التصوير والإعمار 3D من الهياكل الدماغية في الجنينية اسماك الزرد

الهدف العام من هذا الإجراء هو تقييم الهياكل الدماغية الوعائية في أسماك الحمار الوحشي الجنينية. يتم تحقيق ذلك عن طريق جمع بيض أسماك الحمار الوحشي المخخص أولا ، وإعداد شروط العلاج. بعد فترة نمو مدتها ثلاثة أيام ، يتم التضحية بأسماك الحمار الوحشي ثابتة ، ويتم إزالة العين بعناية قبل تركيب العينة على زجاج الغطاء.

ثم يتم تصوير الأوعية الدموية الدماغية عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر. أخيرا ، يتم إنشاء عروض ثلاثية الأبعاد للأوعية الدموية باستخدام برنامج مفتوح المصدر. في النهاية ، يتم استخدام تحليل عمليات إعادة البناء لتحديد آثار ظروف العلاج على تفرع الأوعية الدموية وكثافتها.

في دماغ أسماك الحمار الوحشي النامية. تقوم هذه التقنية بتقييم نظام الأوعية الدموية بالكامل لأسماك الزرد الجنينية. لقد سمح لنا بدراسة بيولوجيا أميلويد بيتا على مستوى أنظمة الأعضاء.

العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية حيث يصعب تعلم التشريح وتحليل الصور لأنهما يشكلان تحديا تقنيا. للبدء ، قم برفع سلالة من سمك الزرد المعدلة وراثيا تعبر عن بروتين الفلورسنت الأخضر المعزز في الأنسجة المرغوبة عند 28.5 درجة مئوية مع 14 ساعة من الضوء ، 10 ساعات الظلام. في هذا المثال ، يتم تربية الأسماك المعدلة وراثيا التي تعبر عن EGFP في الخلايا البطانية الوعائية في الليلة السابقة لجمع البيض ، وإعداد الذكور والإناث في أحواض التزاوج ذات القيعان الشبكية في صباح اليوم التالي ، قم بإزالة الحاجز والسماح للأسماك بالتزاوج للتحقق من وجود بيض كل 15 دقيقة.

بعد استخدام مصفاة شبكية لجمع البيض و E ثلاثة متوسطة لغسلها ، استخدم E ثلاثة لنقل البيض إلى أطباق استزراع 100 ملم واحتضانها عند 28 درجة مئوية لتغيير التفرع الدماغي الوعائي بدءا من 24 ساعة بعد الإخصاب ، أضف مادة كيميائية مثل مثبط سكريتيز جاما القابل للذوبان في DMSO. إذا رغبت في ذلك ، أضف 0.03٪ PTU لمنع تكوين الصباغ.

بعد نقل الأجنة في محلول إلى آبار 12 ، تحتضن صفيحة البئر عند 28.5 درجة مئوية حتى تصل الأجنة إلى مرحلة النمو المطلوبة. بعد التضحية بالأجنة في trica وتثبيتها بالألدهيد طوال الليل عند أربع درجات مئوية. قم بتخزين الأجنة في PBS في الظلام عند أربع درجات مئوية.

لإزالة العين من الجنين، استخدم إبرة تنجستن حادة وقم بقص الأنسجة التي تربط عين واحدة. ثم قطع العضلات وأخيرا العصب البصري لإزالة العين. بمجرد إزالة العين ، اقلب الجنين على غطاء زجاجي بحيث يكون تجويف العين الفارغ متجها لأسفل ولمس زجاج الغطاء.

أضف قطرة 3٪ ميثيل سلولوز لتثبيت الجنين في مكانه ولتغطية الجنين بأكمله لمنع الجفاف. أثناء التصوير باستخدام مجهر متحد البؤر مقلوب مع صورة موضوعية APO بخطة 20 × ، الجنين على الفور ، لن تتمكن العديد من أنظمة التصوير إلا من حل الهياكل الوعائية في منتصف هذه العينة. إذا كانت هذه هي الحالة ، فقم بتعليق الجنين في PBS وإعادة تركيبه على الجانب المقابل لمزيد من التصوير لإجراء إعادة بناء ثلاثية الأبعاد للصور الدماغية الوعائية باستخدام الصورة J ، والتي تم تحسينها للعروض ثلاثية الأبعاد.

