التلاعب الجيني من الفأرة النامية من خلال المهاد في الرحم Electroporation

الهدف العام من هذا الإجراء هو نقل الحمض النووي للبلازما إلى منطقة ما تحت المهاد لأجنة الفئران التي تتطور في الرحم من أجل تنشيط أو قمع وظيفة الجين ذي الأهمية. يتم تحقيق ذلك عن طريق تخدير الفأر الحامل أولا وتعريض الرحم من خلال بضع البطن. الخطوة الثانية هي حقن محلول الحمض النووي في البطين الثالث من الدماغ الجنيني.

بعد ذلك ، يتم وضع القطب الموجب داخل الرحم بين المشيمة والرأس الجنيني. يتم وضع القطب السالب على سطح الرحم الخارجي ويتم تطبيق النبضات الكهربائية. الخطوة الأخيرة هي إزالة الأدمغة الجنينية المنقولة بعد ستة أيام.

في النهاية ، يتم استخدام الفحص المجهري الفلوري لتحليل التغيرات المظهرية للخلايا المنقولة ، والعدد ، والشكل ، والموضع ، وتعبير العلامة ، وما إلى ذلك. المزايا الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل تعداء الفيروس هي أولا ، فهي لا تتطلب احتياطات خاصة ، وكمرفقين ، يمكن الاستهداف الثاني لمنطقة معينة. وثالثا ، مع التثقيب الكهربائي Ute ، يكون فحص الجينات المرشحة أسرع.

بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن حقن محلول الحمض النووي في البطين الثالث ووضع قطب الإبرة بشكل صحيح يتطلب تحريفا يدويا متقدما مع بعض الخبرة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة في مجال تطور منطقة ما تحت المهاد ، لا سيما تلك ذات الصلة بهجرة الخلايا ، وكذلك كيفية تحديد المناطق الفردية والنواة وراثيا. ابدأ هذا الإجراء بسحب بعض الماصات الزجاجية الدقيقة عالية الجودة لأنها ضرورية لتقليل معدل الإجهاض المرتفع الأولي بسبب فقدان السائل الأمنيوسي.

لتحضير الحمض النووي ، قم بإذابة الحمض النووي للبلازما المنقى الخالي من السموم الداخلية في PBS ، والذي يحتوي على 0.1٪ أخضر سريع إلى تركيز نهائي من ميكروغرام إلى ميكروغرام لكل ميكرولتر. سيجعل اللون الأخضر السريع المحلول المحقون مرئيا في بطين الدماغ الجنيني. بعد ذلك ، قم بتحميل 10 ميكرولترات من محلول الحمض النووي في الماصة الزجاجية الصغيرة.

ثم قم بتوصيل الماصة الزجاجية الدقيقة بنظام الحقن أو ماصة الفم. في هذه الخطوة ، قم بإعداد طاولة الجراحة بلوحة تدفئة والأدوات الجراحية قم بتشغيل مصادر الضوء البارد لتسهيل تصور الأجنة. ثم قم بتطهير الأدوات الجراحية باستخدام معقم الخرز الزجاجي.

بعد ذلك ، قم بتخدير الفأر الحامل ب isof الفلور. بعد تخدير الفأر ، ضع مرهما على عينيه لمنع الجفاف. بعد ذلك ، ضع القناع على وجهه للحفاظ على التخدير باستمرار.

الآن ضع الماوس على وسادة تدفئة مع بطنه لأعلى. قم بتثبيت جسمه في مكانه عن طريق تثبيت أطرافه الأربعة بشريط لاصق. تأكد من تخدير الفأر تماما عن طريق الضغط على ذيله للارتجاع.

ثم احلق سطح البطن وقم بتطهيره بمحلول اليود. قم بعمل شق طولي بطول حوالي سنتيمتر ونصف على جلد البطن. بعد ذلك ، قطع الصفاق.

بعد ذلك ، ضع شاش قطني حول الشق. شطف الشاش مع PBS. كشف قرن الرحم عن طريق سحبه بعناية باستخدام ملقط حاد.

تجنب شد عضل الرحم أو الرحم بإحكام. نظرا لأن الضغط المرتفع داخل الرحم سيزيد من فرص فقدان السوائل الجنينية عند الحقن مما يؤدي إلى الإجهاض. ثم ضع قرن الرحم على شاش غسول PBS ، واشطفه باستخدام PBS كل بضع دقائق لإبقائه رطبا.

الآن ، تحت المجهر ، أمسك الرحم بطريقة يمكن من خلالها تصور بطينات الدماغ. لا تقم بتغيير وضع الجنين الذي يقع في وضع غير موات على نطاق واسع. هذا يزيد فقط من فرص الإجهاض.

انظر إلى رأس الجنين من الأعلى لتحديد الفجوة التي يوجد فيها الشق بين نصفي الكرة القشرية الأيمن والأيسر. من السهل التمييز بين نصفي الكرة الأرضية ، ويمكن عادة اعتبار البطينين الجانبيين بداخلهما أشكالا أغمق إلى حد ما. إذا وجد أن الجنين موجه تماما لحقن الحمض النووي ، فمن الممكن اختراق جدار الرحم ودخول البطين الثالث في الحال.

أمسك الماصة الزجاجية الدقيقة مع الحمض النووي الذي تم إعداده مسبقا عند 45 درجة على جدار الرحم وثقبها في الطرف المنقاري للشق بين نصفي الكرة الأرضية ، مع اختراق عمق ملليمتر واحد تقريبا. بهذه الطريقة ، سيدخل طرف الماصة الزجاجية الدقيقة إلى البطين الثالث من الدماغ وليس البطين الجانبي. بعد حقن الكلمة حوالي ميكرولتر واحد من محلول الحمض النووي في البطين الثالث ، سيملأ السائل الأخضر البطين في حقنة جيدة ، كرر نفس الإجراء مع جميع أجنة نفس قرن الرحم.

