التلاعب الجيني من الفأرة النامية من خلال المهاد

الهدف العام من هذا الإجراء هو نقل DNA البلازميد إلى منطقة تحت المهاد في أجنة الفئران النامية داخل الرحم من أجل تنشيط أو كبح وظيفة جين مستهدف. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تخدير الأنثى الحامل وكشف الرحم من خلال عملية فتح البطن. وتتمثل الخطوة الثانية في حقن محلول DNA في البطين الثالث من دماغ الجنين.

بعد ذلك، يتم وضع القطب الموجب داخل الرحم بين المشيمة ورأس الجنين. ويتم وضع القطب السالب على السطح الخارجي للرحم ثم تُطبق النبضات الكهربائية. والخطوة الأخيرة هي استخراج أدمغة الأجنة التي تم نقل الجينات إليها بعد ستة أيام.

في النهاية، يُستخدم المجهر الفلوري لتحليل التغيرات المظهرية للخلايا المنقولة جينياً، مثل العدد والشكل والموقع والتعبير عن العلامات، وما إلى ذلك. وتتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل النقل الجيني الفيروسي أولاً في أنها لا تتطلب احتياطات خاصة أو مرافق مجهزة، وثانياً في إمكانية استهداف منطقة محددة، وثالثاً في أن فحص الجينات المرشحة يكون أسرع باستخدام التثقيب الكهربائي.

بشكل عام، سيواجه الأفراد المبتدئون في هذه الطريقة صعوبة لأن حقن محلول DNA في البطين الثالث ووضع القطب الكهربائي الإبري بشكل صحيح يتطلبان مهارة يدوية متقدمة إلى جانب بعض الخبرة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على التساؤلات في مجال تطور منطقة تحت المهاد، وخاصة تلك المتعلقة بهجرة الخلايا، بالإضافة إلى كيفية التحديد الجيني للمناطق والنوى الفردية. ابدأ هذا الإجراء بسحب بعض الماصات الزجاجية الدقيقة عالية الجودة، حيث إنها ضرورية لتقليل معدل الإجهاض المرتفع الأولي الناتج عن فقدان السائل السلوي.

لتحضير DNA، قم بإذابة DNA البلازمي المنقى والخالي من الإندوتوكسين في PBS يحتوي على 0.1% fast green للوصول إلى تركيز نهائي يتراوح بين ميكروجرام واحد إلى ميكروجرامين لكل ميكرولتر. سيجعل fast green المحلول المحقون مرئياً في بطين الدماغ الجنيني. بعد ذلك، قم بتحميل 10 ميكرولتر من محلول DNA في الماصة الزجاجية الدقيقة.

قم بعد ذلك بتوصيل الماصة الزجاجية الدقيقة بنظام الحقن أو بماصة فموية. وفي هذه الخطوة، جهز طاولة الجراحة بوسادة تسخين والأدوات الجراحية. قم بتشغيل مصادر الضوء البارد لتسهيل رؤية الأجنة. ثم قم بتعقيم الأدوات الجراحية باستخدام جهاز تعقيم بالخرز الزجاجي.

بعد ذلك، يتم تخدير فأرة حاملة باستخدام isof fluorine. وبعد تخدير الفأرة، توضع مرهم على عينيها لمنع الجفاف. ومن ثم يُثبت القناع على وجهها للحفاظ على التخدير بشكل مستمر.

ضع الفأر الآن على وسادة تدفئة بحيث يكون بطنه للأعلى. ثبت جسمه في مكانه عن طريق تثبيت أطرافه الأربعة بشريط لاصق. تأكد من أن الفأر في حالة تخدير كامل من خلال قرص ذيله لاختبار المنعكس.

ثم احلق سطح البطن وقم بتطهيره بمحلول اليود. قم بعمل شق طولي بطول يتراوح بين واحد إلى واحد ونصف سنتيمتر تقريبًا على جلد البطن. بعد ذلك، قم بقطع البريتون.

