تقرير من خارج الخلية الميكروبية نشاط انزيم في المياه، والتربة، والرواسب باستخدام إنتاجية عالية صفيحة ميكروسكوبية فحوصات

الهدف العام من الإجراء التالي هو الفحص السريع لنشاط الإنزيم الميكروبي خارج الخلية في مجموعة متنوعة من البيئات الطبيعية. يتم تحقيق ذلك عن طريق إضافة عينات من الماء أو ملاط التربة إلى الصفيحة الدقيقة لإنتاج نسخ متماثل كاف كخطوة ثانية ، تتم إضافة الركيزة الملونة الاصطناعية أو الركيزة المترية الفلورية إلى آبار الصفيحة الدقيقة ، مما يسمح بحدوث تفاعلات إنزيمية. بعد ذلك ، يتم قياس الامتصاص أو التألق لتحديد كمية المنتج النهائي المنبعث أثناء التفاعل.

تظهر النتائج اختلافات في نشاط الإنزيم خارج الخلية بين العينات بناء على امتصاص أو تألق التفاعل النهائي. سنوضح اليوم كيفية قياس نشاط الإنزيم خارج الخلية في البيئات الطبيعية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في البيئة الميكروبية ، مثل معدلات المياه لمعالجة المواد العضوية وتمعدن المغذيات في التربة والرواسب والمياه بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في استخدام هذه الطريقة بسبب صعوبة فصل الجسيمات عن محلول التفاعل ، خاصة عند فحص أعداد كبيرة من العينات.

العرض المرئي لهذا الإجراء أمرا بالغ الأهمية حيث قد يكون من الصعب تعلم تخطيط اللوحة ويمكن أن يؤدي أخذ القياسات في خطوات زمنية متعددة إلى جعل هذا الإجراء أكثر صعوبة. يبدأ التحليل المتري للكول لنشاط الإنزيم خارج الخلية للتربة والرواسب بإعداد عازلة الركيزة والمحاليل القياسية كما هو موضح في بروتوكول النص للتربة ، وإعداد ملاط من كل عينة ليتم فحصها في أنبوب طرد مركزي معقم سعة 15 ملليلترا. أضف تركيزا يبلغ حوالي جرام واحد لكل مليلتر باستخدام 50 ملليمولار من الأسيتات للرواسب.

أضف ما يكفي من عازلة الأسيتات لجعل الملاط سهل الانبنائب. سيختلف الحجم الدقيق للملاط المطلوب وفقا لعدد الإنزيمات التي يتم فحصها ، ولكن يوصى بخمسة ملليلتر على الأقل. دوامة كل ملاط حتى تتشتت جميع كتل التربة أو الرواسب.

ولاحظ المجلد النهائي. قم بقص نهاية أطراف الماصة بالمقص قبل سحب العينات. نظرا لأن ملاط التربة تميل إلى انسداد الأطراف ، فقم بإعادة تدوير كل ملاط وقم على الفور بإدخال 150 ميكرولترا في كل من الآبار الستة.

على كتلة بئر عميقة 96. من المهم أن تدور بشكل جيد ومتكرر. من أجل الحفاظ على جزيئات التربة معلقة ، اترك بئرين على الأقل لكل كتلة فارغة لتكون بمثابة تحكم في الركيزة.

تحضير 1 96. كتلة حسنا لكل إنزيم ليكون فحصا. صب ما يقرب من خمسة ملليلتر من محلول الأسيتات في خزان ماصة واستخدم ماصة ثماني القنوات لإضافة 150 ميكرولترا من المخزن المؤقت إلى آخر بئرين من كل عينة.

لضوابط عينة عازلة واثنين من الركيزة التحكم في آبار. صب ما يقرب من 10 ملليلتر من محلول الركيزة p nitro أو PNP المناسب في خزان الماصة واستخدم ماصة ثماني القنوات لإضافة 150 ميكرولترا من محلول الركيزة إلى الآبار الأربعة الأولى من كل عينة وإلى بئري التحكم في الركيزة. لاحظ الوقت الذي يبدأ فيه التفاعل ، بمجرد إضافة محلول الركيزة.

