Name: تطبيق على في المختبر الحمض النووي الفحص حماية لتصور الإجهاد خصائص الوساطة من البروتين DPS (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 41 s
Description: تعلم تقنية الفحص في المختبر لتقييم دور بروتين Dps في حماية الحمض النووي من التلف التأكسدي باستخدام كيمياء فينتون والتنقية بالكروماتوغرافيا.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ونحن ممتنون لميشيلا دي مارتينو، ويلفريد R. هاجن، وكوروش Honarmand ابراهيمي لإجراء مناقشات مفيدة. وأيد هذا العمل من قبل بدء التمويل من جامعة دلفت للتكنولوجيا.

1. DPS التعبير وتنقية الحصول على بروتين عالية النقاء هو خطوة أولى أساسية لفحص الحمض النووي الحماية. تنقية DPS البروتين يمكن أن يؤديها في 4-5 أيام. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل سلالة البروتيني التي تعاني من نقص من E. القولونية (مثل BL21 (DE3) pLysS) مع ناقلات الحيوانات الأليفة (مثل pET17) إلى التي تم استنساخ DPS تسلسل البروتين الترميز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الإنتصارات وتحولت الخلايا خارجا على مرق لوريا (LB) لوحات أجار التي تحتوي على المضادات الحيوية المناسبة (مثل الأمبيسلين والكلورامفينيكول لالأمثلة المقدمة في 1.1). احتضان لوحات بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطعيم مستعمرة واحدة من لوحة إلى 30 مل من المتوسط ​​LB التي تحتوي على المضادات الحيوية المناسبة. احتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في حين تهتز في 200-250 دورة في الدقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطعيم 2 × 1 L المتوسطة LB تحتوي على المضادات الحيوية المناسبة مع 10 مل من كل ثقافة بين عشية وضحاها. ينمو بمعدل 37 درجة مئوية، في حين تهتز، إلى OD 600 </الفرعية&gt; ما يقرب من 0.6. (زراعة الخلايا لأعلى OD زيادة الغلة البروتين، دون المساس بشكل ملحوظ على نقاء المنتج النهائي.) لحث على التعبير من DPS بإضافة IPTG إلى تركيز من 0.3 ملم، واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 3-4 ساعة في حين تهتز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حصاد الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 6،000 x ج لمدة 15 دقيقة. Resuspend وكريات خلية في 7.5 مل من العازلة DEAE A (50 ملي HEPES KOH-، ودرجة الحموضة 7.5، 100 مم كلوريد الصوديوم، 0.1 ملي EDTA) لكل لتر من زراعة الخلايا المستحثة. قد يتم تجميد العينات في النيتروجين السائل وتخزينه في -80 درجة مئوية، إذا رغبت في ذلك. ويمكن عندئذ أن استمر الإجراء من قبل ذوبان العينات في حمام الماء عند 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة خليط من مثبطات الأنزيم البروتيني (مثل Calbiochem مجموعة III مثبطات الأنزيم البروتيني، في 0.167 ميكرولتر لكل مل من تعليق خلية) إلى تعليق خلية لمنع تدهور DPS بإفراط (overexpressed). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد مستخلص خالية من الخلايا باستخدام الصحافة الفرنسية. رئيس الصحافة الفرنسية مع 20 مل DEAE العازلة A (إذا باستخدام نموذج التدفق المستمر)، ثم disrupر العينة مرتين في 20 kpsi. أجهزة الطرد المركزي في المحللة في 30،000 x ج لمدة 35 دقيقة في 4 درجات مئوية لتوضيح جزيئات غير قابلة للذوبان، وحفظ طاف. قد ثم يتم تجميد طاف باستخدام النيتروجين السائل وتخزينه في -80 درجة مئوية، إذا رغبت في ذلك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتوازن 30 مل DEAE سيفاروز العمود CL-6B مع DEAE العازلة A، باستخدام FPLC. تشغيل المخزن المؤقت من خلال العمود في 1-2 مل / دقيقة مع أقصى قدر من الضغط من 0.2 ميجا باسكال على الخلفية. تحميل استخراج خالية من الخلايا على العمود، والبدء في جمع من خلال تدفق مرة واحدة تبدأ OD 280 إشارة إلى زيادة فوق خط الأساس. غسل العمود مع DEAE الاحتياطي A حتى يعود OD 280 القيمة إلى خط الأساس، في حين جمع مستمر التدفق من خلال. من خلال تدفق يجب أن يحتوي على غالبية البروتين DPS، وخالية من الحمض النووي ملزمة. غسل العمود مع 100٪ الواق B (50 ملي HEPES KOH-، ودرجة الحموضة 7.5، 1 M كلوريد الصوديوم، 0.1 ملي EDTA). هذا شطافة يحتوي المجمعات DPS-DNA وكذلك البروتينات الأخرى، ويمكن التخلص منها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الإعلاناتditional تلويث البروتينات من خلال الأمونيوم هطول كبريتات. تحديد حجم المجمعة خلال تدفق. ببطء (على مدى فترة من 10-20 دقيقة) إضافة الجافة سلفات الأمونيوم صغيرة من الحبوب إلى التشبع 62٪ (390 ملغ لكل مل من محلول) في 4 درجات مئوية مع التحريك جيدا. يقلب الخليط لمدة 20-30 دقيقة إضافية بعد إضافة الجزء الأخير من كبريتات الأمونيوم لضمان موازنة كاملة. ستبقى DPS القابلة للذوبان، بينما البروتينات تلويث سوف تترسب من المحلول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة البروتينات المترسبة بواسطة الطرد المركزي عند 20،000 XG لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية وحفظ طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ببطء إضافة 227 ملغ كبريتات الأمونيوم إضافية لكل مل من طاف لتصل إلى 94٪ التشبع ويحرك المزيج لمدة 20-30 دقيقة لضمان موازنة كاملة. DPS يترسب في هذا تركيز الملح عالية، ويمكن جمعها بواسطة الطرد المركزي عند 20،000 x ج لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية. وسوف يكون في DPS بيليه، ويمكن أن يتم تجاهل طاف. يمكن تخزين بيليه في -80 ° C إذا قصرIRED. