المجهرية من التعبير الجيني في الدماغ اسماك الزرد الكبار عن طريق حقن مكروي Cerebroventricular [أليغنوكليوتيد] Morpholino
مايو 23, 2013
في هذه المقالة، ونحن يبرهن على وجود طريقة للتلاعب في التعبير الجيني في الخلايا البطين من الدماغ الانتهائي الزرد الكبار باستخدام العقاقير أليغنوكليوتيد] morpholino. نقدم هذه الطريقة كبروتوكول فعالة وسريعة والتي يمكن استخدامها للدراسات وظيفية في الفقاريات الدماغ الكبار.
الهدف العام من هذا الإجراء هو الحقن الدقيق لقليل النوكليوتيدات في البطين الدماغي لدماغ الزرد البالغ والقضاء على نشاط الجينات في الخلايا الدبقية المشعة. يتم تحقيق ذلك عن طريق تخدير أسماك الحمار الوحشي أولا. بعد ذلك ، يتم إنشاء شق في الجمجمة ، يتراكب الطن البصري باستخدام إبرة انبعاج شائكة.
ثم يتم حقن محلول مورفو من خلال موقع الشق في السائل البطيني الدماغي. أخيرا ، يتم فحص كفاءة الحقن ودقته تحت المجهر الفلوري. في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج الانسداد الفعال والواسع النطاق لإنتاج البروتين من الجينات ذات الأهمية في الخلايا الدبقية الشعاعية لدماغ الزرد البالغ من خلال الضربة القاضية الجينية بوساطة مورفو ، والتي يمكن فحصها عن طريق الأقسام النسيجية والتلطيخ الكيميائي المناعي.
الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية ، مثل الأساليب المعدلة وراثيا أو طرق التوصيل القائمة على التشغيل الكهربائي ، هي أن CVMI أقل استهلاكا للوقت ، وأكثر كفاءة في استهداف جميع مجموعات الخلايا الدبقية المشعة. يمكن هدم تلك الجينات القابلة للتعديل والعديد منها في نفس الوقت. لتحضير خليط الحقن ، ابدأ بعمل محلول مخزون 500 ميكرومولار مورفو.
باستخدام PBS لحقن 10 ، قم بإعداد 10 ميكرولتر من مزيج الحقن عن طريق الجمع بين تسعة ميكرولتر من محلول مورفو المخفف أو غير المخفف مع ميكرولتر واحد من صبغة تتبع الفلورسنت. قم بتخزينه في درجة حرارة الغرفة. استخدم مجتذب إبرة لتحضير الشعيرات الدموية لحقن الزجاج وفقا للمعايير التالية.
قم بتشغيل مصدر الضغط واضبط إعدادات الضغط على 50 رطل لكل بوصة مربعة أو 3.5 بار. اضبط إعدادات الحاقن الصغير على النحو التالي. اضغط مع الاستمرار 20 رطل لكل بوصة مربعة ضغط الإخراج 10 رطل لكل بوصة مربعة قيمة الفترة 2.5 و 100 مللي ثانية.
مجموعة من البوابات. قم بتشغيل مصباح الحلقة وحدد موقع الحلقة فوق مرحلة المجهر. ضع حامل الشعيرات الدموية في وضع مناسب بجوار المجهر.
أدخل الشعيرات الدموية الزجاجية في الحامل واضبط زاوية الحقن على 45 درجة. باستخدام ملقط نهاية البحث ، قم بقطع طرف الشعيرات الدموية الزجاجية ومعايرة إخراج الضغط من الفتحة. عن طريق غمر طرف الإبرة في ماء السمك وتطبيق نبضة ضغط مستمرة ، يجب أن تشكل فقاعات الهواء صفا واحدا يشير إلى الضغط الأمثل أو حجم الفتحة.
