تقرير من خارج الخلية الميكروبية نشاط انزيم في المياه، والتربة، والرواسب باستخدام إنتاجية عالية صفيحة ميكروسكوبية فحوصات

الهدف العام من الإجراء التالي هو المقايسة السريعة لنشاط الإنزيمات الميكروبية خارج الخلوية في مجموعة متنوعة من البيئات الطبيعية. ويتم تحقيق ذلك عن طريق إضافة عينات من المياه أو ملاط التربة إلى صفيحة ميكروية لضمان تكرار كافٍ. وكخطوة ثانية، تضاف ركيزة لونية أو فلورية اصطناعية إلى آبار الصفيحة الميكروية، مما يسمح بحدوث التفاعلات الإنزيمية. بعد ذلك، يتم قياس الامتصاصية أو الفلورية لتحديد كمية المنتج النهائي المنطلق خلال التفاعل.

تُظهر النتائج وجود اختلافات في نشاط الإنزيمات خارج الخلوية بين العينات بناءً على الامتصاصية أو الفلورة للتفاعل النهائي. سنقوم اليوم بتوضيح كيفية قياس نشاط الإنزيمات خارج الخلوية في البيئات الطبيعية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في علم البيئة الميكروبية، مثل معدلات معالجة المواد العضوية ومعدلات تمعدن العناصر الغذائية في التربة والرواسب والمياه. وبشكل عام، يواجه المبتدئون في استخدام هذه الطريقة صعوبة بسبب تعذر فصل الجزيئات عن محلول التفاعل، خاصة عند تحليل أعداد كبيرة من العينات.

يُعد العرض المرئي لهذا الإجراء أمراً بالغ الأهمية نظراً لصعوبة تعلم تخطيط الطبق، كما أن أخذ القياسات في خطوات زمنية متعددة قد يجعل هذا الإجراء أكثر تحدياً. يبدأ التحليل القياسي لنشاط الإنزيمات خارج الخلوية للتربة والرواسب بتحضير محلول منظم للركيزة ومحاليل قياسية كما هو موضح في البروتوكول النصي للتربة، قم بتحضير ملاط من كل عينة سيتم تحليلها في أنبوب طرد مركزي معقم سعة 15 milliliter. أضف تركيزاً يبلغ حوالي غرام واحد لكل milliliter باستخدام محلول منظم من الأسيتات بتركيز 50 millimolar للرواسب.

أضف كمية كافية من منظم الأسيتات لجعل المعلق سهل السحب بالماصة. سيختلف الحجم الدقيق للمعلق المطلوب وفقاً لعدد الإنزيمات التي سيتم تحليلها، ولكن يوصى بحد أدنى قدره خمسة مليلترات. استخدم جهاز الرج (Vortex) لكل معلق حتى تتشتت جميع تكتلات التربة أو الرواسب.

لاحظ الحجم النهائي. قم بقص طرف رؤوس الماصة باستخدام مقص قبل البدء بعملية السحب. وبما أن معلقات التربة تميل إلى سد الرؤوس، قم بإعادة تدوير كل معلق بجهاز الـ vortex ثم اسحب فوراً 150 µL وضعها في كل بئر من الآبار الستة.

على كتلة آبار عميقة مكونة من 96 بئراً. من المهم استخدام جهاز المزج الدوامي (vortex) بشكل جيد ومتكرر. ومن أجل الحفاظ على جزيئات التربة معلقة، اترك بئرين على الأقل في كل كتلة فارغتين لتعملا كعناصر تحكم في الركيزة.

قم بتحضير كتلة واحدة من 96 بئراً لكل إنزيم سيتم تحليله. صب حوالي خمسة ملليلترات من محلول أسيتات المنظم في خزان الماصة، واستخدم ماصة ثمانية القنوات لإضافة 150 µL من المحلول المنظم إلى آخر بئرين من كل عينة.

بالنسبة لعينات التحكم في محلول العينة وبئري التحكم في الركيزة. صب حوالي 10 milliliters من محلول p nitro fennel أو محلول ركيزة PNP المناسب في خزان الماصة، واستخدم ماصة ثمانية القنوات لإضافة 150 microliters من محلول الركيزة إلى أول أربعة آبار من كل عينة وإلى بئري التحكم في الركيزة. سجل الوقت عند بدء التفاعل، فور إضافة محلول الركيزة.