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend الكرية التي تحتوي على DPS في إعادة تعليق العازلة (50 ملي HEPES KOH-، ودرجة الحموضة 7.5، 150 مم كلوريد الصوديوم، 0.1 ملي EDTA). ضبط حجم العينة إلى 2.5 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تبادل العازلة لإزالة كبريتات الأمونيوم باستخدام عمود الترشيح PD-10 هلام. تتوازن السرير هلام مع 25 مل العازلة إعادة تعليق. تطبيق مل 2.5 من عينة DPS إلى الجزء العلوي من العمود PD-10 والسماح لها نقع فيها تجاهل التدفق من خلال. جمع DPS بواسطة يبلغ حجمه مع 3.5 مل العازلة إعادة تعليق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي المخزن المؤقت تبادل عينة في 16،000 XG لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية لإزالة أي مكونات غير قابلة للذوبان، وتمييع مع 6-10 مل العازلة تخفيف (50 ملي HEPES KOH-، ودرجة الحموضة 7.5، 0.1 ملي EDTA) لضمان أن تركيز الملح منخفضة بما فيه الكفاية لDPS لربط العمود سيفاروز SP. عينات مركزة خاصة من DPS قد تصبح أقل للذوبان على التخفيف في المخزن مؤقت أقل من الملح، كما يتضح من ملبد من السائل، ولكن يمكن resolubilized تماما قبل إضافة عمو الصغيرةNT من 5 M محلول كلوريد الصوديوم (وهي 10-20 ملم إضافية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتوازن لمل SP سيفاروز عمود تدفق سريع 30 مع SP العازلة A (50 ملي HEPES KOH-، ودرجة الحموضة 7.5، 50 ملي مول كلوريد الصوديوم، 0.1 ملي EDTA). تشغيل المخزن المؤقت من خلال العمود في 1.5-2 مل / دقيقة مع الحد من الضغط 0.3 ميجا باسكال على الخلفية. تحميل العينة على العمود. يغسل مع SP الاحتياطي A حتى OD عائدات التتبع 280 إلى خط الأساس، وتجاهل التدفق من خلال. تشغيل الانحدار الخطي 150 مل 0-100٪ B الاحتياطي، في حين جمع الكسور 2 مل. سوف DPS أزل في ذروة حادة في حوالي 50٪ B، على الرغم من اختلاف بنسبة 10٪ هو ممكن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل الكسور شطف على 15٪ SDS-PAGE هلام، والتحقق من وجود تلوث الحمض النووي عن طريق قياس OD 260/280 OD نسبة باستخدام مقياس الطيف الضوئي. الجل ينبغي أن تظهر فقط فرقة واحدة حوالي 19 كيلو دالتون، وOD 260/280 OD هو عادة حوالي 0.7. تجمع أنقى DPS الكسور. استخدام وحدة تصفية الطرد المركزي (مثل وحدة الترشيح Amicon الترا) مع10K الوزن الجزيئي وقف انتاج المواد الانشطارية لتركيز DPS ويتبادل عليها في المخزن مؤقت تخزين (50 ملي HEPES KOH-، ودرجة الحموضة 7.5، 50 ملي كلوريد الصوديوم). قسامة DPS تنقيته، والتجميد في النيتروجين السائل لتخزين في -80 درجة مئوية. </li></ol> 2. DNA الفحص حماية ينطوي على فحص متعددة الخطوات حساسة للوقت، وينبغي تزامنت مع ثاني للحصول على نتائج قابلة للتكرار. وتشارك العديد من المكونات والخطوات pipetting ل، لذلك جدول pipetting ل(انظر الجدول 1) من المستحسن أن تتبع الخطوات وحدات التخزين. إجمالي الوقت اللازم لفحص وجود أكثر من 3 ساعة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس 30 مل من الماء إلى قارورة محكمة الإغلاق؛ تدفق المياه مع N 2 لمدة 10 دقيقة (باستخدام اثنين من الإبر المحاقن، واحدة في السائل، واحدة فوقه) لإزالة الأكسجين من الحل. أضف 0.0168 ز FESO 4 • 7H 2 O إلى الماء للحصول على محلول المخزون 2 مم. اغلاق القارورة وتدفق مع النيتروجين لمدة 5 دقائق أكثر، ثم خلط. يجب أن يكون الحلواضحة، وإذا كان أي تلميح من الأصفر قابلا للاكتشاف، وإعداد حل الحديد الجديدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل ملم 100 H 2 O 2 حل (10.87 ميكرولتر من 9.2MH 2 O 2 في 1 مل من الماء)؛ الحفاظ على الجليد ومحمية من الضوء بواسطة التفاف في رقائق الألومنيوم. استخدم فقط لحوالي 1-2 ساعة بعد التحضير بسبب تسوس عفوية. الأسهم بيروكسيد الهيدروجين هو وبالمثل تخضع لانهيار، والتي يمكن تحسينها جزئيا التخزين السليم (في الظلام، في 4 درجات مئوية). ويوصى الشيكات العادية للتركيز الأسهم عن طريق قياس OD 240. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الجليد قسامة من المنقى DPS بسرعة في حمام مائي درجة حرارة الغرفة، والحفاظ على الجليد. أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 ثانية في 4،000 x ج في جدول أعلى picocentrifuge إلى المجاميع راسب. قياس تركيز بعد الطرد المركزي باستخدام مقياس الطيف الضوئي (OD 280 = 1.547 يشير إلى وجود تركيز من 100 DPS مونومر ميكرومتر). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع DNA خطي من الأوراق المالية عالية التركيز باستخدام 12X العازلة رد فعل (1M-MOPS KOH درجة الحموضة 7.0، 1 M كلوريد الصوديوم) إلى تركيز من 100 نانوغرام / ميكرولتر. ويستخدم الحمض النووي خطي لجعل الكمي أسهل، ولكن يمكن استخدام DNA البلازميد كذلك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة 1 ميكرولتر من خليط الحمض النووي العازلة في أنبوب PCR. إضافة ما يكفي من الماء في رد فعل بحيث حجم رد الفعل النهائي (ناقص SDS) سيكون 12 ميكرولتر. ينبغي أن يحسب هذا المبلغ مقدما باستخدام الجدول pipetting ل. إضافة DPS إلى تركيز النهائي من dodecamer 3 ميكرومتر. احتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة للسماح لDPS لربط الحمض النووي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة ما يكفي من 2 ملي FESO 4 الحل للوصول إلى التركيز المطلوب. يستخدم تجربة نموذجية مجموعة من تركيزات 0-1 ملي FESO 4. سوف تركيزات أعلى يسبب تدهور الحمض النووي أكثر اتساعا ولكن قد يؤدي أيضا إلى تشكيل الحديد يترسب في خليط التفاعل. بسرعة إضافة 1 ميكرولتر من ملي H 2 O 2 حل 100 (إلى 10 ملي تركيز النهائي)، ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق للسماح للفنتونبوساطة رد فعل تدهور لتأخذ مكان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 0.8 ميكرولتر من 20٪ SDS (كبريتات الصوديوم دوديسيل). خلط واحتضان عند 85 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لتعطيل المجمعات DPS-DNA. وSDS يزعزع استقرار معقدة DPS-DNA، ويمنع التحولات هلام غير المرغوب فيها لDNA، مما يحسن من سهولة القياس الكمي. خطوة اختيارية هو وقف رد فعل من جانب المهينة حفاز بيروكسيد الهيدروجين إلى منتجات غير سامة. لظروف وصفها في هذا البروتوكول، ليست هناك حاجة لهذه الخطوة الحصول على مجموعة واسعة من تدهور الحمض النووي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان على الجليد لمدة 1 دقيقة، إضافة صبغة التحميل، وتحميل على هلام الاغاروز. تشغيل هلام، وصمة عار لالحمض النووي باستخدام بروميد إيثيديوم. وينبغي أن يكون الجل الملون بعد الكهربائي بدلا من قبل الكهربائي، لمنع SDS من التدخل في توزيع بروميد إيثيديوم في هلام. </li></ol>

