A المنهج المقارن لتوصيف المشهد من المضيف الممرض البروتين البروتين التفاعلات

الهدف العام من التجربة التالية هو إجراء دراسات خارج الجسم الحي لمقارنة ملفات التفاعل لبروتينات من سلالات ممرضة مختلفة مقابل مجموعة مشتركة من العوامل الخلوية. ويتم تحقيق ذلك من خلال عمليات مسح ثنائية الهجين في الخميرة تعتمد على التزاوج لـ CDNA لتحديد الشركاء المتفاعلين المحتملين لبروتينات من سلالات ممرضة مختلفة. وكخطوة ثانية، يتم تسلسل أطر القراءة المفتوحة للشركاء المتفاعلين ونقلها إلى ناقلات متوافقة لإجراء المزيد من التحقق.

بعد ذلك، يتم اختيار مجموعة من الشركاء الفرديين الناشئين من كلا الفحصين الهجينين وإعادة اختبار تفاعلهم مع النطاق الكامل للسلالات المدروسة. يتم ذلك باستخدام مقايسة تكملة شظايا البروتين القائمة على اللوسيفيراز (luciferase) والمتعامدة (orthogonal gia)، والتي تُجرى في خلايا ثديية من أجل توفير مجموعات بيانات تفاعلية مقارنة وقوية. تُظهر النتائج شدات تفاعل مختلفة بين بروتينات الممرض والبروتينات الخلوية بناءً على قياسات اللوسيفيراز التي تم الحصول عليها، وبالتالي توفر نظرة عامة مقارنة على التفاعلات البروتينية-البروتينية بين الممرض والمضيف.

تؤدي معالجة ملفات التفاعل عن طريق التجميع الهرمي إلى ربط تفاعلات محددة بين المضيف والممرض بالسمات المرضية، وتوفر رؤى حول دور بروتينات الممرض في عملية الإمراض. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذا النهج مقارنة بالطرق الأخرى التي ترسم خرائط تفاعلات البروتين-بروتين بين الممرض والمضيف في أنه يوفر مجموعة بيانات تفاعلية مقارنة وصارمة بين عدة متغيرات من السلالات. توفر هذه التقنيات رؤية لشبكة تفاعلات بروتين الممرض، ولكن يمكن تطبيقها أيضًا على أنظمة أخرى كجزيئات معدية باستخدام الفيروسات الكاملة وعلم الوراثة العكسي، على سبيل المثال. ابدأ هذا البروتوكول بتزاوج ونشر خلايا الخميرة كما هو موضح في قسم البذور في البروتوكول المكتوب.

30 ملليلتر من الوسط الانتقائي الناقص التربتوفان الذي يحتوي على عدد قليل من مستعمرات سلالة خميرة AH 1 0 9 المحولة بـ البلازميد P-G-B-K-T سبعة الذي يعبر عن بروتين الممرض. يتم الحضن لمدة 30 ساعة عند 30 درجة مئوية مع التدوير. بعد ذلك، يتم تلقيح 200 ملليلتر من الوسط الانتقائي الناقص التربتوفان باستخدام الـ 30 ملليلتر من سلالة AH 1 0 9.

تُحضن المزارع مع التدوير لمدة 20 ساعة عند 30 درجة مئوية. كما يتم تحضن مكتبة cDNA التي تم تحويلها في سلالة Y 187 في 20 ملليلتر من YP glue لمدة 10 دقائق عند 30 درجة مئوية مع التدوير. بعد ذلك، يتم طرد مركزي لحجم من مزرعة pGBKT7 التي تم تحويلها في سلالة AH 109، بما يعادل كمية الخلايا الحية من خميرة Y 187، لمدة خمس دقائق عند 3,500 RPM و 20 درجة مئوية.

