المعجل نوع 1 الحث السكري في الفئران عن طريق نقل بالتبني من CD4 + T خلايا سكري

الهدف العام من هذا الإجراء هو إحداث مرض السكري من النوع الأول بسرعة في الفئران عن طريق نقل الخلايا التائية المنشأة لمرض السكري من الفئران المعدلة وراثيا إلى الفئران ، التي تفتقر إلى الخلايا التائية والبائية الذاتية. ابدأ بحصاد الطحال والغدد الليمفاوية من الفئران المانحة وتنقية الخلايا التائية الأربعة موجبة للقرص المضغوط. بعد ذلك ، بالتبني ، قم بنقل الخلايا التائية المانحة المنقاة إلى الفئران المتلقية غير الانزلاقية.

ثم راقب الفئران المتلقية لتطور مرض السكري من النوع الأول. في النهاية ، يمكن استخدام هذا البروتوكول لدراسة التسبب في مرض السكري والتحقيق في التدخلات العلاجية مقارنة بالطرق الأخرى. الميزة الرئيسية لهذه التقنية المتمثلة في نقل BDC 2.5 ، CD أربع خلايا تائية إيجابية إلى متلقين غير انزلاقيين هي التطور السريع والقابل للتكرار لمرض السكري من النوع الأول.

بالنسبة للمتبرعين بالقرص المضغوط السكري ، تستخدم أربع خلايا تائية إيجابية الفئران BDC 2.5 المصابة بمرض السكري التي تم تحديدها على أنها خالية من مرض السكري عن طريق قياس الجلوكوز في البول. لإزالة الطحال والغدد الليمفاوية ، انقع الفراء بنسبة 70٪ من الإيثانول ، ثم قم بقص الجلد ، وسحب الجلد حتى تنكشف عضلات الأطراف الأمامية. بالقرب من قاعدة الأطراف الأمامية ، يجب أن تكون عقدتان ليمفاويتان على كل جانب مرئيتين أمسك بعناية كل عقدة ليمفاوية بملاقط صغيرة وقم بإزالتها عن طريق تقليم النسيج الضام.

بعد ذلك ، قم بعمل شق بوصة واحدة في الصفاق باستخدام المقص الصغير. الآن أمسك الطحال برفق في الوسط. قم بقص النسيج الضام والدهون المرفقة بعناية.

ثم قم بإزالة الطحال والدانتيل والطحال والغدد الليمفاوية في 10 مل من DMEM على الجليد. مع نهاية مكبس حقنة معقمة سعة 10 مليلتر ، اضغط برفق على الأعضاء اللمفاوية من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر. للحصول على تعليق خلية واحدة.

اشطف كل مصفاة بمليلتر واحد من DMEM عدة مرات لزيادة تعافي الخلايا. ثم انقل الخلايا المجمعة إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر وجهاز طرد مركزي بسرعة 400 جي لمدة سبع دقائق. في درجة حرارة الغرفة ، أعد تعليق حبيبات الخلية في ثلاثة ملليلتر من المخزن المؤقت CK.

الآن احتضن كل درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. لغسول خلايا الدم الحمراء ، أضف الآن 12 مل من DMEM وحبيبات الخلايا عن طريق الطرد المركزي. اغسل حبيبات الخلية مرة واحدة في 10 ملليلتر من DMEM.

بعد ذلك ، نقوم بتعليق الخلايا في خمسة ملليلتر من المخزن المؤقت لتلوين الحقائق ، ونستخدم مجهر تباين الطور ومقياس الخلوي الدموي لحساب عدد الخلايا القابلة للحياة. الآن قم بإزالة حوالي 1 في 10 من الخلايا الست لكل عنصر تحكم في التلوين. قم أيضا بتلطيخ الخلايا بالأجسام المضادة أحادية النسيلة للفأر لفرز الخلايا التائية الأربعة الإيجابية غير المنشطة.

احتضان كل هذه العينات عند أربع درجات مئوية في الظلام لمدة 30 دقيقة. الآن اغسل الخلايا بثلاثة أضعاف حجم تلطيخ المخزن المؤقت للفاكس وأعد تعليق الخلايا في مخزن الفاكس مرة إلى مرتين 10 إلى سبع خلايا لكل مليلتر لفرز العينة و 300 ميكرولتر للتحكم في البقعة الفردية. بعد ذلك ، مرر عينة الخلية عبر أنبوب غطاء مصفاة خلية 35 ميكرومتر.

لإزالة كتل الخلايا ، قم بمعالجة العينات لفارز الخلايا باستخدام مشغل مدرب ، اترك حوالي ثلاث ساعات ، بما في ذلك وقت الإعداد لفرز حوالي 1.5 مرة 10 إلى الثامن المجاميع المعدلة وراثيا ساذجة CD أربع خلايا تائية موجبة. يمكنك أن تتوقع حوالي 2.5 في 10 من الخلايا الست لكل فأرة وسيكون معدل الفرز حوالي اثنين في 10 من الأحداث الرابعة في الثانية على أداة مثل BD Fox Aria. اجمع الخلايا التي تم فرزها إلى ثلاثة ملليلتر من DMEM.

سجل العدد المطلق للخلايا التي تم فرزها وقم بطردها لمدة سبع دقائق. عند 400 Gs, نقوم بتعليق كريات الخلية في محلول ملحي مخزن بالفوسفات المعقم لنقل الخلايا التائية بالتبني. باستخدام حقنة مليلتر واحد في إبرة قياس 18 ، قم بتعليق الفاكس المنقى بلطف أربع خلايا تائية موجبة.

قم بتحميل حقنة المليلتر الواحد ثم استعدادا للحقن ، قم بإرفاق إبرة نصف مقياس 27 نقطة إلى المحقنة. كبح جماح الفئران المتلقية للعقدة وامسح ذيلها بنسبة 70٪ من الإيثانول لتطهير موقع الحقن. ثم حقن مرة واحدة 10 من القرص المضغوط الستة المنقى أربع خلايا تائية موجبة لكل فأر في أي من أوردة الذيل الجانبية.

عند القيام بحقن وريد الذيل ، تأكد من عدم إجبار المكبس. إذا كانت الإبرة في الواقع في الوريد ، فيجب أن يحدث الحقن بدون مقاومة تقريبا بدءا من خمسة أيام من نقل الخلايا التائية. راقب الفئران المتلقية للانزلاق يوميا لتطور مرض السكري من النوع الأول.

قم بقياس نسبة الجلوكوز في البول باستخدام شرائط الكاشف وفقا للمصنعين والتعليمات. لاحظ أن الفئران التي لديها قراءتان متتاليتان للجلوكوز في البول تزيد عن 250 ملليغرام لكل ديسيلتر تعتبر مصابة بمرض السكري. في تجربة نموذجية ، ينتج كل فأر متبرع BDC 2.5 حوالي مرتين ونصف 10 من ستة خلايا تائية موجبة للقرص المضغوط المعدل وراثيا الساذجة بعد فرز الخلايا بعد النقل بالتبني لخلايا CD المنشأة لمرض السكري أربع خلايا تائية إيجابية ، تمت مراقبة الفئران بحثا عن تركيزات الجلوكوز في البول.

أدى النقل بالتبني لأعداد صغيرة من الخلايا من الفئران المانحة BDC 2.5 إلى الإصابة بمرض السكري من النوع الأول في جميع المتلقين غير المعرضين للانزلاق بحلول اليوم 11. عند القيام بها بشكل صحيح ، يمكن إجراء هذه التقنية في حوالي ثماني ساعات من حصاد الأعضاء إلى نقل الخلايا التائية.