<ol><li>Almiron, M., Link, A. J., Furlong, D., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+DNA-binding+protein+with+regulatory+and+protective+roles+in+starved+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A novel DNA-binding protein with regulatory and protective roles in starved Escherichia coli.</a> Genes Dev. 6, 2646-2654 (1992).</li>
<li>Chiancone, E., Ceci, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multifaceted+capacity+of+Dps+proteins+to+combat+bacterial+stress+conditions%3A+Detoxification+of+iron+and+hydrogen+peroxide+and+DNA+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+biophysica+acta%22%5BJournal%5D)">The multifaceted capacity of Dps proteins to combat bacterial stress conditions: Detoxification of iron and hydrogen peroxide and DNA binding.</a> Biochimica et biophysica acta. 1800 (8), 798-805 (2010).</li>
<li>Ali Azam, T., Iwata, A., Nishimura, A., Ueda, S., Ishihama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+phase-dependent+variation+in+protein+composition+of+the+Escherichia+coli+nucleoid%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Growth phase-dependent variation in protein composition of the Escherichia coli nucleoid.</a> J. Bacteriol. 181 (20), 6361-6370 (1999).</li>
<li>Grainger, D. C., Goldberg, M. D., Lee, D. J., Busby, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+repression+by+Fis+and+H-NS+at+the+Escherichia+coli+dps+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Selective repression by Fis and H-NS at the Escherichia coli dps promoter.</a> Molecular Microbiology. 68 (6), 1366-1377 (2008).</li>
<li>Martinez, A., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+of+DNA+during+oxidative+stress+by+the+nonspecific+DNA-binding+protein+Dps%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Protection of DNA during oxidative stress by the nonspecific DNA-binding protein Dps.</a> J. Bacteriol. 179 (16), 5188-5194 (1997).</li>
<li>Nair, S., Finkel, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dps+protects+cells+against+multiple+stresses+during+stationary+phase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Dps protects cells against multiple stresses during stationary phase.</a> J. Bacteriol. 186 (13), 4192-4198 (2004).</li>
<li>Grant, R. A., Filman, D. J., Finkel, S. E., Kolter, R., Hogle, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+crystal+structure+of+Dps%2C+a+ferritin+homolog+that+binds+and+protects+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">The crystal structure of Dps, a ferritin homolog that binds and protects DNA.</a> Nat. Struct. Biol. 5 (4), 294-303 (1998).</li>
<li>Zhao, G., Ceci, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+and+hydrogen+peroxide+detoxification+properties+of+DNA-binding+protein+from+starved+cells.+A+ferritin-like+DNA-binding+protein+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Iron and hydrogen peroxide detoxification properties of DNA-binding protein from starved cells. A ferritin-like DNA-binding protein of Escherichia coli.</a> J. Biol. Chem. 277 (31), 27689-27696 (2002).</li>
<li>Ceci, P., Cellai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+condensation+and+self-aggregation+of+Escherichia+coli+Dps+are+coupled+phenomena+related+to+the+properties+of+the+N-terminus%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">DNA condensation and self-aggregation of Escherichia coli Dps are coupled phenomena related to the properties of the N-terminus.</a> Nucleic Acids Res. 32 (19), 5935-5944 (2004).</li>
<li>Ilari, A., Ceci, P., Ferrari, D., Rossi, G. L., Chiancone, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+incorporation+into+Escherichia+coli+Dps+gives+rise+to+a+ferritin-like+microcrystalline+core%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Iron incorporation into Escherichia coli Dps gives rise to a ferritin-like microcrystalline core.</a> J. Biol. Chem. 277 (40), 37619-37623 (2002).</li>
<li>Swift, J., Wehbi, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+functional+ferritin-like+proteins+with+hydrophobic+cavities%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Design of functional ferritin-like proteins with hydrophobic cavities.</a> Journal of the American Chemical Society. 128 (20), 6611-6619 (2006).</li>
<li>Ceci, P., Chiancone, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+iron+oxide+nanoparticles+in+Listeria+innocua+Dps+%28DNA-binding+protein+from+starved+cells%29%3A+a+study+with+the+wild-type+protein+and+a+catalytic+centre+mutant%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry%22%5BJournal%5D)">Synthesis of iron oxide nanoparticles in Listeria innocua Dps (DNA-binding protein from starved cells): a study with the wild-type protein and a catalytic centre mutant.</a> Chemistry. 16 (2), 709-717 (2010).</li>
<li>Ceci, P., Ilari, A., Falvo, E., Chiancone, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Dps+protein+of+Agrobacterium+tumefaciens+does+not+bind+to+DNA+but+protects+it+toward+oxidative+cleavage%3A+x-ray+crystal+structure%2C+iron+binding%2C+and+hydroxyl-radical+scavenging+properties%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The Dps protein of Agrobacterium tumefaciens does not bind to DNA but protects it toward oxidative cleavage: x-ray crystal structure, iron binding, and hydroxyl-radical scavenging properties.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (22), 20319-20326 (2003).</li>
<li>Su, M., Cavallo, S., Stefanini, S., Chiancone, E., Chasteen, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+so-called+Listeria+innocua+ferritin+is+a+Dps+protein.+Iron+incorporation%2C+detoxification%2C+and+DNA+protection+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The so-called Listeria innocua ferritin is a Dps protein. Iron incorporation, detoxification, and DNA protection properties.</a> Biochemistry. 44 (15), 5572-5578 (2005).</li>
<li>Kumar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effects+of+Koelreuteria+paniculata+Laxm.+on+oxidative+stress+and+hydrogen+peroxide-induced+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopharmacology%22%5BJournal%5D)">Protective effects of Koelreuteria paniculata Laxm. on oxidative stress and hydrogen peroxide-induced DNA damage.</a> Phytopharmacology. 1 (5), 177-189 (2011).</li>
<li>Stinefelt, B., Leonard, S. S., Blemings, K. P., Shi, X., Klandorf, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+radical+scavenging%2C+DNA+protection%2C+and+inhibition+of+lipid+peroxidation+mediated+by+uric+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Clinical+and+Laboratory+Science%22%5BJournal%5D)">Free radical scavenging, DNA protection, and inhibition of lipid peroxidation mediated by uric acid.</a> Annals of Clinical and Laboratory Science. 35 (1), 37-45 (2005).</li>
<li>Lopez-Gomollon, S., Sevilla, E., Bes, M. T., Peleato, M. L., Fillat, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+role+of+Fur+proteins%3A+FurB+%28All2473%29+from+Anabaena+protects+DNA+and+increases+cell+survival+under+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">New insights into the role of Fur proteins: FurB (All2473) from Anabaena protects DNA and increases cell survival under oxidative stress.</a> The Biochemical Journal. 418 (1), 201-207 (2009).</li>
<li>Ebrahimi, K. H., Hagedoorn, P. L., Hagen, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+and+stimulation+of+formation+of+the+ferroxidase+center+and+the+iron+core+in+Pyrococcus+furiosus+ferritin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Inorganic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Inhibition and stimulation of formation of the ferroxidase center and the iron core in Pyrococcus furiosus ferritin.</a> Journal of Biological Inorganic Chemistry. 15 (8), 1243-1253 (2010).</li>
<li>Smith, F. E., Herbert, J., Gaudin, J., Hennessy, D. J., Reid, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+iron+determination+using+ferene+triazine%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Serum iron determination using ferene triazine.</a> Clinical Biochemistry. 17 (5), 306-310 (1984).</li>
</ol>

ليس لدينا شيء في الكشف عنها.