قم بسحب السائل الطافي بعناية وأعد تعليق الراسب في 10 milliliters من YP glue. اخلط خميرة AH 109 المعاد تعليقها مع المكتبة الموجودة في Y 187. انقل المزيج إلى أنبوب سعة 50 milliliter قبل الطرد المركزي لمدة خمس دقائق بسرعة 3, 500 RPM وعند درجة حرارة 20 degrees Celsius.

بعد سحب الـ super dat Resus بعناية، قم بتعليق الراسب في YP glue للحصول على إجمالي 1.5 milliliters. بعد ذلك، قم بتوزيع الخميرة على ثلاث أطباق YCM agar بقطر 150 millimeter بمعدل 0.5 milliliters لكل طبق، واحضنها لمدة 4.5 hours عند 30 °C. اجمع الخميرة المتزاوجة من أطباق YCM عن طريق الكشط باستخدام rake glass في 10 milliliters من selective dropout medium ناقص leucine tryptophan و histidine.

اشطف الطبق مرتين باستخدام 5 mL من الوسط نفسه، ثم اجمع الراسب بعد الطرد المركزي لمدة خمس دقائق عند 3,500 RPM و 20 °C. تخلص من supernatant وأعد الاستخدام. علّق كريات الخميرة في 5 mL من وسط الانتقاء الناقص (selective dropout medium) الخالي من leucine و tryptophan و histidine.

ثم يتم نشر الخميرة المتزاوجة على 10 أطباق من آغار الإسقاط الانتقائي (selective dropout agar) الخالي من الليوسين والتريبتوفان والهيستامين، والمدعم بالتركيز المناسب من ثلاثي أمينو تريازول (three amino triazole) أو 3AT وفقاً لما تم تحديده في اختبار التنشيط الذاتي. يتم حساب معدل إيجاد الخلايا الثنائية الصبغية (diploid rate) كما هو موضح في البروتوكول المكتوب بعد الحضن عند 30 درجة Celsius في جو رطب لمدة تتراوح من 6 إلى 10 أيام. يتم اختيار مستعمرات الخميرة ونقلها إلى أطباق تم تحضيرها حديثاً من آغار الإسقاط الانتقائي الخالي من الليوسين والتريبتوفان والهيستامين المضاف إليه 3AT.

قم بترتيب الخميرة في مخطط يتكون من ثمان ممرات تحتوي كل منها على 12 بئراً لمحاكاة طبق ذو 96 بئراً، وذلك لتسهيل عملية التسلسل لاحقاً. اترك مستعمرات الخميرة لتنمو لمدة تتراوح من أربعة إلى خمسة أيام عند 30 degrees Celsius في جو رطب. الهدف من هذا القسم هو إجراء تفاعل PCR لتضخيم الـ CDNA الموجود في ناقلات PA ct two من مستعمرات الخميرة المحللة التي نمت على أطباق آغار dropout الانتقائية الخالية من leucine و trytophan و histidine.

ابدأ بوضع طبق PCR مكون من 96 بئراً على الثلج لتحليل خلايا الخميرة بإضافة 50 µL من محلول xmal 20 T لكل بئر. أعد تعليق مستعمرة واحدة لكل بئر برفق. قم بحضن الطبق لمدة 15 دقيقة عند 37 °C و15 دقيقة عند 95 °C.

بعد إعادة الطبق إلى الثلج، أضف 50 µL من الماء المقطر لكل بئر، وامزج عن طريق السحب والطرد بالماصة، ثم ابدأ بالطرد المركزي لمدة خمس دقائق بسرعة 3,500 RPM وعند درجة حرارة 4 °C. بعد تحضير مزيج X tack كما هو موضح في البروتوكول النصي، وزع 40 µL من المزيج في كل بئر من طبق PCR ذي 96 بئرًا. أضف 10 µL من الخميرة المحللة لكل بئر وقم بإجراء التضخيم كما هو مدرج في البروتوكول النصي.