قم بتحميل الشعيرات الدموية الزجاجية بمحلول الحقن. تجنب فقاعات الهواء ، قم بالضغط لإزالة الهواء بين طرف الشعيرات الدموية الزجاجية ومحلول الحقن المحمل. بعد تحضير محلول ساق 0.1٪ من ماب التخدير ، انقل العدد المطلوب من الأسماك إلى وعاء نقل به ماء السمك.
قم بإعداد محلول مخدر عملي عن طريق خلط 200 مل من ماء السمك مع خمسة ملليلتر من محلول مخزون MISP. املأ طبق بتري في منتصف الطريق بالمخدر لاستخدامه في الحقن. احتضن سمكة في المخدر حتى تتوقف عن الحركة.
ثم استخدم شبكة لنقلها إلى طبق مخدر بتري. لتسهيل الشق ، استخدم الملقط لإمساك السمكة برفق وتوجيهها مع إمالة رأسها لأسفل قليلا. باستخدام طرف إبرة شائكة بقياس 30 ، قم بعمل شق صغير على الجمجمة دون اختراق عميق جدا لأن ذلك سيؤدي إلى تلف أنسجة المخ.
مع الاستمرار في حمل السمكة ، أدخل طرف الشعيرات الدموية الزجاجية من خلال موقع الشق حوالي نصف ملليمتر ، ومع تجنب ملامسة أنسجة المخ ، قم بتوجيهها نحو الرأس. حقن الحل ، يجب أن يتشتت على الفور. انقل السمك إلى ماء السمك العذب واتركه يتعافى.
بعد حوالي 30 دقيقة ، أعد تخدير الأسماك وفحصها تحت المجهر الفلوري للبحث عن توزيع السائل على نطاق واسع. على أساس التألق الأحمر. أعد السمكة إلى حوضها وضعها مرة أخرى في الدورة الدموية.
حتى يتم استخدامه للتحليلات السلوكية أو لإعداد عينات الأنسجة كما هو موضح هنا ، يؤدي الحقن الدقيق إلى تشتت المحلول المحقون في جميع أنحاء الدماغ والاستهداف الفعال للخلايا القريبة من سطح البطين. ومع ذلك ، فإن الحقن التي تتعرض فيها الشعيرات الدموية الزجاجية ، سيكون لأنسجة المخ إشارة فلورية كثيفة عند نقطة الحقن. وإذا لم تكن الكمية المحقونة كافية ، ملاحظة إشارة فلورية ضعيفة.
يوضح هذا الشكل أن أشكال الجسم الحي يمكن أن تخترق أقطار الخلايا القليلة داخل سطح البطين ، وبالتالي يمكنها استهداف الخلايا البطينية بكفاءة مقارنة بالسيطرة. مورفو. يؤدي حقن مورفو ضد PCNA إلى إسقاط التعبير الجيني في الخلايا البطينية بكفاءة. في صور التألق المناعي هذه ، يظهر التلوين المناعي BRDU و QCD بعد تجربة مطاردة النبض A-B-R-D-U أن ضربة قاضية ل PCNA مع أشكال مضادة للمعنى تؤدي إلى انخفاض كبير في الخلايا العصبية حديثي الولادة ، مما يشير إلى أنه يمكن استخدام CVMI لإسقاط الجينات الذاتية التي تؤدي لاحقا إلى عواقب وظيفية.
لذلك بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم الأعصاب لاستكشاف الآليات الجزيئية المتضمنة في استجابة تكوين الخلايا العصبية المتجددة للبالغين S من دماغ السمكة.
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة طريقة للتحكم في التعبير الجيني في الخلايا البطينية للمخ الطرفي لسمكة الزيبرا البالغة باستخدام قليلات النوكليوتيد المورفولينو المضادة للمعنى. يتميز هذا البروتوكول بالكفاءة والسرعة، مما يجعله مناسباً للدراسات الوظيفية في أدمغة الفقاريات البالغة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- التعبير الجيني
- علم الأحياء التنموي
خلفية علمية
- تعد تقنيات التلاعب الجيني ضرورية لفهم وظائف الدماغ.
