A المنهج المقارن لتوصيف المشهد من المضيف الممرض البروتين البروتين التفاعلات

الهدف العام من التجربة التالية هو إجراء دراسات ectomic لمقارنة ملفات تعريف التفاعل للبروتينات من متغيرات مسببات الأمراض المختلفة مقابل مجموعة مشتركة من العوامل الخلوية. يتم تحقيق ذلك من خلال الخميرة القائمة على التزاوج ، وهما فحوصان هجينان ل CDNA لتحديد الشركاء المتفاعلين المحتملين للبروتينات من متغيرات مسببات الأمراض المختلفة. كخطوة ثانية ، يتم تسلسل إطارات القراءة المفتوحة للشركاء المتفاعلين ونقلها إلى متجهات متوافقة لمزيد من التحقق من الصحة.

بعد ذلك ، يتم اختيار مجموعة من الشركاء الفرديين الخرجين من جميع الفحوصات الهجينة وإعادة اختبارها لتفاعلهم مع المجموعة الكاملة من السلالات المدروسة. يتم ذلك باستخدام مقايسة تكميل جزء البروتين القائم على لوسيفيراز متعامد المفاصل والتي يتم إجراؤها في خلايا الثدييات من أجل توفير مجموعات بيانات تفاعل مقارن قوية. تظهر النتائج شدة تفاعل مختلفة بين بروتينات العامل الممرض والبروتينات الخلوية بناء على مقاييس اللوسيفيراز التي تم الحصول عليها ، وبالتالي توفر نظرة عامة مقارنة على تفاعلات بروتين البروتين المضيف العامل الممرض.

تربط معالجة ملفات تعريف التفاعل عن طريق التجميع الهرمي تفاعلات مسببات الأمراض المضيفة المحددة مع السمات المرضية وتعطي رؤى حول مشاركة بروتينات مسببات الأمراض في التسبب في المرض. الميزة الرئيسية لهذا النهج على الطرق الأخرى التي ترسم خرائط تفاعلات بروتين البروتين المضيف لمسببات الأمراض هي أنه يوفر مجموعة بيانات تفاعل مقارن صارمة بين متغيرات السلالات المتعددة. توفر هذه التقنيات نظرة ثاقبة لشبكة تفاعل بروتين العامل الممرض ، ولكن يمكن أيضا تطبيقها على أنظمة أخرى كجزيء معدي باستخدام فيروسات كاملة وعلم الوراثة الأنهار ، على سبيل المثال ، ابدأ هذا البروتوكول بالتزاوج ونشر خلايا الخميرة كما هو موضح في بذرة البروتوكول المكتوبة.

30 مل من وسط التسرب الانتقائي الذي يفتقر إلى التربتوفان مع عدد قليل من مستعمرات سلالة الخميرة AH 1 0 9 التي تحولت مع بلازميد P-G-B-K-T السبعة الذي يعبر عن البروتين الممرض. احتضان 30 ساعة عند 30 درجة مئوية مع الدوران. البذرة التالية ، 200 مل من متوسط التسرب الانتقائي مطروحا منه التربتوفان مع 30 مل من AH 1 0 9.

تحتضن الثقافات بالتناوب لمدة 20 ساعة عند 30 درجة مئوية. أيضا ، حولت مكتبة CDNA للاحتضان Y 187 في 20 مل من غراء YP لمدة 10 دقائق عند 30 درجة مئوية مع الدوران. ثم يقوم الطرد المركزي بحجم PG BK T سبعة محول ثقافة AH 109 المقابلة لكمية مكافئة من خلايا الخميرة Y 187 القابلة للحياة لمدة خمس دقائق عند 3 ، 500 دورة في الدقيقة و 20 درجة مئوية.

اسحب بعناية المادة الطافية و Resus يعلق الحنك في 10 مل من غراء YP. امزج الخميرة المعلقة AH 109 مع المكتبة التي تحتوي على Y 187. انقله إلى أنبوب سعة 50 مليلتر قبل الطرد المركزي لمدة خمس دقائق عند 3 و 500 دورة في الدقيقة و 20 درجة مئوية.

بعد سحب Super dat Resus بعناية ، قم بتعليق الحبيبات في غراء YP للحصول على إجمالي 1.5 ملليلتر. بعد ذلك ، انشر الخميرة على ثلاثة أجار YCM ، 150 ملم بمعدل 0.5 مل لكل طبق واحتضان 4.5 ساعة عند 30 درجة مئوية. اجمع الخميرة المتزاوجة من ألواح YCM عن طريق كشطها بزجاج أشعل النار في 10 ملليلتر من وسط التسرب الانتقائي مطروحا منه الليوسين والتربتوفان والهيستيدين.

اشطف اللوحة مرتين بخمسة ملليلتر من نفس الوسط وحمام السباحة بعد الطرد المركزي لمدة خمس دقائق عند 3 ، 500 دورة في الدقيقة و 20 درجة مئوية. تخلص من المادة الطافية والريس. حبيبات الخميرة في خمسة ملليلتر من وسط التسرب الانتقائي مطروحا منه الليوسين والتربتوفان والهيستيدين.

