله إلى أنبوب اختبار مخروطي سعة 15 milliliter. اغسل أي خلايا نسيجية متبقية في الطبق باستخدام 1 milliliter من P-B-S-F-C-S وانقلها إلى الأنبوب.

قم بتحضين النسيج في حضانة هزازة مسخنة مسبقاً عند 37 °C وبسرعة 200 RPM لمدة 20 دقيقة. ثم أضف 20 µL من EDTA بتركيز 0.5 M واحضن العينة لمدة 10 دقائق أخرى. بعد ذلك، أضف P-B-S-F-C-S حتى يصل الحجم إلى 12 mL، ثم قم بطرد العينة مركزياً عند 4 °C وبقوة 400 ×g لمدة ثماني دقائق.

بعد إزالة السائل الطافي، قم بإعادة تعليق الخلايا في 2 mL من P-B-S-F-C-S. قم بترشيح العينة عبر مصفاة خلايا بمسامية 70 micron، ثم قم بطرد السائل المار بجهاز الطرد المركزي عند درجة حرارة 4 °C وبقوة 320 ×g لمدة 5 دقائق. أعد تعليق الخلايا في 300 µL من P-B-S-F-C-S.

وأخيراً، قم بعد الخلايا أثناء العمل تحت غطاء سحب هواء (hood) في درجة حرارة منخفضة ومع إطفاء الأنوار في حجم إجمالي قدره 100 µL، ثم أضف 0.2 إلى 0.5 µg من كل جسم مضاد مختار لكل 1×10⁶ من الخلايا وقم بالرج بجهاز الفورتكس (vortex) لفترة وجيزة. بعد تحضين العينات عند درجة حرارة 4 °C لمدة 15 دقيقة في الظلام، أضف 2 mL من P-B-S-F-C-S وقم بالطرد المركزي عند 320 ×g ودرجة حرارة 4 °C لمدة خمس دقائق. ولتثبيت الخلايا، قم بشفط السائل الطافي، ثم وأثناء الرج بجهاز الفورتكس، أعد تعليق الخلايا عن طريق إضافة 500 µL من BD cyto perms البارد قطرة تلو الأخرى.

بالنسبة للتأثيرات الخلوية، تُحضن الأنابيب عند درجة حرارة 4 °C في الظلام لمدة 40 دقيقة بعد عملية التحضين والرج الدوامي. وباختصار، يُضاف 1 mL من محلول غسيل BD perm، ثم يتم الطرد المركزي بسرعة 800 ×g عند درجة حرارة 4 °C لمدة 7 دقائق. وبعد تكرار عملية الغسيل، يتم سحب جميع السوائل باستثناء 300 µL من محلول الغسيل المنظم.

بعد ذلك، ولصبغ الخلايا داخلياً في حجم إجمالي قدره 100 µL، أضف 1 µg من كل جسم مضاد مختار لكل 1×10⁶ خلية. قم بالرج باستخدام جهاز الفورتكس لفترة وجيزة ثم حضّن العينات في الظلام لمدة 30 دقيقة. بعد غسل الخلايا مرتين كما سبق وإزالة جميع السائل الطافي، أعد تعليق الخلايا في 300 µL من منظم غسيل BD perm البارد والطازج.

بعد عملية خلط سريعة بجهاز الفورتكس، قم بترشيح المعلق في أنابيب fax. تُحفظ الأنابيب على الثلج أو في الثلاجة في الظلام حتى يحين وقت إجراء تحليل fax. خلايا لثوية مجمعة من فأرين سليمين.

أُجريت التحاليل باستخدام جهاز قياس التدفق الخلوي LSR two وتم تحليل البيانات بواسطة برنامج FlowJo. وتوضح مخططات التشتت الجانبي والتشتت الأمامي المعروضة هنا توزيع الخلايا. كما تم توضيح استراتيجية تحديد البوابات (Gating strategy) لتمييز الخلايا اللمفاوية، والخلايا الوحيدة، والخلايا التغصنية، والخلايا المحببة لأغراض المقارنة.

يمثل هذا الشكل مخطط تدفق خلوي يوضح الخلايا اللثوية المنقاة من الفئران المصابة ببكتيريا P gingivalis بعد 21 يوماً من التزقيم الفموي في سياق التهاب دواعم السن التجريبي. يمكن بسهولة ملاحظة زيادة في مجموعات الخلايا المناعية المختلفة في الفئران المصابة مقارنة بالفئران السليمة الموضحة هنا. يتم تحديد الخلايا المناعية في اللثة المعالجة من خلال تحديد الخلايا التي تعبر عن المؤشر المكون للدم CD 45.

تم فصل هذه الخلايا بشكل أكبر إلى خلايا T الموجبة لـ CD3 كما هو موضح في هذا الشكل. كما تم تحديد الخلايا المتعادلة وفقاً للتعبير عن جزيئات LY6G و CD11B. وأخيراً، تم تحديد خلايا لانجرهانز والمجموعة الفرعية الظهارية من الخلايا التغصنية من خلال تحديد الخلايا الموجبة لـ MHC class II والموجبة لـ CD11C، والتعبير عن EPAM و RIN CD207. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون ثلاث ساعات ونصف إلى خمس ساعات إذا تم اتباع هذا الإجراء بشكل صحيح.

يمكن إجراء طرق أخرى مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي (real-time PCR) للإجابة على أسئلة إضافية مثل التعبير الجيني في خلية واحدة بعد تطويره. وقد مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال المناعة لاستكشاف الاستجابة المحلية في GVA اللثوية ضد أي إصابة في مجال أبحاث أمراض اللثة. كما سمحت لنا هذه التقنية بتوضيح دور الخلايا المناعية وغير المناعية في G GVA في إمراضية التهاب اللثة التجريبي.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل ومعالجة خلايا GVA من البول من أجل الحصول على معلق خلوي أحادي، والذي سيخضع لاحقاً لصبغ فيروسي خارج الخلية وداخلها لتحليله بواسطة قياس التدفق الخلوي.