- يمكن لأوليغونوكليوتيدات المورفولينو المضادة للمعنى أن تثبط التعبير الجيني بفعالية.
- تعد أسماك zebrafish نموذجاً قيماً لدراسة تكوين الخلايا العصبية في الفقاريات.
- قد تكون الطرق الحالية مستهلكة للوقت وأقل كفاءة.
الغرض من الدراسة
- تطوير طريقة سريعة وفعالة لإسكات الجينات في أسماك الزيبرفيش.
- تسهيل الدراسات الوظيفية لأدوار الجينات في دماغ البالغين.
- تحسين تقنيات التلاعب الجيني الحالية.
الطرق المستخدمة
- الحقن المجهري لأوليغونوكليوتيدات المورفولين في البطين الدماغي.
- تخدير أسماك الزيبرا قبل الحقن.
- استخدام المجهر الفلوري لتقييم كفاءة الحقن.
- التحليلات النسيجية والكيميائية النسيجية المناعية لتقييم آثار تثبيط التعبير الجيني.
النتائج الرئيسية
- استهداف فعال للخلايا الدبقية الشعاعية في دماغ سمكة الزيبرا.
- يؤدي التعطيل الناجح للتعبير الجيني إلى نتائج وظيفية ملحوظة.
- تسمح هذه التقنية باستهداف جينات متعددة في آن واحد.
- تظهر النتائج إمكانية دراسة آليات تكوين الخلايا العصبية.
الاستنتاجات
- تعزز هذه الطريقة من القدرة على دراسة وظيفة الجينات في أسماك الزيبرا البالغة.
- توفر هذه الطريقة أداة قيمة لأبحاث العلوم العصبية.
- يمكن للدراسات المستقبلية الاستفادة من هذه التقنية لاستكشاف عمليات التجدد وتكون الخلايا العصبية.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
يتيح الحقن المجهري في البطينات الدماغية (CVMI) لأوليغونوكليوتيدات المورفولين تثبيطاً جينياً سريعاً وواسع النطاق في الخلايا الدبقية الشعاعية لأسماك الزيبرا البالغة، مما يدعم الدراسات الوظيفية لآليات تكوين الخلايا العصبية. ويوفر هذا النهج طريقة قابلة للتوسع والتكرار للتحقق من الأهداف في نماذج أدمغة الفقاريات، مما يقلل الاعتماد على الأنظمة المعدلة وراثياً. كما تسرّع هذه التقنية من اختبار الفرضيات في علوم الأعصاب الاستكشافية من خلال تحقيق تحول جيني فعال في جميع البطينات مع قراءات مظهرية قابلة للقياس الكمي.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تتيح استقصاء وظيفة الجين في الخلايا السلفية البطينية البالغة لتوضيح الأدوار الميكانيكية في مسارات تكوين الخلايا العصبية.
- القيمة التشغيلية: تسهل عملية التثبيط المتعدد والسريع لعدة جينات في آن واحد، مما يزيد من الإنتاجية في تقليل مخاطر الأهداف.
- القيمة التنبؤية: تولد نتائج وظيفية (على سبيل المثال، تقليل الخلايا العصبية حديثة الولادة) تربط تعديل الهدف بالنتائج المظهرية، مما يدعم قرارات المضي قدماً أو التوقف.
الفحص وتطوير المقايسة
- جاهزية المقايسة: ينتج محاليل حقن قياسية متتبعة فلوريسنتياً لضمان اتساق التوصيل وتصور التوزيع البطيني.
- المخرجات الكمية: يتيح التقييم النسيجي والكيميائي النسيجي المناعي لكفاءة التعطيل (knockdown) والآثار المترتبة على علامات تكاثر الخلايا.
- القابلية للتوسع: يستخدم معاملات ضغط قابلة للتعديل وشعيرات معايرة لضمان أحجام حقن قابلة للتكرار عبر التجارب.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- الصلة بالمرض: يمثل تنظيم تكوين الخلايا العصبية لدى الفقاريات البالغة، مما يوفر رؤية حول الآليات المحفوظة ذات الصلة بإصلاح الجهاز العصبي المركزي البشري والاضطرابات التنكسية العصبية.