ثم انشر الخميرة المتزاوجة على 10 أطباق من أجار التسرب الانتقائي مطروحا منه الليوسين والتربتوفان والهيستامين مع التركيز المناسب لثلاثة تريازول أمينو أو ثلاثة على النحو المحدد في اختبار التنشيط التلقائي. احسب معدل ثنائي الصبغيات كما هو موضح في البروتوكول المكتوب بعد الحضانة عند 30 درجة مئوية في جو مرطب لمدة ستة إلى 10 أيام. اختر مستعمرات الخميرة وانقلها إلى أطباق محضرة طازجة من أجار التسرب الانتقائي مطروحا منه الليوسين والتربتوفان والهيستيدين بالإضافة إلى ثلاثة أ ر.

اطلب الخميرة في مخطط من ثمانية ممرات من 12 بئرا تعيد إنتاج صفيحة 96 بئر بحيث يكون من الأسهل في وقت لاحق التسلسل. دع مستعمرات الخميرة تنمو لمدة أربعة إلى خمسة أيام عند 30 درجة مئوية في جو رطب. الهدف من هذا القسم هو تفاعل البوليميراز المتسلسل ، وتضخيم CDNA الموجود في PA ct اثنين من ناقلات مستعمرات الخميرة المحللة المزروعة على أجار انتقائي للتسرب ناقص ألواح الليوسين والتريتوفان والهيستيدين.

ابدأ بوضع لوحة PCR سعة 96 بئرا على الجليد لتحلل خلايا الخميرة عند 50 ميكرولتر لكل بئر من محلول xmal 20 T. أعد تعليق مستعمرة واحدة برفق لكل بئر. احتضن الطبق لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 15 دقيقة عند 95 درجة مئوية.

بعد وضع اللوحة مرة أخرى على الجليد ، أضف 50 ميكرولترا من الماء المقطر لكل مزيج بئر عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل ، واستمر في جهاز الطرد المركزي لمدة خمس دقائق عند 3،500 دورة في الدقيقة وأربع درجات مئوية. بعد تحضير مزيج X tacck كما هو موضح في بروتوكول النص ، قم بتوزيع 40 ميكرولترا من المزيج لكل بئر في لوحة PCR سعة 96 بئر. أضف 10 ميكرولترات من الخميرة المحللة لكل بئر وقم بإجراء التضخيم كما هو موضح في بروتوكول النص.

قم بتشغيل ثلاثة ميكرولترات من منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل على جل agros بنسبة 1.2٪ للكشف عن المستنسخة الإيجابية ل PCR. تسلسل شظايا تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل معزولة من استنساخه الثلاثة الإيجابية. ثم قم بإجراء تحليل انفجار لتحديد إطارات القراءة الخلوية المفتوحة ، وتجاهل محاذاة الثقة المنخفضة بالإضافة إلى إزاحة الإطارات ورمز التوقف المبكر على التسلسلات المحتوية قبل تعداء الخلية.

انقل إطارات القراءة المفتوحة لبروتين العامل الممرض والبروتين الخلوي إلى نواقلهما الخاصة لتوليد بروتينات مدمجة في شظايا Gaia luciferase كما هو مفصل في بذور البروتوكول النصي 2 9 3 خلايا T عند 350،000 خلية لكل مليلتر من DMEM مع 10٪ مصل بقري جنيني بدون مضاد حيوي. وزعي 100 ميكرولتر لكل بئر في ألواح استزراع بيضاء معقمة قبل النمو لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون في اليوم التالي. تستخدم الخلايا الشفافة التي تستخدم أي بروتوكول تعداء مناسب 100 نانوجرام لكل بئر من كل من العامل الممرض وإطار القراءة المفتوح للمضيف يبني 10 نانوجرام لكل بئر من CMV اليراع لوسيفيراز البلازميد للتطبيع من أجل كفاءة التعداد.

يتم اختبار كل نقطة في مزيج نقل نقل ثلاثي النسخ إلى ألواح خلايا 2 9 3 T المستنبتة. احرص على إيداع مزيج الحمض النووي برفق على الخلايا لأن 2 9 3 خلايا T ليست ملتصقة بشدة ويمكن فصلها بسهولة عن قاع البئر ، واحتضان في حاضنة زراعة الخلايا لمدة 24 إلى 30 ساعة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ خلايا غسيل ثاني أكسيد الكربون مع PBS عند 100 ميكرولتر لكل بئر. أضف 40 ميكرولترا من تحلل الفانيليا ، وقم باحتضانها لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

تحت التحريض ، حفظ 10 ميكرولتر من محللات الخلايا في صفيحة بيضاء أخرى للجرعة اللاحقة من لوسيفيراز اليراع المخزنة أربع درجات مئوية أو بدلا من ذلك عند سالب 20 درجة مئوية مع سقف لقياس نشاط Gaia. ضع اللوحة في مقياس إضاءة وحقن 100 ميكرولتر من كاشف فحص لوسيفيراز الفانيليا على محللات الخلية. ثم عد اللمعان لمدة 10 ثوان.

