المجهرية من التعبير الجيني في الدماغ اسماك الزرد الكبار عن طريق حقن مكروي Cerebroventricular [أليغنوكليوتيد] Morpholino

الهدف العام من هذا الإجراء هو الحقن المجهري للـ morph oligonucleotides في البطين الدماغي لدماغ سمكة الزيبرا البالغة وتثبيط نشاط الجينات في الخلايا الدبقية الشعاعية. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تخدير سمكة الزيبرا، ثم إجراء شق في الجمجمة فوق التبرز البصري باستخدام إبرة مسننة.

ثم يُحقن محلول المورفولينو عبر موقع الشق في السائل البطيني الدماغي. وفي النهاية، يتم التحقق من كفاءة ودقة الحقن تحت المجهر الفلوري. وفي الختام، يمكن الحصول على نتائج تتمثل في الحصر الفعال والواسع لإنتاج البروتين من الجينات المستهدفة في الخلايا الدبقية الشعاعية في دماغ سمكة الزيبرفيش البالغة من خلال إسكات الجينات بوساطة المورفولينو، وهو ما يمكن تقييمه عن طريق المقاطع النسيجية والصبغات الكيميائية النسيجية المناعية.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل النهج المعدلة وراثياً أو طرق التوصيل القائمة على التثقيب الكهربائي، في أن تقنية CVMI أقل استهلاكاً للوقت وأكثر كفاءة في استهداف كامل مجموعة الخلايا الدبقية الشعاعية. كما يمكن تعديل تلك الخلايا وإسكات جينات متعددة في آن واحد. لتحضير خليط الحقن، ابدأ بصنع محلول مخزون Morpho بتركيز 500 Micromolar.

باستخدام PBS لـ 10 عمليات حقن، قم بتحضير 10 µL من خليط الحقن عن طريق دمج 9 µL من محلول morpho المخفف أو غير المخفف مع 1 µL من صبغة تتبع فلورية. يحفظ الخليط في درجة حرارة الغرفة. استخدم سحّاب الإبر لتحضير شعيرات حقن زجاجية وفقاً للمعايير التالية.

قم بتشغيل مصدر الضغط واضبط إعدادات الضغط على 50 PSI أو 3.5 bars. اضبط إعدادات المحقن الدقيق (micro injector) كما يلي: ضغط التثبيت (Hold pressure) بقيمة 20 PSI، وضغط القذف (eject pressure) بقيمة 10 PSI، وقيمة الفترة الزمنية (period value) بين 2.5 و 100 milliseconds.

نطاق تحديد البوابات. قم بتشغيل المضيء الحلقي وضع الحلقة فوق منصة المجهر. ضع حامل الأنابيب الشعرية في موضع مناسب بجانب المجهر.

أدخل الشعيرة الزجاجية في الحامل واضبط زاوية الحقن على 45 درجة. وباستخدام ملاقط دقيقة، اكسر طرف الشعيرة الزجاجية وقم بمعايرة ضغط المخرج من الفوهة. ومن خلال غمر طرف الإبرة في ماء السمكة وتطبيق نبضة ضغط مستمرة، يجب أن تشكل الفقاعات الهوائية صفاً واحداً، مما يشير إلى الضغط الأمثل أو الحجم المناسب للفوهة.

املأ الأنبوب الشعري الزجاجي بمحلول الحقن. مع تجنب تكون فقاعات هوائية، قم بتطبيق ضغط لإزالة الهواء الموجود بين طرف الأنبوب الشعري الزجاجي ومحلول الحقن الذي تم تحميله. بعد تحضير محلول مخدر meab بتركيز 0.1%، انقل العدد المطلوب من الأسماك إلى حاوية نقل تحتوي على مياه الأسماك.

قم بتحضير محلول عمل للمخدر عن طريق خلط 200 milliliters من مياه الأسماك مع خمسة milliliters من المحلول المخزون لـ MISP. املأ نصف طبق بتري بالمخدر لاستخدامه في عمليات الحقن. اترك السمكة في المخدر حتى تتوقف عن الحركة.

بعد ذلك، استخدم شبكة لنقله إلى طبق بتري الذي يحتوي على المخدر. ولتسهيل عملية الشق، استخدم الملقط للإمساك بالسمكة برفق وتوجيهها بحيث يكون رأسها مائلاً قليلاً إلى الأسفل. وباستخدام طرف إبرة مسننة بمقاس 30 gauge، قم بعمل شق صغير في الجمجمة دون التغلغل بعمق شديد، لأن ذلك سيؤدي إلى تلف أنسجة الدماغ.

مع الاستمرار في تثبيت السمكة، أدخل طرف الشعيرة الزجاجية عبر موقع الشق بنحو نصف مليمتر، وقم بتوجيهها نحو cephalon مع تجنب ملامسة أنسجة الدماغ. احقن المحلول، حيث يجب أن ينتشر على الفور. انقل السمكة إلى مياه أسماك نظيفة واتركها حتى تتعافى.

بعد حوالي 30 دقيقة، قم بتخدير السمكة مرة أخرى وافحصها تحت مجهر فلوري للبحث عن توزيع السائل على نطاق واسع، وذلك بناءً على الفلورة الحمراء. أعد السمكة إلى حوضها وضعها مرة أخرى في دورة المياه.

حتى وقت الاستخدام في التحليلات السلوكية أو تحضير عينات الأنسجة كما هو موضح هنا، يؤدي الحقن الدقيق إلى انتشار المحلول المحقون في جميع أنحاء الدماغ واستهداف فعال للخلايا القريبة من السطح البطيني. ومع ذلك، في حالات الحقن التي تخترق فيها الشعيرة الزجاجية أنسجة الدماغ، ستظهر إشارة فلورية كثيفة عند نقطة الحقن. وإذا كانت الكمية المحقونة غير كافية، فسيُلاحظ وجود إشارة فلورية ضعيفة.

يوضح هذا الشكل أن جزيئات المورفالينو (morphos) الحية يمكنها اختراق بضعة أقطار خلوية داخل السطح البطيني، وبالتالي يمكنها استهداف الخلايا البطينية بكفاءة مقارنة بمجموعة المورفالينو الضابطة. ويؤدي حقن المورفالينو المضاد لـ PCNA إلى تثبيط التعبير الجيني بكفاءة في الخلايا البطينية. وفي صور التألق المناعي هذه، يظهر الصبغ المناعي لـ BRDU و QCD بعد تجربة مطاردة نبض A-B-R-D-U أن تثبيط PCNA باستخدام المورفالينو المضاد للمعنى يؤدي إلى انخفاض ملحوظ في الخلايا العصبية حديثة الولادة، مما يشير إلى إمكانية استخدام CVMI لتثبيط الجينات الداخلية التي تؤدي لاحقاً إلى نتائج وظيفية.

وبعد تطويرها، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال العلوم العصبية لاستكشاف الآليات الجزيئية المشاركة في استجابة تجدد الخلايا العصبية في دماغ أسماك S البالغة.