عملية تنقية DPS كما هو موضح في هذه المقالة هي قوية للغاية. وكان نقاء باستمرار عالية (&gt; 99٪)، وتظهر أي بروتينات أخرى على المواد الهلامية SDS-PAGE والعصابات مرئية. على الرغم من هذا، يبدو أن بعض دفعات من DPS تنقيته أن يكون النشاط نوكلياز، كما يتضح من تدهور الحمض النووي جزئية عندما حضنت مع تركيزات عالية جدا من المرحلين. قد يشير هذا إلى وجود DNases نشطة للغاية في تركيز منخفض لأننا لم نتمكن لإزالة من خلال تنقية. ومع ذلك، لوحظ هذا التدهور الحمض النووي فقط عند تركيزات التي لا يتم استخد...

يجب الكائنات الهوائية يتعامل باستمرار مع أنواع الاكسجين التفاعلية التي يمكن أن تضر الحمض النووي الخاصة بهم فضلا عن غيرها من الجزيئات البيولوجية حاسمة. واحدة أداة فعالة لمواجهة الآثار السامة من الضرر التأكسدي هو البروتين الحمض النووي ملزم من الخلايا المتعطشة (DPS). منذ اكتشافه في عام 1992 من E. المتعطشة القولونية الثقافة 1، وقد تم تحديد DPS في أكثر من 300 نوع من البكتيريا والعتائق 2. upregulation هائلة من DPS خلال مرحلة ثابتة يجعل من الاكثر أعرب عالية البروتين نوواني المصاحب من E. القولونية في ظل ظروف المجاعة 3، 4. بالإضافة إلى ذلك، وقد تبين DPS للحفاظ على حد سواء الجدوى البكتيرية وسلامة الحمض النووي خلال العديد من الضغوط المختلفة، بما في ذلك الموت جوعا، وتركيز عالية من الحديد، التعرض للضوء الأشعة فوق البنفسجية، الصدمة الحرارية، والإجهاد التأكسدي 5، 6. هيكليا، DPS-الزميلة النفس إلى مستقر معقد هومو بلازميدة قليلة القسيمات من 12 مونومرات، ثhich التجمع في قذيفة جوفاء كروية. التجويف الداخلي على نطاق نانومتر ~ 4.5 يمكن الوصول إلى الخارج المذيبات عبر المسام التي تسمح بمرور الجزيئات الصغيرة 7، وأنه يمكن عزل المعادن المعدنية مثل الحديد 8. تأثير وقائي من DPS مستمد من عدة أنشطتها والكيمياء الحيوية، والتي تشمل الحمض النووي غير محددة ملزمة 1، النشاط ferroxidase، وتخزين الحديد 8. دراسة مفصلة عن الأنشطة البيوكيميائية المفيدة للDPS يتطلب أولا تنقية لها. DPS تنقية هو إجراء تفصيلا، كما يجب فصل DPS ليس فقط من البروتينات الأخرى، ولكن أيضا من أي الحمض النووي ملزمة 7. يستخدم لدينا عملية تنقية الأمثل العديد من التقنيات الشائعة، التي تتألف من عمودين التبادل الأيوني وكبريتات الأمونيوم خطوة هطول الأمطار. وهناك حاجة إلى العديد من التبادلات العازلة، كما DPS تتركز بشكل كبير يمكن أن تترسب من المحلول في ظروف قليل الملح. مرة واحدة وقد تم تنقية البروتين DPS، قد يتم تطبيقه على المقايسات التي تقيس مباشرة نشاطها ferroxidase 8، رياضيات الكيمياء الحمض النووي ملزم 9، وآليات ملزمة الحديد 10. لديه DPS تنقيته أيضا التطبيقات المحتملة الأخرى. تم استخدام هيكل كروي مجوف مستقرة من DPS كما السقالات لتخزين جزيئات مسعور داخل تجويف بروتين 11 وحتى غرفة رد فعل لتجميع الجسيمات النانوية المغناطيسية رواية 12. القدرة واقية من DPS للتوسط الأضرار الناجمة عن أنواع الاكسجين التفاعلية يمكن أن تكون بشكل واضح وأظهر مباشرة باستخدام مقايسة حماية الحمض النووي 13 و 14. في هذا الإجراء في المختبر، ويتم إنتاج الأنواع جذري عندما يحفز الحديد H 2 O 2 من التدهور عن طريق فنتون الكيمياء. هذه الجذور تلف الحمض النووي الحالي مباشرة في رد الفعل ويمكن أن تتحلل تماما في تركيزات عالية. نشاطين DPS مفتاح قد كلا مواجهة مباشرة آثار Fentإنتاج الجذور على بوساطة. DPS يقلل من تركيز الحديد حافز عن طريق تمعدن، وتستهلك وبيروكسيد الهيدروجين المتوفرة في هذه العملية. بالإضافة إلى ذلك، قد DPS ملزمة لالحمض النووي يحتمل أن تكون حمايته جسديا من ضرر الجذور ويتكثف قبل أن تتحول إلى حجم أصغر مع مساحة أقل على رد الفعل. الجمع بين هاتين الخاصيتين يجعل فحص DNA حماية مناسبة تماما لغرض قياس النشاط DPS واقية. مقايسة حماية الحمض النووي هي متعددة جدا، ويمكن استخدامها لمجموعة متنوعة من التطبيقات خارج DPS التوصيف. الضرر الراديكالية هو شكل شائع من التوتر في الخلايا، وتستخدم العديد من البروتينات والمواد الكيميائية المختلفة لمواجهة ذلك. المبدأ العام للمقايسة، وذلك باستخدام الحمض النووي سلامة كعلامة للضرر الجذور، ويمكن استخدامها في تركيبة مع أي تقريبا رد فعل المنتجة للراديكالية أو مواجهة وكيل. من بين أمور أخرى، وقد استخدمت بنجاح الفحص لتحديد خصائص مضادة للأكسدةمن K. استخراج بانيكولاتا للاستخدام في الصناعات الغذائية 15، لوصف آثار حمض اليوريك على الهيدروكسيل الضرر الوساطة 16، واكتساب رؤى جديدة في وظيفة الفراء النسخي البروتينات منظم 17. وعلى الرغم من الاستخدامات العديدة للمقايسة في الأبحاث المنشورة، وجدنا أن هناك حاجة إلى الكثير من التحسين والخطوات استكشاف الأخطاء وإصلاحها، الأمر الذي يجعل إعداد مقايسة لأول مرة عملية شاقة بلا داع لكثير من الباحثين. بروتوكول نقدم في هذه المقالة تهدف إلى إزالة هذا الحاجز للدخول.