احتضان الأطباق في درجة حرارة الغرفة لمدة 0.5 إلى أربع ساعات. سيختلف وقت الحضانة الدقيق اعتمادا على مستوى النشاط في العينات والإنزيم المراد فحصه. أثناء الحضانة ، قم بإعداد صفيحة دقيقة واحدة واضحة 96 جيدا.

لكل كتلة بئر عميقة من أجل قراءة ماصة الامتصاص ، 190 ميكرولتر من الماء المقطر و 10 ميكرولتر من هيدروكسيد الصوديوم المولي في كل بئر من الصفيحة الدقيقة. يعمل هيدروكسيد الصوديوم على إبطاء التفاعل الأنزيمي ويرفع درجة الحموضة ، مما يعزز لون PNP المنبعث أثناء التفاعل بعد الحضانة. الطرد المركزي 96 كتل الآبار عند 2000 إلى 5 ، 000 مرة G لمدة خمس دقائق لتحبيب جزيئات التربة.

يمكن أن تكون إزالة السائل دون إزعاج الحبيبات تحديا. يجب على المرء تجنب استخدام الكثير من عينات التربة في البداية. تأكد من استخدام أجهزة الطرد المركزي لفترة كافية واستخدم حركة دقيقة ولكن واثقة لسحب السائل.

استخدم ماصة متعددة القنوات لسحب 100 ميكرولتر من كل منها. حسنا ، الحرص على تجنب الحبيبات. انقل السائل إلى البئر المقابل على صفيحة دقيقة شفافة معدة 96 بئر قم بتشغيل قارئ Microplate وقم بإعداد أي امتصاص ضروري لسجل البرنامج عند 410 نانومتر بعد تحديد الكتلة الجافة للعينات كما هو موضح في بروتوكول النص ، وحساب الامتصاص النهائي لكل عينة عن طريق طرح امتصاص التحكم في العينة من امتصاص فحص العينة.

إذا كانت أدوات التحكم في الركيزة تتمتع بامتصاص عال أكبر من 0.060 ، فقم بطرحها. تابع أيضا حساب نشاط الإنزيم بالميكرومول في الساعة لكل جرام من الكتلة الجافة باستخدام هذه المعادلة. بعد تنظيم صفيحة دقيقة سوداء لكل إنزيم باتباع المثال الموضح في بروتوكول النص، اسكب ما يقرب من خمسة ملليلتر من عينة الماء الأولى في خزان الماصة واستخدم ماصة ثماني قنوات لماصة 200 ميكرولتر في جميع الآبار.

في العمود الأول من الصفيحة الدقيقة ، تخلص من أطراف الماصة المستخدمة وكرر ذلك حسب الحاجة لكل عينة ماء لملء الأعمدة من واحد إلى تسعة. قم بإعداد عناصر التحكم لحساب العينات والمعايير والركيزة والتبريد على نفس الصفيحة الدقيقة السوداء مثل العينات. تحتوي أدوات التحكم في العينة على عينة من الماء ومحلول بيكربونات ولا يتم استخدامها في حسابات النشاط ، ولكنها ستظهر اتساق القراءة طوال فترة التجربة.

تتكون أدوات التحكم في التبريد من عينة من الماء وكمية قياسية من علامة الفلورسنت وتستخدم لقياس حيود الفلورة. في عينة المياه ، تتكون الركيزة وأدوات التحكم القياسية إما من الركيزة المرتبطة أو علامة الفلورسنت القياسية على التوالي ومخزن البيكربونات. صب ما يقرب من خمسة ملليلتر من خمسة ملليمولار من المخزن المؤقت للبيكربونات في خزان ماصة نظيف.