ضع بعد ذلك شاشاً قطنياً حول الشق. اشطف الشاش بمحلول PBS. اكشف عن أحد قرني الرحم عن طريق سحبه بحذر باستخدام ملقط غير مدبب.

تجنب شد عضلة الرحم أو الرحم بقوة؛ لأن الضغط المرتفع داخل الرحم سيزيد من احتمالية فقدان سائل الأجنة عند الحقن، مما يؤدي إلى الإجهاض. بعد ذلك، ضع قرن الرحم على شاش مغسول بـ PBS، وقم بشطفه بـ PBS كل بضع دقائق للحفاظ على رطوبته.

الآن، وتحت المجهر، ثبت الرحم بطريقة تسمح برؤية بطينات الدماغ. لا تقم بإعادة وضع الجنين الذي يوجد في وضعية غير مناسبة بشكل مفرط، لأن ذلك يزيد فقط من احتمالات الإجهاض.

انظر إلى رأس الجنين من الأعلى لتحديد الفجوة الموجودة عند الشق بين النصفين الكرويين القشريين الأيسر والأيمن. يمكن تمييز النصفين الكرويين بسهولة، وعادةً ما يمكن رؤية البطينات الجانبية بداخلهما كأشكال داكنة نوعاً ما. إذا وجد أن الجنين في وضعية توجيه مثالية لحقن الـ DNA، فمن الممكن ثقب جدار الرحم والدخول إلى البطين الثالث مباشرةً.

أمسك الماصة الزجاجية الدقيقة (glass micro pipette) التي تحتوي على الحمض النووي (DNA) الذي تم تحضيره مسبقاً بزاوية 45 درجة بالنسبة لجدار الرحم، ثم قم بثقبه عند الطرف الأنفي للشق بين نصفي الكرة المخية، مع التغلغل إلى عمق يصل إلى حوالي 1 mm. وبهذه الطريقة، ستدخل طرف الماصة الزجاجية الدقيقة إلى البطين الثالث للدماغ وليس البطين الجانبي. بعد ذلك، احقن حوالي 1 µL من محلول DNA في البطين الثالث؛ حيث سيملأ السائل الأخضر البطين في حالة الحقن الجيد. كرر الإجراء نفسه مع جميع الأجنة الموجودة في نفس قرن الرحم.

سيسمح هذا بترك بعض الوقت لمحلول DNA ليمتزج بالتساوي مع السائل البطيني ليصل إلى كامل الظهارة العصبية. الآن قم بتشغيل جهاز التثقيب الكهربائي واضبط الإعدادات وفقاً للعمر الجنيني. استخدم القطب الكهربائي ذو الإبرة المصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ كقطب موجب، والقطب المسطح المستدير كقطب سالب، واختر الأجنة التي يكون جانبها الظهري للأعلى لإجراء التثقيب الكهربائي.

بعد ذلك، قم بثقب جدار الرحم بجانب رأس الجنين بين الكيس السلوي والمشيمة عن طريق دفع طرف القطب الكهربائي الإبري للأسفل من خلاله. ثم استخدم إصبع السبابة لليد الأخرى كمسند دفع. يجب أن يكون حوالي 5 mm من طرف القطب الكهربائي بين الكيس السلوي وجدار الرحم عند مستوى الدماغ المتوسط تقريبًا.

بما أن هذا هو القطب المستهدف، فإن موضعه سيحدد الجزء من الظهارة العصبية لتحت المهاد الأكثر عرضة لعملية التعداء (Transfection). بعد ذلك، قم بوضع القطب المسطح الدائري خارج جدار الرحم على الجانب المقابل لرأس الجنين باستخدام اليد الأخرى. ثم اضغط بلطف على الجنين بين القطبين.

استخدم مفتاح الدواسة لتطبيق الجهد الكهربائي. بعد ذلك، اسحب قطب الإبرة ببطء من الرحم مع تثبيت الرحم باستخدام إصبع السبابة لليد الأخرى. إذا تسرب السائل السلوي عبر الجدار المثقوب، فعادةً ما يحدث إجهاض للجنين.