تُحضن الأطباق في درجة حرارة الغرفة لمدة تتراوح من 0.5 إلى أربع ساعات. وسيختلف وقت التحضين الدقيق بناءً على مستوى النشاط في العينات والإنزيم المراد تحليله. وأثناء تحضين المقاييس، يتم تحضير لوحة ميكروية شفافة ذات 96 بئراً.

لقياس الامتصاصية لكل كتلة من الآبار العميقة، يتم سحب 190 µL من الماء المقطر و10 µL من هيدروكسيد الصوديوم بتركيز 1 M وإضافتها إلى كل بئر في الصفيحة الدقيقة. يعمل هيدروكسيد الصوديوم على إبطاء التفاعل الإنزيمي ورفع قيمة pH، مما يعزز لون PNP المتحرر أثناء التفاعل بعد فترة الحضن. يتم وضع كتل الآبار الـ 96 في جهاز الطرد المركزي بسرعة تتراوح من 2000 إلى 5,000 ×g لمدة خمس دقائق لترسيب جزيئات التربة.

يمكن أن يمثل إزالة السائل دون تعكير الراسب تحديًا. يجب تجنب استخدام كمية كبيرة جدًا من عينة التربة في البداية. تأكد من إجراء عملية الطرد المركزي لفترة كافية، واستخدم حركة حذرة ولكن واثقة لسحب السائل.

استخدم ماصة متعددة القنوات لسحب 100 µL من كل بئر، مع الحرص على تجنب الراسب. انقل السائل إلى البئر المقابل في لوح ميكروي شفاف مجهز بـ 96 بئراً، ثم قم بتشغيل قارئ الألواح الميكروية وإعداد أي برمجيات ضرورية. سجل الامتصاصية عند 410 nm، وبعد تحديد الكتلة الجافة للعينات كما هو موضح في البروتوكول النصي، احسب الامتصاصية النهائية لكل عينة عن طريق طرح امتصاصية عينة الضبط من امتصاصية تحليل العينة.

إذا كانت ضوابط الركيزة ذات امتصاصية عالية تزيد عن 0.060، فقم بطرح تلك القيم. ثم انتقل إلى حساب نشاط الإنزيم بالميكرومول في الساعة لكل جرام من الكتلة الجافة باستخدام هذه المعادلة. وبعد تنظيم صفيحة ميكروية سوداء لكل إنزيم وفقاً للمثال الموضح في البروتوكول النصي، صُب حوالي خمسة مليلترات من عينة المياه الأولى في خزان الماصة واستخدم ماصة ثمانية القنوات لسحب 200 µL وتوزيعها في جميع الآبار.

في العمود الأول من لوحة المعايرة الدقيقة (Microplate)، تخلص من رؤوس الماصات المستخدمة وكرر العملية حسب الحاجة لكل عينة مياه لملء الأعمدة من الواحد إلى التاسع. قم بإعداد الضوابط لمراعاة العينات والمعايير والركيزة والإخماد في نفس لوحة المعايرة الدقيقة السوداء المستخدمة للعينات. تحتوي ضوابط العينات على مياه العينة ومحلول بيكربونات منظم، ولا تُستخدم في حسابات النشاط، ولكنها ستوضح اتساق القراءات طوال فترة التجربة.

تتكون ضوابط الإخماد من مياه العينة وكمية قياسية من الوسم الفلوري، وتُستخدم لقياس حيود الفلورة. يتم تحضير ضوابط مياه العينة والضوابط القياسية إما باستخدام الركيزة المرتبطة أو الوسم الفلوري القياسي على التوالي مع محلول بيكربونات منظم. صب حوالي 5 mL من محلول بيكربونات منظم بتركيز 5 mM في خزان ماصة نظيف.