قم باستيراد المكدسات متحدة البؤر بالانتقال إلى المكونات الإضافية والمواقع ومستورد التنسيقات الحيوية ، ثم حدد الملف متحد البؤر لمداخن نيكون ، وحدد عرض المكدس مع hyper stack واضبط وضع اللون على مقياس رمادي. ثم تحقق من القياس التلقائي وتقسيم القنوات. ستفتح هذه التحديدات أربع لوحات قنوات منفصلة.

أغلق كل الصور باستثناء الصورة 16 بت باسم الملف متبوعا ب c يساوي واحدا. اضبط الحد باستخدام علامة تبويب التمرير على طول الجزء السفلي للبحث عن شريحة تحتوي على المنطقة أو البنية المطلوبة. ثم انتقل إلى عتبة ضبط الصورة.

في اللوحة التي تظهر ، حرك الشريط العلوي إلى اليسار بحيث يمكن رؤية الهيكل جيدا فوق الخلفية واترك الشريحة السفلية في المكان لإنشاء صورة جديدة بثمانية بت. حدد b وw. ثم خلفية داكنة.

لا تحدد حساب الحد لكل صورة ما لم تكن هناك حاجة إلى تعديلات مختلفة لكل شريحة. بعد ذلك ، انتقل إلى الإضافات 3D عارض عتبة صفر عامل إعادة التشكيل واحد أو اثنين ، وقم بإلغاء تحديد مربعات الألوان الحمراء والزرقاء لعمل إخراج ثلاثي الأبعاد أخضر. خلاف ذلك ، سوف ينتج عنه عرض أبيض.

ثم حدد تطبيق. استخدم عناصر التحكم في الماوس ولوحة المفاتيح لتدوير الصورة ثلاثية الأبعاد وتدويرها وتكبيرها لحفظ الصور الثابتة في أي وقت. استخدم خيار الالتقاط في القائمة.

يحدد حجم مربع الصورة على الشاشة أبعاد البكسل للصورة المنتجة ، لذلك إذا كانت هناك حاجة إلى صورة عالية الدقة ، فقم بتكبير المربع عن طريق سحب الزاوية اليمنى السفلية. قم بإنشاء فيلم ثلاثي الأبعاد دوار عن طريق تحديد عرض الدوران بزاوية 360 درجة. أخيرا ، احفظ الملف بأحد التنسيقات العديدة المتاحة واستخدم مشغل الوسائط المجاني مفتوح المصدر VLC لعرض 3D.

توفر إعادة بناء هياكل الأوعية الدموية منظورا شاملا ومثيرا للاهتمام بصريا لتطور أسماك الحمار الوحشي. تظهر هنا عدة زوايا للهياكل الوعائية في جنين الزرد بعد ستة أيام من الإخصاب والذي عبر عن EGFP في الخلايا البطانية بألوان خضراء أو بيضاء أحادية اللون. قد يكون من الصعب تقدير شدة الإشارة ، لكن التلوين الزائف يوفر كثافة الصورة من جدول البحث ، مما يسمح بإدراك أفضل للعمق للهياكل المتداخلة.

على سبيل المثال ، يظهر هذا الشكل صورة ثلاثية الأبعاد ملونة زائفة للأوعية الدموية في أسماك الحمار الوحشي بعد ستة أيام من الإخصاب بعد تطورها. سمحت لنا هذه التقنية باستكشاف التأثيرات الوعائية لأميلويد بيتا في دماغ الفقاريات. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصور شبكات الأوعية الدموية في أسماك الزرد الجنينية ، والتي توفر نظاما اقتصاديا ويمكن الوصول إليه لدراسة تكوين الأوعية.