تستغرق جرعة 96 لوحة بئر حوالي نصف ساعة. دائما استخدام مقتطفات طازجة لأن التجميد أو التخزين طويل الأجل قد يؤثر على تفاعل بوساطة نشاط غايا على المتبقية 10 مقتطفات خلية ميكرولتر. حقن 50 ميكرولترا من كاشف فحص لوسيفيراز اليراع على محللات الخلية باستخدام مقياس الإضاءة وعد اللمعان لمدة 10 ثوان.

جرعة 96 لوحة بئر يستغرق حوالي نصف ساعة لكل تفاعل. احسب النسبة بين نشاط Gaia luciferase ونشاط لوسيفيراز اليراع للحصول على قيمة تلألؤ GAIA طبيعية. مع مراعاة كفاءة التعداء وقابلية الخلية للحياة.

احسب متوسط النسخ الثلاثية لمراقبة التفاعل. قم بتقدير نسبة التلألؤ الطبيعية أو NLR لكل زوج مضيف من مسببات الأمراض. للقيام بذلك ، قسم نشاط تلألؤ GAIA الطبيعي الذي تم اكتشافه في وجود كل من البروتينات المسببة للأمراض والمضيف على مجموع الأنشطة المقاسة في آبار التحكم.

تقدير قيمة قطع NLR للتفاعلات الإيجابية في دراسة سابقة بحوالي 3.5. تكمن إحدى نقاط القوة الرئيسية لمبادئ GIA عالية الإنتاجية ، أو مقايسة تكميل البروتين ، أو H-T-G-P-C-A في حساسيتها العالية كما يتضح من تقييم المعدلات الإيجابية والسلبية الكاذبة لبروتين HPVE الثاني لتحديد المعدل السلبي الخاطئ. تم تقييم التفاعلات المعروفة ل E اثنين من فيروس الورم الحليمي البشري 16 بواسطة H-T-G-P-C-A لم يتم استرداد أربعة من أصل 18 تفاعلا يتوافق مع معدل سلبي كاذب بنسبة 22٪.

تم قياس التفاعلات الإيجابية الخاطئة لتكون 5.8٪ باستخدام 12 بروتين HPVE ضد مجموعة عشوائية من البروتينات الخلوية. يتم تسليط الضوء على الخصوصية القوية للطريقة في هذا الشكل الذي يوضح أن طفرة نقطة واحدة معروفة بالتداخل مع ارتباط E اثنين بشريكها الخلوي BRD أربعة تقضي ، نسبة NLR. تم تطبيق هذا النهج الصوتي المقارن واسع النطاق مؤخرا بنجاح على ثلاثة بروتينات مبكرة من فيروسات الورم الحليمي البشري ، E two و E ستة و E سبعة ، نشأت من أنماط وراثية مختلفة ، تمثل تنوعها الطبيعي في المناطق الاستوائية والأمراض لكل بروتينات من البروتينات المبكرة.

التجميع الهرمي لملفات تعريف التفاعل ، يلخص في الغالب نسالة فيروس الورم الحليمي البشري مما يثبت متانة النهج ومجموعة بيانات التفاعل. يمكن استخدامه لربط ملفات تعريف تفاعل مضيف الفيروس المحددة بالسمات المرضية ، وبالتالي إعطاء أدلة على تورط البروتينات الفيروسية. في التسبب في المرض ، يمكن استخراج التفاعلات الخاصة بالنمط الجيني ، والتي من المحتمل أن تتوافق مع الانتواء أو المؤشرات الحيوية المسببة للأمراض.

كما هو موضح هنا بالنسبة لستة شركاء متفاعلين ، تم فرز الأهداف الخلوية بناء على شدة التفاعل وتجميعها وفقا لنوع فيروس الورم الحليمي البشري المتفاعل. يسمح هذا التمثيل بتحديد المؤشرات الحيوية المحددة مثل البدعة ، والتي تتفاعل فقط مع البروتينات الستة E من فيروس الورم الحليمي البشري المسرطن. يجب أن يكون هذا الاستهداف حاسما للسمة المسببة للسرطان لجميع فيروس الورم الحليمي البشري المسرطن ، وبالتالي يشكل مرشحا جيدا لاستخدامه إما كعلامة بديلة لعدوى فيروس الورم الحليمي البشري أو كهدف علاجي.

باتباع هذا الإجراء. يمكن تكييف H-T-G-P-C-A لاستخدامه مع بروتين ثالث يتم التعبير عنه على أنه اندماج مع علامة البيوتين. يسمح ذلك بالتقاط ثلاثة مجمعات شريكة على ألواح ألوان الغوص العقدية ، وهذا يمكن أن يجيب على سؤال تكوين مجمعات البروتين الكبيرة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية توصيف مسببات الأمراض ، وتفاعلات وعاء المضيف. ثالثا ، من خلال استكشاف شركاء التفاعل لمتغيرات السلالات المتعددة. ثانيا ، من خلال مقارنة تفاعلها مع مجموعة كاملة من أنواع مسببات الأمراض باستخدام مدة بروتين البروتين ، على سبيل المثال في خلايا الثدييات.