قم بسحب 50 µL من المحلول المنظم باستخدام الماصة ووضعها في آبار الصفيحة الدقيقة من 1 إلى 9 في الصفين d وe لتشكيل بئرين مكررين من ضوابط العينة لكل عينة، ثم قم بتغيير رؤوس الماصة، وانقل بعد ذلك 200 µL من محلول بيكربونات منظم إلى الآبار من 10 إلى 12 في الصفين A وH. وبالرغم من إبقاء الإضاءة ساطعة في هذا العرض لأغراض التصوير، يجب تقليل الإضاءة المحيطة عن طريق تخفيت الأنوار أو إطفائها لأن المعيار الفلوري حساس للضوء. صُب ما يقرب من 5 mL من 10 µM من 4-methylumbelliferone أو MUB في خزان ماصة نظيف، ثم اسحب 50 µL وضعها في آبار الصفيحة الدقيقة من 1 إلى 12 في الصف H. بعد ذلك، اسحب 50 µL وضعها في الآبار من 1 إلى 9 في الصفين G وF لتشكيل ثلاث مكررات من ضوابط الإخماد لكل عينة وضوابط معيارية عامة. ضع الصفيحة الدقيقة في الظلام أو غطِّها بغطاء معتم لتقليل تحلل MUB بفعل الضوء، ثم قم بتشغيل مقياس الفلورية وإعداد أي برامج ضرورية لتكون جاهزة للقراءة قبل إضافة الركيزة.

صب حوالي خمسة ملليلتر من الركيزة المبطنة بـ MUB المناسبة في خزان ماصة نظيف، واستخدم ماصة ذات 12 قناة لسحب 50 ميكرولتر وتوزيعها في آبار اللوحة الدقيقة من 1 إلى 12 في الصف A، وفي الآبار من 1 إلى 9 في الصفين B وC لتشكيل ثلاثة مقاييس مكررة لكل عينة وثلاثة ضوابط للركيزة، ثم ابدأ فوراً في تسجيل الفلورة. اقرأ الفلورة الأولية مباشرة بعد إضافة الركيزة إلى اللوحة الدقيقة، وبعد القراءة، قم بحضن اللوحة الدقيقة في درجة حرارة الغرفة إما في الظلام أو مغطاة بغطاء عاتم.

لتقليل التحلل الضوئي لـ MUB. سيعتمد وقت الحضن المطلوب لقياس أقصى نشاط إنزيمي محتمل على تركيز الإنزيم داخل العينة. وبما أن هذا التركيز غير معروف، فإنه يجب قراءة اللوح الدقيق في فترات زمنية متعددة قبل تحليل العينة.

بالنسبة لمعظم الإنزيمات، تعد الفواصل الزمنية التي تتراوح بين 10 إلى 15 دقيقة على مدار ساعة واحدة مناسبة، على الرغم من أن بعض العينات ذات التركيزات العالية ستصل إلى الذروة قبل مرور 10 دقائق. استمر في قراءة الفلورة في الطبق الدقيق عند الفواصل الزمنية المحددة لمدة ساعة واحدة على الأقل. تأكد من إبقاء الطبق الدقيق مغطى أو في الظلام بين القراءات.

لكل عينة في كل فاصل زمني، احسب متوسط الفلورة الأولية للعينة، ومتوسط الفلورة النهائية للعينة، ومتوسط الفلورة القياسية، ومتوسط فلورة تحكم الإخماد لكل فاصل زمني. احسب نشاط الإنزيم بـ m لكل ساعة لكل مليلتر، وذلك باستخدام المعادلة الواردة في البروتوكول النصي.

افحص قيم النشاط المحسوبة لكل خطوة زمنية، وحدد النشاط المحتمل النهائي من الخطوة الزمنية التي سجلت أعلى نشاط. إذا استمرت قيم النشاط في الزيادة، فقد يلزم استخدام خطوات زمنية لاحقة. أما إذا انخفضت قيم النشاط طوال فترة التشغيل، فأعد التشغيل باستخدام خطوات زمنية أقصر.

عادةً ما تحتوي التربة والرواسب المائية على مستويات ملموسة من نشاط الإنزيمات خارج الخلوية نتيجة لنمو المجتمعات الميكروبية الملتصقة على أسطح الجزيئات. يوضح هذا الشكل كيف يتغير هذا النشاط اعتمادًا على حجم الجزيئات التي تم الحصول عليها من الرواسب السطحية لمجرى مائي من الدرجة الثالثة في شمال ميسيسيبي، الولايات المتحدة الأمريكية. وقد أظهرت دراسة سابقة أن المجتمعات البكتيرية الموجودة على جزيئات الرواسب في هذا المجرى المائي يمكن تقسيمها إلى ثلاث مجموعات متميزة بناءً على التحليل الجزيئي لبنية مجتمعاتها.