- الاستمرارية الترجمية: يربط بين التعطيل الجيني الحاد في الخلايا السلفية والاستجابات الوظيفية لتكوين الخلايا العصبية، مما يدعم التحقق قبل السريري المتوافق مع المؤشرات الحيوية.
- تقليل المخاطر الآلية: يسمح بتحليل المساهمات المحددة للجينات في أنماط التجدد الظاهرية، مما يقلل من الغموض في تفسير المسارات المستهدفة.
تكامل خطوط المعالجة وسير العمل
تندرج تقنية CVMI ضمن تسلسل الاكتشاف الممتد من اختبار فرضية الهدف إلى التحقق الوظيفي، مما يسمح بالتكرار السريع بين تعديل الجينات وتقييم المظهر الظاهري في نماذج zebrafish.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم توضيح المسارات والتحقق من الأهداف من خلال تثبيط الجينات في الخلايا الدبقية الشعاعية لمراقبة التأثيرات على تكوين الخلايا العصبية.
- المسح: توفر أنظمة بيولوجية جاهزة للمقايسة مع توزيع بطيني واسع النطاق لتقييم المركبات أو الاضطرابات الجينية بشكل موثوق.
- التحليلات: تُنتج قراءات نسيجية وكيميائية نسيجية مناعية كمية (مثل PCNA، BRDU، QC) لقياس كفاءة التثبيط والنتائج الوظيفية.
- البحث الانتقالي: تربط تعديل الأهداف البطينية بالمخرجات العصبية، مما يوفر نظاماً ذا صلة بالمرض لضمان الاستمرارية في المرحلة ما قبل السريرية.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تؤسس منصة قابلة لإعادة الاستخدام للاستقصاء الجيني السريع عبر أهداف متعددة، مما يقلل الوقت والتكلفة مقارنة بإنشاء السلالات المعدلة وراثياً.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة التنبؤية في وظيفة الهدف من خلال ربط تثبيط الجينات البطينية بأنماط ظاهرية عصبية قابلة للقياس.
- القيمة التشغيلية: تضمن قابلية التكرار من خلال تحضير تخديري موحد، ومعايرة الضغط، وضوابط تتبع الفلورية.
- القيمة الاستراتيجية: تقلل من المخاطر البيولوجية في المراحل المتأخرة من خلال تمكين تقليل مخاطر الأهداف بشكل مبكر وفعال في نموذج دماغ فقاري بالغ ذي صلة فسيولوجياً.
- التأثير على المحفظة: تدعم ترتيب أولويات الأهداف المعدلة حسب المخاطر بناءً على العواقب الوظيفية الملحوظة في نماذج تثبيط الجينات البطينية واسعة النطاق.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في التعامل مع سمك الزيبرا، والجراحة المجهرية، وتقنيات الحقن المجهري.
- يعتمد على أجهزة الحقن المجهري المنظمة بالضغط، والمجهر الفلوري، والبنية التحتية للتلوين النسيجي.
- يستلزم توحيد حجم الحقن، واستخدام صبغة التتبع، وبروتوكولات التعافي بعد الحقن بين الفرق المختلفة.
- يجب مراعاة التباين في إمكانية الوصول إلى البطين وكفاءة الانتشار عند التطبيق على سلالات أو أعمار مختلفة من سمك الزيبرا.
- يقتصر على التعطيل الجيني الحاد؛ وهو غير مناسب لدراسات التعديل المزمن أو المشروط دون إجراء عمليات حقن متكررة.
![Microinjection من مرنا والعقاقير [أليغنوكليوتيد] Morpholino اسماك الزرد في الأجنة.](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F1113.jpg%3Fv%3D2026-08-11T08%253A27%253A07.124Z&w=384&q=75)