<table><tbody><tr><td>BL21 (DE3) pLysS الخلايا المختصة</td><td>Promega</td><td>L1195</td><td></td></tr><tr><td>pET-17b DNA</td><td>EMD-Millipore</td><td>69663-3</td><td></td></tr><tr><td>LB مسحوق مرق</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022</td><td></td></tr><tr><td>ملح الصوديوم أمبيسلين</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>A0166</td><td></td></tr><tr><td>كلورامفينيكول</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>C0378</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>I6758</td><td></td></tr><tr><td>هيبس</td><td>BDH</td><td>441476L</td><td></td></tr><tr><td>هيدروكسيد البوتاسيوم</td><td>ميرك</td><td>105033</td><td></td></tr><tr><td>كلوريد الصوديوم</td><td>VWR</td><td>443824T</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>مجموعة كوكتيل مثبطات الإنزيم البروتيني III</td><td>EMD-Millipore</td><td>539134</td><td></td></tr><tr><td>DEAE-Sepharose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DFF100</td><td></td></tr><tr><td>كبريتات الأمونيوم</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>A4418</td><td></td></tr><tr><td>PD-10 أعمدة تحلية</td><td>المياه GE Healthcare LS</td><td>17-0851-01</td><td></td></tr><tr><td>SP-Sepharose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1799</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra Centr. فلتر (10K MWCO)</td> <td>ميليبور</td><td>UFC901024</td><td></td></tr><tr><td>كبريتات الحديدوز سباعي هيبتاهيدرات</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>F8048</td><td></td></tr><tr><td>محلول بيروكسيد الهيدروجين</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>216763</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>محلول كالبيوكيم</td><td>475898</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0418</td><td></td></tr><tr><td>بروميد الإيثيديوم</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>E1510</td><td></td></tr><tr><td>حاضنة ثابتة</td><td>Hettich</td><td>INE500</td><td></td></tr><tr><td>حاضنة اهتزاز </td><td>نيو برونزويك Sc.</td><td>Inova 44</td><td></td></tr><tr><td>جهاز طرد مركزي مبرد</td><td>Beckman Coulter</td><td>Avanti J-E</td><td></td></tr><tr><td>جهاز طرد مركزي على الطاولة</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>Cell Disrupter</td><td>Constant Systems Ltd.</td><td>TS2 / 40 / AA / AA</td><td></td></tr><tr><td>FPLC جهاز تنقية</td><td>جنرال إلكتريك</td><td>AKTA</td><td></td></tr><tr><td>قوارير محكمة الإغلاق</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-08918-85</td><td></td></tr><tr><td>إبر حقنة</td><td>BD</td><td>305128</td><td></td></tr><tr><td>ماصات</td><td>Eppendorf</td><td>Z683779-1EA ، Z683795-1EA</td><td></td></tr></tbody></table>

تطبيق على<em&gt; في المختبر</em&gt; الحمض النووي الفحص حماية لتصور الإجهاد خصائص الوساطة من البروتين dps

Application of an In vitro DNA Protection Assay to Visualize Stress Mediation Properties of the Dps Protein

الاكسدة هو نتيجة ثانوية لا مفر منه للحياة الهوائية. الأكسجين الجزيئي أمر ضروري لعملية التمثيل الغذائي للأرض، لكنه يأخذ أيضا في العديد من التفاعلات الضارة داخل الكائنات الحية. مزيج من الأيض الهوائي والحديد، وهو مركب حيوي آخر للحياة، ويكفي لإنتاج الجذور من خلال فنتون الكيمياء والحط من المكونات الخلوية. تدهور الحمض النووي يمكن القول إن عملية الأكثر إضرارا التي تنطوي على المتطرفين داخل الخلايا، كما إصلاح الحمض النووي لا يزال بعيدا عن تافهة. الفحص الواردة في هذه المادة تتيح تقنية الكمية لقياس وتصور تأثير الجزيئات والإنزيمات على الحمض النووي من التلف الراديكالي بوساطة. فحص الحمض النووي الحماية هو أداة بسيطة وسريعة وقوية لتوصيف المختبر في من خصائص وقائية من البروتينات أو المواد الكيميائية. أنه ينطوي على تعريض DNA إلى رد فعل الأكسدة الضارة وإضافة تركيزات مختلفة من مجمع الفائدة. ثم هو تصور خفض أو زيادة الحمض النووي من التلف بوصفها وظيفة من تركيز مركب باستخدام الكهربائي للهلام. في هذه المقالة ونحن لشرح تقنية للمقايسة حماية الحمض النووي عن طريق قياس خصائص وقائية من البروتين الحمض النووي ملزم من الخلايا المتعطشة (DPS). DPS هو مصغرة الفيريتين التي يتم استخدامها من قبل أكثر من 300 الأنواع البكتيرية لمكافحة بقوة الضغوطات البيئية. هنا نقدم بروتوكول تنقية DPS وشروط الفحص الأمثل لتقييم حماية الحمض النووي من قبل DPS.

عملية تنقية للDPS الموصوفة هنا هو تكرار للغاية. DPS تنقية وفقا للبروتوكول وصفها، وذلك باستخدام 2 لتر من E. ثقافة القولونية كنقطة انطلاق، وسوف تسفر عادة 2.5 مل من البروتين تحتوي على DPS 12 بتركيزات تتراوح بين 5 و 12 ميكرومتر. مرات الاستقراء أطول (4 ساعات) ويبدو للحد من هذه التقلبات. نقاء البروتين هو دائما فوق 99٪، كما يتضح من SDS-PAGE المواد الهلامية (الشكل 1). مستوى التلوث الحمض النووي لا يكاد يذكر على الدوام، كما يتضح من جانب كل من ال...

البروتين الحمض النووي ملزم من الخلايا المتعطشة (DPS) يلعب دورا حاسما في مكافحة الإجهاد الجرثومي. تتناول هذه المقالة تنقية<em&gt; E. القولونية</em&gt; DPS وبروتوكول ل<em&gt; في المختبر</em&gt; مقايسة يتظاهرون حماية DPS بوساطة من الحمض النووي من التدهور عن طريق أنواع الاكسجين التفاعلية.

تطبيق على<em&gt; في المختبر</em&gt; الحمض النووي الفحص حماية لتصور الإجهاد خصائص الوساطة من البروتين DPS

Oxidative stress is an unavoidable byproduct of  aerobic life.  Molecular oxygen is  essential for terrestrial metabolism, but it also takes part in many ...