بعد حقن و lتثقيب جميع الأجنة كهربائيًا، أعدِ الرحم إلى تجويف بطن الفأرة بحذر شديد وضعه تمامًا كما كان قبل ذلك. ثم قم بترطيب التجويف البريتوني بمحلول ملحي قبل إغلاقه. خيِّط البريتون باستخدام خيوط الجراحة من أمعاء القطط (cat gut)، ثم خيِّط الجلد باستخدام خيوط جراحية أكثر مقاومة.

قم بتطهير سطح البطن بمحلول اليود واحقن مضاد التهاب غير ستيرويدي تحت الجلد لتسكين الألم. بعد ذلك، انقل الأم من جهاز التخدير وضعها في قفص مجهز بوسادة تدفئة. راقب الفأرة حتى تتعافى تماماً من التخدير، وقم بفحصها يومياً للتأكد من تعافيها من الإجراء دون ظهور أي علامات للعدوى أو الألم.

في هذه الخطوة، يتم جمع الأجنة أو المواليد حسب اليوم المطلوب للتحليل. اختر الأجنة التي حُقنت بالـ DNA وعولجت بالتثقيب الكهربائي، ثم قم بتشريح الدماغ تحت هذا المجهر الستيريوسكوبي. بعد ذلك، افحص وجود إشارة الفلورة الخضراء في المنطقة المناسبة.

لتحليل دماغ الجنين المختار، قم بتثبيت النسيج لفترة قصيرة في 4%paraldehyde. بعد ذلك، قم بطمره في aros 4% أو في جيلاتين الألبومين. ثم قم بتقطيع الدماغ باستخدام الـ vibrato.

توضح هذه الأشكال منطقة الوطاء (hypothalamus) بعد عملية عفن (transfection) للحمض النووي البلازمي، الذي يحمل جينات مراسلة فلورية، GFP أو CFP، داخل الرحم في اليوم الجنيني E 12.5. يمثل هذا مقطعاً سهمياً يظهر وطاءً تم نقل الجينات إليه من الجهة المنقارية إلى الذيلية، وهنا يظهر المقطع المستعرض مع الخلايا المحددة عند مستويات مختلفة على طول المحور الإنسي الجانبي. يظهر هذا المقطع السهمي جسماً حلمياً (mammillary body) تم نقل الجينات إليه بشكل محدد مع تحديد شجرته المحورية المميزة، بينما يظهر الجانب الكهربائي لهذا المقطع المستعرض شريطاً محدداً يقابل العصبونات التي ولدت في اليوم الجنيني E 12.5.

لتحليل المقاطع عن كثب، تم تحضير مقاطع أفقية موازية لمستوى عمليات الخلايا الدبقية الشعاعية المنبثقة من الرتج الحلمي. وقد تم تحديد عصبونات ambi O التي نشأت من الظهارة العصبية التي تم تحويلها جينياً في اليوم E 12.5 في اليوم E 18.5 باستخدام أجسام مضادة ضد GFP.

في هذا المثال، قام الجسم المضاد بتمييز مجموعة محدودة من خلايا MBO. تقع هذه المجموعة بين منطقتي MBO جانبيتين وإنسيتين غير مميزتين تتوافقان مع عصبونات MBO، التي نشأت قبل وبعد اليوم الجنيني E 12.5، مع صبغ مشترك باستخدام جسم مضاد ضد neston. يظهر اللون الأحمر نمط هجرة العصبونات المميزة فردياً على بروزات الدبق الشعاعي للنسيج العصبي الظهاري. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إنجازها في غضون 30 دقيقة إذا تم تنفيذها بشكل صحيح.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية حقن DNA في البطين الثالث وكيفية وضع الإبرة كقطب كهربائي موجب بين الجنين والرأس والمشيمة من أجل استهداف منطقة تحت المهاد بكفاءة. وبعد اتباع هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل الكيمياء النسيجية المناعية أو التهجين الموضعي للإجابة على أسئلة إضافية حول النمط الظاهري للعصبونات المنقولة.