ماصة 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت في آبار الصفيحة الدقيقة من واحد إلى تسعة في الصفوف d و e لتشكيل اثنين ، قم بتكرار آبار أدوات التحكم في العينة لكل عينة تغيير أطراف الماصة ، ثم نقل 200 ميكرولتر من عازلة البيكربونات إلى الآبار من 10 إلى 12 في الصفوف A و H ، على الرغم من أن الضوء يظل ساطعا في هذا العرض التوضيحي لأغراض التصوير ، يجب تقليل الإضاءة المحيطة عن طريق تعتيم أو إطفاء الأضواء لأن معيار الفلورسنت حساس للضوء. صب ما يقرب من خمسة ملليلتر من 10 ميكرومولار أو أربعة ميثيل أو ميتول في خزان ماصة نظيف ، وماصة 50 ميكرولتر في آبار صفيحة دقيقة من واحد إلى 12 في صف H.ثم قم بتقطيع 50 ميكرولترا في آبار من واحد إلى تسعة في الصفوف G و F لتشكيل ثلاث نسخ مكررة من أدوات التحكم في التبريد لكل عينة وعناصر التحكم القياسية الشاملة. إما أن تضع الصفيحة الدقيقة في الظلام أو تغطيتها بغطاء معتم لتقليل تدهور ضوء MUB ، وقم بتشغيل مقياس الفلورة وإعداد أي برنامج ضروري ليكون جاهزا للقراءة قبل إضافة الركيزة.

بالنسبة لما يقرب من خمسة ملليلتر من الركيزة المبطنة ب MUB المناسبة في خزان ماصة نظيف ، استخدم ماصة 12 قناة لماصة 50 ميكرولترا في آبار الصفيحة الدقيقة من واحد إلى 12 في الصف A وفي الآبار من واحد إلى تسعة في الصفين B و C لتشكيل ثلاثة فحوصات مكررة لكل عينة وثلاثة عناصر تحكم في الركيزة تشرع على الفور في تسجيل التألق. اقرأ التألق الأولي مباشرة بعد إضافة الركيزة إلى الصفيحة الدقيقة بعد القراءة. يحتضن التألق الصفيحة الدقيقة في درجة حرارة الغرفة إما في الظلام أو مغطاة بغطاء غير شفاف.

لتقليل تدهور الضوء في MUB. يعتمد وقت الحضانة المطلوب لقياس الحد الأقصى لنشاط الإنزيم المحتمل على تركيز الإنزيم داخل العينة. نظرا لأن هذا غير معروف ، قبل فحص العينة ، يجب قراءة الصفيحة الدقيقة في خطوات متعددة المباريات.

بالنسبة لمعظم الإنزيمات ، تكون الفواصل الزمنية من 10 إلى 15 دقيقة على مدار ساعة مناسبة ، على الرغم من أن بعض العينات ذات التركيزات العالية ستبلغ ذروتها قبل 10 دقائق. استمر في قراءة التألق في الصفيحة الدقيقة على فترات محددة لمدة ساعة على الأقل. تأكد من إبقاء الصفيحة الدقيقة مغطاة أو في الظلام بين القراءات.

لكل عينة في كل فترة زمنية ، احسب متوسط تألق العينة الأولي ، ومتوسط تألق العينة النهائي ، ومتوسط التألق القياسي ، ومتوسط تألق التحكم في التبريد لكل فاصل زمني. احسب نشاط الإنزيم بالمتر في الساعة لكل مليلتر. باستخدام المعادلة الموجودة في بروتوكول النص.

افحص قيم النشاط المحسوبة لكل خطوة زمنية ، وحدد النشاط المحتمل النهائي من الخطوة الزمنية ذات النشاط الأعلى. إذا استمرت قيم النشاط في الزيادة، فقد تكون هناك حاجة إلى خطوات زمنية لاحقة. إذا انخفضت قيم النشاط طوال فترة التشغيل، فقم بالتشغيل مرة أخرى بخطوات زمنية أقصر.

عادة ما تحتوي التربة والرواسب المائية على مستويات ملحوظة من نشاط الإنزيم خارج الخلية نتيجة للمجتمعات الميكروبية المرتبطة التي تنمو على سطح الجسيمات. يوضح هذا الشكل كيف يتغير هذا النشاط اعتمادا على حجم الجسيمات التي تم الحصول عليها من الرواسب السطحية لتيار من الدرجة الثالثة في شمال المسيسيبي. أظهرت دراسة سابقة ل USAA أن المجتمعات البكتيرية على جزيئات الرواسب من هذا التيار يمكن فصلها إلى ثلاث مجموعات متميزة بناء على التحليل الجزيئي لهيكل مجتمعها.