الهدف العام من التجربة التالية هو تقييم التأثير الوقائي لبروتين DPS مخبرياً (in vitro) من خلال تصور الانخفاض في تلف DNA الناتج عن الجذور الحرة بفعل نشاط DPS. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تنقية DPS من خلايا e coli، باستخدام عدة أعمدة للتبادل الأيوني والترسيب بكبريتات الأمونيوم. وفي خطوة ثانية، يُضاف DPS المنقى إلى DNA، مما يسمح بتكوين معقد A-D-P-S-D-N-A نظراً لخصائص البروتين في الارتباط غير النوعي بـ DNA. بعد ذلك، تُضاف محاليل من حديد فيريس وبيروكسيد الهيدروجين إلى التفاعل لإنتاج جذور الهيدروكسيل عبر كيمياء فينتون (Fenton chemistry)، وبالتالي إحداث تلف في DNA.تظهر النتائج التي تم الحصول عليها انخفاضاً في تلف DNA بسبب وجود DPS، وذلك بناءً على التحديد الكمي لنطاقات DNA غير التالفة في هلامات الآجاروز بعد عملية الرحلان الكهربائي. وبوجه عام، سيواجه الأشخاص الجدد في هذه الطريقة صعوبة في تحضير الكواشف، مما يتسبب في حدوث تفاعلات غير مرغوب فيها مثل تكون رواسب الحديد الثلاثي، أو التحلل التلقائي لبيروكسيد الهيدروجين.على الرغم من أن هذه الطريقة توفر رؤية حول النشاط الوقائي لبروتين DPS ضد الإجهاد التأكسدي، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً لتقدير تأثيرات البروتينات والمواد الكيميائية الأخرى على تحلل DNA. ويمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجال الكيمياء التأكسدية، مثل تحديد الخصائص المضادة للأكسدة للمستخلصات الخلوية لاستخدامها في الصناعات الغذائية. وتتمثل الخطوة الأولى والأساسية في مقايسة حماية DNA في الحصول على بروتين DPS بدرجة نقاوة عالية.لبدء إجراء التعبير عن بروتين DPS وتنقيته، قم بتحويل سلالة من بكتيريا e coli تفتقر إلى البروتياز باستخدام ناقل pet تم استنساخ تسلسل تشفير بروتين DPS فيه. قم بتلقيح قارورتين تحتوي كل منهما على لتر واحد من وسط LB الذي يحتوي على المضادات الحيوية المناسبة، باستخدام 10 milliliters من مزرعة ليلية نمت من مستعمرة واحدة من الخلايا المحولة. اترك المزارع تنمو عند 37 درجة Celsius مع الرج حتى تصل قيمة OD 600 إلى 0.6 تقريبًا.عندما تصل الخلايا إلى الكثافة الضوئية (od) المطلوبة، يتم تحفيز التعبير عن DPS بإضافة IPTG بتركيز 0.3 millimolar، ثم تُحضن عند درجة حرارة 37 °C لمدة تتراوح من ثلاث إلى أربع ساعات مع الرج، ثم تُجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 6,000 ×g لمدة 15 دقيقة. نقوم بتعليق كتل الخلايا في 7.5 milliliters من محلول DEAE buffer لكل لتر من المزرعة الخلوية المحفزة، مع إضافة مزيج من مثبطات البروتياز إلى المعلق الخلوي المجمع. ولمنع تحلل TPS المفرط التعبير، يتم تحضير مستخلص خالٍ من الخلايا باستخدام جهاز French press prime.استخدم المكبس الفرنسي مع 20 milliliters من DEAE buffer A ثم قم بتفتيت العينة مرتين عند 20 KPSI، وبعد ذلك قم بطرد المادة المحللة مركزياً عند 30, 000 GS لمدة 35 minutes عند درجة حرارة أربع degrees Celsius. ولتصفية الجسيمات غير القابلة للذوبان، احفظ السائل الطافي، ثم حمّل المستخلص الخالي من الخلايا في عمود DEAE SRO SEAL six B سعة 30 milliliter تم موازنته مسبقاً باستخدام DEAE buffer a، وابدأ في جمع السائل المار. وبمجرد أن تبدأ إشارة OD two 80 في الارتفاع فوق خط الأساس، اغسل العمود باستخدام DEAE buffer A حتى تعود قيمة od two 80 إلى خط الأساس مع الاستمرار في جمع السائل المار.يجب أن يحتوي التدفق النافذ على غالبية بروتين DPS الخالي من DNA المرتبط، ثم اغسل العمود بـ 100% من buffer B. يحتوي هذا الرشاح على معقدات D-P-S-D-N-A بالإضافة إلى بروتينات أخرى ويمكن التخلص منه. الخطوة التالية هي إزالة البروتينات الملوثة الإضافية عن طريق الترسيب بكبريتات الأمونيوم، وعادة ما يتم إجراء ذلك في الغرفة الباردة.بعد تحديد حجم التدفق المجمع، أضف كبريتات الأمونيوم ذات الحبيبات الصغيرة الجافة ببطء حتى يصل التركيز إلى 62% saturation على مدار فترة تتراوح من 10 إلى 20 دقيقة عند درجة حرارة 4 °C مع التقليب. قم بإزالة البروتينات المترسبة جيداً عن طريق الطرد المركزي بسرعة 20,000 ×g لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة 4 °C. احتفظ بالرائق ببطء.أضف 227 milligrams إضافية من كبريتات الأمونيوم لكل milliliter من الطافي للوصول إلى تشبع بنسبة 94%، ثم حرك المزيج لمدة تتراوح بين 20 إلى 30 دقيقة. ولضمان التوازن التام لترسب TPS عند هذا التركيز العالي من الملح، اجمع DPS عن طريق الطرد المركزي بسرعة 20,000 GS لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة أربع درجات Celsius. أعد تعليق الراسب الذي يحتوي على DPS في Buffer تعليق Resus واضبط حجم العينة ليصل إلى 2.5 milliliters.أزل كبريتات الأمونيوم عن طريق تبادل المنظم باستخدام عمود ترشيح هلامي PD 10 تم موازنته مسبقاً بـ 25 milliliters من Resus suspension Buffer. ضع 2.5 milliliters من عينة DPS في أعلى عمود PD 10 واتركها لتمتص بالداخل، ثم تخلص من السائل المتدفق. اجمع DPS عن طريق الشطف بـ 3.5 milliliters من Resus suspension buffer centrifuge.تم تبديل منظم العينة عند 16,000 GS لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة أربع درجات مئوية. ولإزالة أي مكونات غير قابلة للذوبان، يتم تخفيف العينة بـ 6 إلى 10 ملليلتر من منظم التخفيف لضمان انخفاض تركيز الملح بما يكفي لـ DPS. وللربط بعمود SP SPHEROS، يتم تحميل العينة على عمود SP spheros fast flow سعة 30 ملليلتر تم موازنته مسبقاً باستخدام منظم SP.يتم الغسل باستخدام المنظم SP buffer A حتى تعود قيمة OD 280 إلى الخط القاعدي، مع التخلص من السائل النافذ. يُجرى تدرج خطي بحجم 150 milliliter من 0% إلى 100% من buffer B مع جمع كسور بحجم 2 milliliter. سوف يخرج DPS في قمة حادة عند حوالي 50%B، رغم أن حدوث تفاوت بنسبة 10% هو أمر وارد.افحص أجزاء الاستخلاص للتحقق من تلوث DNA عن طريق قياس نسبة OD 260 إلى OD 280. باستخدام مقياس الطيف الضوئي، يجب أن تكون النسبة عادةً حوالي 0.7 عند تشغيل أجزاء الاستخلاص على هلام SDS-PAGE بتركيز 15%. يجب أن يظهر الهلام حزمة واحدة فقط عند حوالي 19 kilodaltons.