قم بتشغيل 3 µL من نواتج PCR على هلام أغروز بنسبة 1.2% للكشف عن المستعمرات الموجبة لـ PCR. قم بتحديد تسلسل قطع PCR المضخمة والمعزولة من ثلاث مستعمرات موجبة. ثم أجرِ تحليل blast لتحديد أطر القراءة المفتوحة الخلوية، مع استبعاد المحاذات ذات الموثوقية المنخفضة، بالإضافة إلى التسلسلات التي تحتوي على إزاحة في إطار القراءة أو كودونات توقف مبكرة قبل عملية ترانسفكشن الخلايا.

انقل أطر القراءة المفتوحة لبروتين الممرض والبروتين الخلوي إلى نواقلهما الخاصة لإنتاج بروتينات مدمجة مع شظايا من لوسيفيراز Gaia كما هو مفصل في البروتوكول النصي. قم باستزراع خلايا seed 2 9 3 T بكثافة 350,000 خلية لكل milliliter من وسط DMEM مع 10% fetal bovine serum بدون مضاد حيوي. وزع 100 microliters لكل بئر في أطباق استنبات بيضاء معقمة قبل تحضينها لمدة 24 ساعة عند 37 degrees Celsius مع 5% carbon dioxide. في اليوم التالي، قم بإجراء ترنسفكشن للخلايا باستخدام أي بروتوكول ترنسفكشن مناسب؛ استخدم 100 nanograms لكل بئر من كل من بنى بلازميد أطر القراءة المفتوحة للممرض والمضيف، وقم بعمل ترنسفكشن لـ 10 nanograms لكل بئر من بلازميد CMV firefly luciferase لضبط كفاءة الترنسفكشن.

يتم اختبار كل نقطة في ثلاث مكررات؛ انقل خليط ترانسفكشن (transfection) إلى أطباق تحتوي على خلايا 2 9 3 T مستنبتة. يجب توخي الحذر عند ترسيب خليط الـ DNA بلطف فوق الخلايا، لأن خلايا 2 9 3 T ليست شديدة الالتصاق وتنفصل بسهولة عن قاع البئر. تُحضن الخلايا في حاضنة استنبات الخلايا لمدة تتراوح من 24 إلى 30 ساعة عند 37 °C مع 5% carbon dioxide. تُغسل الخلايا باستخدام PBS بمعدل 100 µL لكل بئر. أضف 40 µL من محلول vanilla lysis buffer بتركيز 1x، واتركه ليحضن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

تحت التقليب، احفظ 10 µL من نواتج تحلل الخلايا في لوحة بيضاء أخرى من أجل تقدير جرعة luciferase اليراعة المخزنة في درجة حرارة 4 °C أو بدلاً من ذلك في درجة حرارة -20 °C لقياس نشاط Gaia. ضع اللوحة في جهاز قياس الضيائية (luminometer) وحقن 100 µL من كاشف مقايسة luciferase على نواتج تحلل الخلايا. ثم قم بحساب الضيائية لمدة 10 ثوانٍ.

تستغرق عملية معايرة طبق مكون من 96 بئراً حوالي نصف ساعة. يجب دائماً استخدام مستخلصات طازجة لأن التجميد أو التخزين طويل الأمد قد يؤثر على نشاط Gaia mediated interaction في الـ 10 µL المتبقية من مستخلصات الخلايا. يتم حقن 50 µL من كاشف مقايسة لوسيفيراز اليراعة (firefly luciferase) في نواتج تحلل الخلايا باستخدام مقياس اللمعان (luminometer) وحساب اللمعان لمدة 10 ثوانٍ.

تستغرق عملية معايرة لوحة ذات 96 بئراً حوالي نصف ساعة لكل تفاعل. احسب النسبة بين نشاط لوسيفيريز Gaia ونشاط لوسيفيريز اليراع للحصول على قيمة لومينيسنس GAIA مُطبعة، مع مراعاة كفاءة عفن الخلايا وحيوية الخلايا.