تلك الموجودة على جزيئات بحجم 0.063 مليمتر، وتلك الموجودة على جزيئات بحجم 0.1 2 5 و 0 0.25 و 0.5 مليمتر، وتلك الموجودة على جزيئات بحجم واحد مليمتر. ويدعم تحليل أنماط نشاط الإنزيمات خارج الخلية هذا الاستنتاج، حيث كان نشاط الفوسفاتيز متشابهاً في الجزيئات بحجم 0.1 2 5 و 0 0.25 و 0.5 مليمتر، ولكنه كان أعلى بكثير في أجزاء الواحد مليمتر و 0.063 مليمتر عند القياس باستخدام تقنية الركيزة المرتبطة بـ PNP. أما الإنزيمات الأخرى مثل beta glucco و n AGAs، فقد أظهرت قممًا مماثلة في أدق الجزيئات، ولكنها لم تكن مرتفعة في جزيئات الواحد مليمتر.

تسليط الضوء على حقيقة أن الإنزيمات المختلفة قد تظهر توزيعات بيئية متباينة، والتي يمكن توضيحها باستخدام هذا المقايسة. وتظهر أشرطة الخطأ المنخفضة نسبياً أن المقايسات اللونية لنشاط الإنزيم في الرواسب قابلة للتكرار، وبالتالي فهي صالحة للتحليل الإحصائي. وعند مقارنة عينات بيئية مختلفة، تميل المياه الطبيعية إلى امتلاك نشاط إنزيمي خارج خلوي لكل مليلتر أقل مما تمتلكه التربة أو الرواسب لكل جرام.

وبناءً على ذلك، يجب تحليلها فلورومترياً باستخدام ركائز مرتبطة بـ MUB. يوضح هذا الشكل كيف يتباين نشاط إنزيمات الفوسفاتاز، وبيتا جلوكوزيداز، و NGAs مع العمق. وفي بحيرة ضحلة في شمال ميسيسيبي، الولايات المتحدة الأمريكية، من المعروف أن البحيرة فقيرة بالمغذيات، وهو ما يشير إليه أيضاً النشاط المرتفع نسبياً للفوسفاتاز والإنزيمات التي تنتجها الكائنات الحية الدقيقة من أجل الحصول على الفوسفات من المركبات العضوية.

بالنسبة للإنزيمات الثلاثة، أظهرت عينات المقايسة التي جُمعت من سطح الماء وعلى عمق 50 سنتيمتر نشاطاً متماثلاً. وبينما ارتفع النشاط في عينة الـ 100 سنتيمتر، فإن هذه العينة قد أُخذت أساساً من الواجهة الفاصلة بين الماء والرواسب، ومن المرجح أن وجود جزيئات الرواسب في العينة يفسر النشاط العالي الملاحظ، خاصة بالنسبة لـ beta glucco و n AGAs. وكما هو الحال مع ركائز PNP، فإن أشرطة الخطأ المنخفضة تشير إلى أن قابلية التكرار للمقايسات الفلورية باستخدام ركائز MUB عالية، حتى مع وجود ثلاث قراءات مكررة فقط.

لاحظ أن وحدات نشاط الإنزيم في عينة المياه هي نانومول من الركيزة المستهلكة، بينما وحدات نشاط الإنزيم على جزيئات الرواسب هي ميكرومول من الركيزة المستهلكة، على الرغم من أن المقارنة لكل وحدة حجم متقاربة. ويسلط هذا الضوء على حقيقة أن التربة والرواسب تميل إلى امتلاك نشاط خارج خلوي أعلى بكثير من المياه الطبيعية. كما يوضح ذلك الحساسية المتزايدة لتقنية الركيزة المرتبطة بـ MUB وضرورة استخدام هذه التقنية لتقدير نشاط الإنزيم خارج الخلوي في عينات المياه بمجرد إتقانها.

يمكن استخدام هذه التقنية لتحليل تسع عينات مائية للكشف عن الإنزيمات في غضون ساعة بقليل. وعند محاولة تطبيق هذا الإجراء على التربة والرواسب، من المهم استخدام مادة ذات كتلة معروفة حتى يمكن التعبير عن النشاط على أساس الوزن الجاف. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يتكون لديك فهم جيد لكيفية قياس نشاط الإنزيمات خارج الخلية في مجموعة متنوعة من البيئات الطبيعية باستخدام تقنيات القياس اللوني أو الفلوري.