اجمع كسور DPS النقية بعد تركيز الـ DPS وتبديله إلى محلول تخزين منظم. باستخدام وحدة ترشيح طرد مركزي، قم بتقسيم الـ DPS المُنقى إلى حصص متساوية وجمدها في النيتروجين السائل للتخزين عند درجة حرارة 80- درجة مئوية. يتكون مقايسة الحماية الجينية من كواشف متعددة ومخططات مسببات أمراض معقدة.يُعد التحضير الدقيق للكواشف والتوقيت المحدد متطلباً أساسياً لضمان إمكانية تكرار النتائج. ويُنصح باستخدام جدول للماصات لتتبع الخطوات والأحجام أثناء هذا الإجراء. قم بقياس 30 milliliters من الماء في قارورة محكمة الإغلاق لإزالة الأكسجين من المحلول.قم بتطهير الماء بالنيتروجين لمدة 10 دقائق باستخدام إبرتين لمحاقن، واحدة في السائل والأخرى فوقه. أضف 0.0168 grams من كبريتات الحديدوز سباعية الهيدرات إلى الماء للحصول على محلول مخزون بتركيز two millimolar. أغلق القارورة بإحكام وقم بتطهيرها بالنيتروجين لمدة خمس دقائق إضافية.ثم اخلط المكونات. يجب أن يكون المحلول رائقاً؛ فإذا ظهر أي أثر للون الأصفر، قم بتحضير محلول حديد جديد. حضّر محلول بيروكسيد الهيدروجين بتركيز 100 millimolar واحفظه على الثلج بعيداً عن الضوء لتجنب التحلل التلقائي.استخدم محلول بيروكسيد الهيدروجين هذا لمدة تتراوح بين ساعة إلى ساعتين فقط بعد التحضير. اتبع تسلسلاً من DPS المنقى بسرعة في حمام مائي بدرجة حرارة الغرفة، ثم احفظه في جهاز طرد مركزي مبرد لمدة 10 ثوانٍ عند 4,000 GS في جهاز طرد مركزي صغير لترسيب التجمعات بعد عملية الطرد المركزي. قم بقياس التركيز باستخدام مقياس الطيف الضوئي، ثم خفف الـ DNA الخطي من مخزون عالي التركيز باستخدام محلول منظم للتفاعل بتركيز 12x للحصول على تركيز 100 nanograms per microliter، وانقل كمية كافية من الماء إلى أنابيب PCR بحيث يكون الحجم النهائي للتفاعل 12 microliters.بعد ذلك، قم بتحضير عينة مخزون من DNA ممزوج بـ DPS بحيث يكون التركيز النهائي لـ DPS هو 3 µM، ثم انقل خليط DNA-DPS باستخدام الماصة إلى أنابيب PCR. أما أنابيب التحكم، فيُضاف إليها DNA فقط. تُحضن العينات لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة للسماح لـ DPS بالارتباط بـ DNA. أضف كمية كافية من محلول كبريتات الحديدوز بتركيز 2 mM للوصول إلى التركيز المطلوب، ثم أضف سريعاً 1 µL من محلول بيروكسيد الهيدروجين بتركيز 100 mM للوصول إلى تركيز نهائي قدره 10 mM، وتُحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.للسماح بحدوث تفاعل التحلل بوساطة تفاعل فنتون، أضف 1 µL من مزيج SDS بتركيز 20% ثم حضّن عند 85 °C لمدة خمس دقائق لتفكيك معقدات D-P-S-D-N-A؛ حيث يعمل SDS على زعزعة استقرار معقد DPS DNA ويمنع حدوث إزاحات غير مرغوب فيها للحمض النووي DNA في الهلام، مما يسهل عملية التحديد الكمي. الآن، قم بالتحضين على الثلج لمدة دقيقة واحدة، ثم أضف صبغة التحميل وقم بالتحميل على هلام الأجاروز لإجراء الفصل الكهربائي، ثم صبغ DNA باستخدام بروميد الإيثيديوم بعد الفصل الكهربائي بدلاً من القيام بذلك قبله. وهذا يمنع SDS من التداخل مع توزيع بروميد الإيثيديوم في الهلام.تظهر هنا الخطوات المتوسطة لتنقية DPS التي تم تحليلها بواسطة SDS page. يمثل المسار الأول المستخلص الخالي من الخلايا. ويمثل المسار الثاني السائل المار عبر عمود DEAE SPHEROS.يمثل المسار الثالث الـ EIT لعمود DEAE. ويمثل المسار الرابع الراشح من عملية الترسيب باستخدام كبريتات الأمونيوم بتركيز 60%. أما المسار الخامس فيمثل عينة DPS بعد الترسيب بكبريتات الأمونيوم بتركيز 90% واستبدال المنظم بواسطة عمود PD 10.والمسار السادس يمثل كسور البروتين DPS النقية المجمعة بعد التنقية باستخدام عمود SP spheros. أما مؤشرات الوزن الجزيئي للبروتين فهي موجودة في المسار السابع.تشير النسب المئوية الموجودة أسفل كل مسار إلى نقاوة DPS كما تم تحديدها بواسطة برنامج تحليل الصور. وتعتبر عملية تنقية DPS الموضحة هنا قابلة للتكرار بشكل كبير، حيث تكون نقاوة البروتين باستمرار أعلى من 99%، ولا تظهر أي بروتينات أخرى كحزم مرئية على هلامات SDS page. يمكن استخدام DPS المنقى في مقايسة حماية DNA، والتي يحفز فيها الحديد تحلل بيروكسيد الهيدروجين عبر كيمياء Fenton، مما ينتج أنواعاً جذرية تسبب تلفاً مباشراً لـ DNA الموجود في التفاعل، وتظهر النتائج التمثيلية في هذا الشكل.تحتوي جميع المسارات على 100 nanograms من DNA خطي بطول five kilobase؛ حيث يحتوي المسار الأول على DNA فقط، ويحتوي المسار الثاني على DNA مع 1 millimolar من hydrogen peroxide، بينما يحتوي المسار الثالث على DNA مع 1 millimolar من hydrogen peroxide و166 micromolar من ferrous sulfate، ولكن الـ DNA قد تعرض للتحلل. وتحتوي المسارات من الرابع إلى الثامن على DNA مع 3 micromolar من DPSD dimer، و1 millimolar من hydrogen peroxide، وتركيزات متزايدة من الحديد من اليسار إلى اليمين.يتضح أن البروتين DPS يتوسط حماية DNA من التحلل التأكسدي من خلال المقارنة بين المسارين الثالث والخامس. كما يظهر بوضوح وجود زيادة إجمالية في تحلل DNA مع زيادة تركيز الحديد. ويمكن قياس النتائج التي تم الحصول عليها من خلال مقايسة حماية DNA باستخدام برنامج لمعالجة الصور مثل image quant.يوضح هذا الرسم البياني نتيجة هذا القياس الكمي كمتوسط لثلاث مقايسات. وتشير أشرطة الخطأ إلى المستوى العالي العام من قابلية التكرار التي تم الحصول عليها بمجرد إتقان الطريقة.يمكن تنفيذ هذه التقنية في غضون أربع ساعات تقريبًا لما يصل إلى 40 عينة، مما يسمح لك بتوصيف العديد من الظروف المختلفة بالتوازي. أثناء تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر تحضير الكواشف بدقة وتوقيت كل خطوة بأكبر قدر ممكن من الدقة. وبما أن المقايسة حساسة للغاية لأوقات الحضن، فبعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنتاج بروتين DPS عالي النقاء وتوصيفه في مقايسة في المختبر (in vitro) من أجل تحديد نشاطه في حماية DNA من التحلل بواسطة أنواع الأكسجين التفاعلية.