احسب متوسط الثلاثات المكررة لمراقبة التفاعل. قدّر نسبة luminescence المعيارية أو NLR لكل زوج من الممرض والمضيف. وللقيام بذلك، اقسم نشاط GAIA luminescence المعياري الذي تم اكتشافه في وجود بروتينات الممرض والمضيف معاً على مجموع الأنشطة المقاسة في آبار التحكم.

تم تقدير قيمة قطع NLR للتفاعلات الإيجابية في دراسة سابقة لتكون حوالي 3.5. تكمن القوة الرئيسية لمبادئ GIA عالية الإنتاجية، أو اختبار تكامل البروتين، أو H-T-G-P-C-A في حساسيتها العالية كما يتضح من تقييم معدلات الإيجابية الكاذبة والسلبية الكاذبة لبروتين HPVE two لتحديد معدل السلبية الكاذبة. تم تقييم التفاعلات المعروفة لـ E two من HPV 16 بواسطة H-T-G-P-C-A، حيث لم يتم استعادة 4 من أصل 18 تفاعلاً، وهو ما يقابل معدل سلبية كاذبة قدره 22%.

تم قياس التفاعلات الإيجابية الكاذبة بنسبة 5.8% باستخدام 12 بروتين HPVE E2 ضد مجموعة عشوائية من البروتينات الخلوية. وتبرز هذه الصورة الخصوصية العالية للطريقة، حيث تظهر أن طفرة نقطية واحدة معروفة بتداخلها مع ارتباط E2 بشريكه الخلوي BRD4 تؤدي إلى إلغاء نسبة NLR. وقد تم تطبيق هذا النهج المقارن واسع النطاق للبروتينات الخارجية مؤخراً بنجاح على ثلاثة بروتينات مبكرة من فيروسات الورم الحليمي البشري، وهي E2 وE6 وE7، والمنحدرة من أنماط جينية مختلفة، وممثلة لتنوعها الطبيعي في الميول النسيجية والاعتلالات المرضية لكل من هذه البروتينات المبكرة.

يعيد التجميع الهرمي لملفات التفاعل، في الغالب، صياغة التطور السلالي لـ HPV، مما يثبت متانة هذا النهج وشمولية مجموعات بيانات التفاعل. ويمكن استخدامه لربط ملفات تفاعل محددة بين الفيروس والمضيف مع السمات المرضية، مما يعطي أدلة حول دور البروتينات الفيروسية. وفيما يتعلق بالإمراض، يمكن استخلاص تفاعلات محددة حسب النمط الجيني، والتي قد تتوافق مع الانتحاء النسيجي أو المؤشرات الحيوية الممرضة.

كما هو موضح هنا بالنسبة للشركاء الستة المتفاعلين لـ E6، تم فرز الأهداف الخلوية بناءً على كثافة التفاعل وتجميعها وفقًا لنوع HPV المتفاعل. ويسمح هذا التمثيل بتحديد مؤشرات حيوية محددة مثل fad، الذي يتفاعل فقط مع بروتينات E6 لـ HPV المسرطنة. ومن المؤكد أن هذا الاستهداف أمر بالغ الأهمية للسمة المسرطنة لجميع أنواع HPV المسرطنة، وبالتالي يشكل مرشحاً جيداً ليتم استخدامه إما كعلامة بديلة لعدوى HPV أو كهدف علاجي.

بعد اتباع هذا الإجراء، يمكن تكييف تقنية H-T-G-P-C-A لتُستخدم مع بروتين ثالث يتم التعبير عنه كاندماج مع وسم البيوتين. يتيح ذلك التقاط ثلاثة معقدات شريكة على أطباق strep diving الملونة، وهو ما يمكن أن يجيب على التساؤل حول تكوين معقدات بروتينية كبيرة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية توصيف التفاعلات بين الممرض والمضيف. ثالثاً، من خلال استقصاء شركاء التفاعل لعدة متغيرات من السلالات. ثانياً، من خلال مقارنة تفاعلها مع مجموعة كاملة من أنواع الممرضات باستخدام قياس التفاعل بين البروتينات، كما هو الحال في الخلايا الثديية.