تلك الموجودة على جسيمات 0.063 ملليمتر، وتلك الموجودة على جسيمات 0.1 و2 و5 و0 0.25 و0.5 ملليمتر، وتلك الموجودة على جسيمات ملليمتر واحد. يدعم تحليل الأنماط في نشاط الإنزيم خارج الخلية هذا الاستنتاج مع تشابه الفوسفاتيز على جسيمات 0.1 و 2 5 و 0 0.25 و 0.5 ملم ، ولكنه أعلى بكثير على الكسور الواحدة و 0.063 ملم عند القياس باستخدام تقنية الركيزة المرتبطة ب PNP. تظهر الإنزيمات الأخرى مثل بيتا جلوكو و n AGAs قمما مماثلة على أجود الجسيمات ، ولكنها لا ترتفع على جزيئات ملليمتر واحد.

تسليط الضوء على حقيقة أن الإنزيمات المختلفة قد تظهر توزيعات بيئية مختلفة ويمكن توضيحها باستخدام هذا المقايس. تظهر أشرطة الخطأ المنخفضة نسبيا أن فحوصات متري الكول لنشاط الإنزيم على الرواسب قابلة للتكرار وبالتالي قابلة للتحليل الإحصائي. عند مقارنة العينات المختلفة والبيئية ، تميل المياه الطبيعية إلى أن يكون لها نشاط إنزيم خارج الخلية أقل لكل مليلتر من التربة أو الرواسب لكل جرام.

على هذا النحو ، يجب فحص النباتات متريا باستخدام ركائز مرتبطة ب MUB. يوضح هذا الشكل كيف يختلف نشاط الإنزيمات والفوسفاتيز وبيتا والجلوكو وNGAs باختلاف العمق. في بحيرة ضحلة في شمال ولاية ميسيسيبي بالولايات المتحدة الأمريكية ، من المعروف أن البحيرة فقيرة بالمغذيات ، وهو ما يقترحه أيضا النشاط العالي نسبيا للفوسفاتيز والإنزيم الذي تنتجه الكائنات الحية الدقيقة من أجل الحصول على الفوسفات من المركبات العضوية.

بالنسبة لجميع الإنزيمات الثلاثة ، أظهرت عينات الفحص التي تم جمعها على سطح الماء وعلى عمق 50 سم نشاطا مماثلا. في حين أن النشاط كان مرتفعا في العينة التي يبلغ طولها 100 سم ، فقد تم أخذ العينة بشكل أساسي من واجهة رواسب الماء ومن المحتمل أن يكون وجود جزيئات الرواسب في العينة يفسر النشاط العالي الذي شوهد في العينة ، خاصة بالنسبة لبيتا جلوكو و n AGAs. كما هو الحال مع ركائز PNP ، تظهر أشرطة الخطأ المنخفضة أنه حتى مع وجود ثلاث قراءات مكررة فقط ، فإن قابلية تكرار المقايسات المترية الفلورية باستخدام ركائز MUB عالية.

لاحظ أن وحدات نشاط إنزيم عينة الماء هي جزء من الركيزة المستهلكة ، في حين أن تلك الخاصة بنشاط الإنزيم على جزيئات الرواسب موجودة في ميكرومول من الركيزة المستهلكة على الرغم من أن حجم الوحدة يمكن مقارنته. هذا يسلط الضوء على حقيقة أن التربة والرواسب تميل إلى أن يكون لها نشاط خارج الخلية أعلى بكثير من المياه الطبيعية. كما يوضح الحساسية المتزايدة لتقنية الركيزة المرتبطة ب MUB وضرورة استخدام هذه التقنية لفحص نشاط الإنزيم خارج الخلية في عينات المياه بمجرد إتقانها.

يمكن استخدام هذه التقنية لفحص تسع عينات من المياه لما يصل إلى الإنزيمات في ما يزيد قليلا عن ساعة أثناء محاولة هذا الإجراء للتربة والرواسب. من المهم استخدام مادة ضخمة معروفة بحيث يمكن التعبير عن النشاط على أساس الوزن الجاف. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية قياس نشاط الإنزيم خارج الخلية ومجموعة متنوعة من البيئات الطبيعية باستخدام تقنيات قياس الألوان أو تقنيات القياس المنخفض.