سيتيح ذلك بعض الوقت لمحلول الحمض النووي للاختلاط بالتساوي مع السائل البطيني والوصول إلى الظهارة العصبية بأكملها. الآن قم بتشغيل المحرك الكهربائي واضبط الإعدادات وفقا للعمر الجنيني. استخدم قطب الإبرة المصنوع من الفولاذ المقاوم للصدأ كقطب موجب والقطب المسطح المستدير كقطب سالب ، وحدد الأجنة مع الجانب الظهري لأعلى للتثقيب الكهربائي.

ثم اخترق جدار الرحم بجوار رأس الجنين بين الكيس الأمنيوسي والمشيمة عن طريق دفع طرف قطب الإبرة لأسفل من خلاله. ثم استخدم إصبع السبابة من اليد الأخرى ككتلة دفع. يجب أن يكون حوالي خمسة ملليمترات من طرف القطب بين الكيس الأمنيوسي وجدار الرحم عند مستوى الدماغ المتوسط تقريبا.

نظرا لأن هذا هو القطب المستهدف ، فإن موضعه سيحدد أي جزء من الظهارة العصبية تحت المهاد من المرجح أن يتم نقله. بعد ذلك ، ضع القطب الدائري المسطح خارج جدار الرحم على الجانب الآخر من رأس الجنين باليد الأخرى. ثم اضغط برفق على الجنين بين الأقطاب الكهربائية.

استخدم مفتاح الدواسة لتطبيق الجهد. بعد ذلك ، اسحب قطب الإبرة ببطء من الرحم مع إمساك الرحم بإصبع السبابة من اليد الأخرى. إذا فقد السائل الأمنيوسي من خلال الجدار المثقوب ، فعادة ما يخضع الجنين للإجهاض.

بعد الحقن والتثقيب الكهربائي لجميع الأجنة ، ضع الرحم مرة أخرى في بطن الفأر بعناية فائقة ووضعه تماما كما كان من قبل. ثم بلل التجويف البريتوني بالمحلول الملحي قبل إغلاقه. خياطة الصفاق بأمعاء القط الجراحية ، ثم خياطة الجلد بخياطة أكثر مقاومة.

تطهير سطح البطن بمحلول اليود وحقن مضاد للالتهابات غير الستيرويدي تحت الجلد لتخفيف الآلام. بعد ذلك ، أخرج الأم من آلة التخدير وضعها في قفص يتم تسخينه بواسطة وسادة تدفئة. راقب الماوس حتى يتعافى تماما من التخدير وافحصه يوميا للتأكد من تعافيه من الإجراء دون أي علامة على وجود عدوى أو ألم.

في هذه الخطوة ، حصاد الأجنة أو ما بعد الولادة وفقا ليوم التحليل المطلوب. حدد الأجنة التي تم حقنها بالحمض النووي وقم بتقطيعها كهربائيا وتشريح الأدمغة تحت هذا المجهر المجسم. ثم تحقق من وجود إشارة فلورية خضراء في المنطقة المناسبة.

لتحليل دماغ الجنين المحدد ، قم بإصلاح الأنسجة لفترة قصيرة في 4٪ بارالديهايد. بعد ذلك ، قم بتضمينه في aros 4٪ أو في ألبومين الجيلاتين. ثم قسم الدماغ على الاهتزاز.

تظهر هذه الأرقام منطقة ما تحت المهاد بعد تعداء الحمض النووي للبلازما في الرحم ، والتي تحمل جينات مراسل الفلورسنت ، GFP أو CFP في E 12.5. هذا قسم سهمي يظهر منطقة ما تحت المهاد المنقولة من المنقارية إلى الترميز ، وهنا هو القسم العرضي مع الخلايا المصنفة على مستويات مختلفة على طول المحور الجانبي للوسائط. يظهر هذا القسم السهمي جسما ثدييا منقولا على وجه التحديد ووضع علامات على شجرته المحورية المميزة ، وعلى جانب العرض الكهربائي من هذا القسم العرضي يظهر شريطا مسمى يتوافق مع الخلايا العصبية المولودة في E 12.5.

لتحليل الأقسام عن قرب. تم إعداد الأقسام الأفقية الموازية لمستوى العمليات الدبقية الشعاعية المنبثقة من عطلة الثدي. تم تحديد الخلايا العصبية Ambi O المولودة من الظهارة العصبية المنقولة في اليوم E 12.5 في اليوم E 18.5 عن طريق الأجسام المضادة ضد GFP.

في هذا المثال ، قام الجسم المضاد بتصنيف مجموعة مقيدة من خلايا MBO. كانت هذه المجموعة تقع بين منطقتين من مناطق MBO الجانبية والإنسية غير المسماة المقابلة للخلايا العصبية MBO ، المولودة قبل وبعد E 12.5 ، وتلوين مشترك بجسم مضاد ضد نيستون. يظهر باللون الأحمر وضع الهجرة للخلايا العصبية المسماة بشكل فردي على العمليات الدبقية الشعاعية للظهارة العصبية بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في 30 دقيقة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية حقن الحمض النووي في البطين الثالث وكيفية وضع الإبرة كقطب موجب بين الجنين والرأس والمشيمة من أجل استهداف منطقة ما تحت المهاد بكفاءة. باتباع هذا الإجراء. يمكن إجراء طرق أخرى مثل الكيمياء المناعية أو التهجين الهندي من أجل الإجابة على أسئلة إضافية حول النمط الظاهري للخلايا العصبية المنقولة.