application-an-vitro-dna-protection-assay-to-visualize-stress

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

نفاذية الخلية crosslinker DSP [dithiobis - (succinimidyl بروبيونات)] تستقر تفاعلات عابرة...

عزل بروتين المجمعات المتعددة التي كتبها عطوب في الجسم الحي الشواهد الخلوية عبر ربط والمناعة المغناطيسي اللوني التقارب

يصف هذا البروتوكول طريقة لتصور على الحمض النووي المزدوج حبلا البروتين كسر إشارة تنشيط ردا على الحمض النووي من التلف وكذلك التوطين خلال الانقسام.

عامين والتصوير الثلاثي الابعاد لايف خلية من البروتينات DNA الاستجابة الأضرار

مقاومة الإجهاد هي واحدة من السمات المميزة لطول العمر وكما هو معروف أن تحكم وراثيا. هنا، قمنا بتطوير أسلوب الإنتاجية العالية متحيز للكشف عن الطفرات التي تمنح مقاومة الإجهاد في خلايا ES التي لتطوير نماذج الماوس للدراسات طول العمر.

المنهج الوراثي إلى الأمام للكشف عن الإجهاد الجينات المقاومة في الفئران - شاشة عالية الإنتاجية في خلايا ES

نقدم خطة وبروتوكولا استراتيجيا لتحديد المتغيرات الجينية غير المشفرة التي تؤثر على ربط الحمض النووي لعامل النسخ (TF). يتم توفير بروتوكول تجريبي مفصل لمقايسة تحول الحركة الكهربية (EMSA) وتحليل مقايسة ترسيب تقارب الحمض النووي (DAPA) لربط الحمض النووي TF المعتمد على النمط الجيني.

الكشف عن وظيفية غير الترميز المتغيرات الوراثية عن طريق الكهربي التنقل التحول الفحص (EMSA) والحمض النووي تقارب الهطول الفحص (ضبا)

نحن هنا وصف بروتوكول الأمثل من الفلورسنت فحوصات التنقل التحول الكهربي (fEMSA) باستخدام النقاء SOX-2 البروتينات مع الأشعة تحت الحمراء الفلورسنت المسمى صبغ تحقيقات الحمض النووي كدراسة حالة لمعالجة مسألة البيولوجي المهم.

بروتوكول الأمثل لالكهربي التنقل التحول الفحص عن طريق أليغنوكليوتيد] وصفت صبغ الأشعة تحت الحمراء نيون

وكثيرا ما تستخدم أشعة الليزر في دراسات الاستجابة الخلوية للتلف الحمض النووي. ومع ذلك، فإنها تولد الآفات التي تباعد، والتردد، والتصادم مع تكرار الشوك نادرا ما تتسم. هنا، نحن تصف النهج الذي تمكن من تحديد هذه المعايير مع الليزر المترجمة crosslinks interstrand.

واحدة تحليل جزيء من الليزر المترجمة السورالين Adducts

والهدف من هذا البروتوكول بالتحديد الكمي لإصلاح كروسلينكس الحمض النووي-البروتين محددة على بلازميد الحمض النووي. هي transfected lesioned البلازميدات في خطوط خلايا الثدييات المتلقية والوزن الجزيئي المنخفض تحصد في وقت متعددة النقاط تعداء بعد. حركية إصلاح الحمض النووي كمياً استخدام ملحق التمهيدي حبلا محددة يتبعها qPCR.

مقايسة بسيطة وسريعة، والكمية لقياس إصلاح الحمض النووي-البروتين كروسلينكس على البلازميدات Transfected في خلايا الثدييات

هنا ، نحن نميز استجابات الإجهاد البرودوسلي الخلوي في النيماتودا C. elegans من خلال قياس تنشيط المراسلين النسخ الفلوريو وحساسية الإجهاد الفسيولوجي.

قياسات استجابات الإجهاد الفسيولوجي في C. Elegans

يسلط هذا البروتوكول الضوء على طريقة معدلة للكشف عن الوصلات المتقاطعة لبروتين الحمض النووي (DPCs) وقياسها كميا وتعديلاتها اللاحقة للترجمة (PTMs) ، بما في ذلك الوجود في كل مكان ، و SUMOylation ، و ADP-ribosylation التي تسببها مثبطات توبويزوميراز والفورمالديهايد ، مما يسمح بدراسة تكوين وإصلاح DPCs و PTMs الخاصة بها.

الكشف الكمي عن الروابط المتقاطعة بين الحمض النووي والبروتين وتعديلاتها اللاحقة للترجمة

MSH2 - Msh6 مسؤولة عن الشروع في إصلاح أخطاء النسخ المتماثل في الحمض النووي. هنا نقدم مقاربة حركية عابرة نحو فهم كيفية عمل هذا البروتين الحرجة. ويوضح التقرير توقف تدفق التجارب لقياس الحمض النووي ملزمة تقترن الكامنة والحركية أتباز MSH2 - Msh6 آلية العمل في إصلاح الحمض النووي.

تطبيق أساليب حركية متوقف تدفق بالتحقيق في آلية عمل لإصلاح الحمض النووي من البروتين

تعلم تقنية الفحص في المختبر لتقييم دور بروتين Dps في حماية الحمض النووي من التلف التأكسدي باستخدام كيمياء فينتون والتنقية بالكروماتوغرافيا.

تطبيق على

استكشف المزيد من الفيديوهات