تحليل المناعى في الجهاز العصبي المركزي والمحيطي الجرذ العقدة الليمفاوية أقسام الأنسجة

الهدف العام من هذا الإجراء هو استهداف بروتين معين في أنسجة الفئران. يتم تحقيق ذلك عن طريق عزل الأنسجة وتثبيتها وتضمينها أولا ، متبوعا بتقسيم الأنسجة وتركيبها على الشرائح. الخطوة الثانية هي إزالة البارافينات وإعادة ترطيب أقسام الأنسجة المضمنة في البارافين ، ثم منع البيروكسيديز الداخلي.

بعد ذلك ، يتم الكشف عن الحلقات عن طريق استرجاع المستضد. بعد ذلك ، يتم إجراء الحجب لتقليل الارتباط غير المحدد قبل إدخال الأجسام المضادة. تتمثل الخطوة الأخيرة في اكتشاف الحاتمة المحددة عن طريق وضع العلامات المناعية بالأجسام المضادة الأولية والثانوية ، وتطوير الإشارة من الجسم المضاد الثانوي المسمى.

في النهاية ، يتم تصور الإشارة باستخدام الفحص المجهري الضوئي لإظهار نمط توطين البروتين في أقسام الأنسجة. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لتوطين البروتين وأنماط التعبير في الجهاز العصبي المركزي للفئران وفي الغدد الليمفاوية الطرفية ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على الأعضاء والأنواع الأخرى. لإثبات الإجراء سيكون فني.

اسمها كاتالين بينيديك ، من المنشأة الأساسية لمركز علم الأحياء الدقيقة للأورام وبيولوجيا الخلية في معهد كارولينسكا. لبدء تحضير الأنسجة ، اغمر الدماغ والحبل الشوكي وأنسجة العقدة الليمفاوية المحيطية في أربعة بالمائة من بارافورمالديهايد ، وضعها عند أربع درجات مئوية لمدة 24 ساعة. بعد إصلاح الأنسجة ، انقل الأنسجة إلى PBS وقم بتخزينها عند أربع درجات مئوية حتى مزيد من المعالجة.

لبدء معالجة الأنسجة، استخدم شفرة حلاقة لتقطيع الأنسجة إلى أجزاء بحجم خمسة ملليمترات تقريبا. ثم ابدأ عملية تصلب الأنسجة باستخدام معالج التسلل الفراغي. يعتمد الإجراء القياسي على الغمر في تركيزات تصاعدية من الإيثانول ، متبوعا بالزيلول ، وأخيرا البارافين.

بعد ذلك ، ضع الأنسجة في قالب. صب البارافين السائل حول العينة لتشكيل كتلة البارافين ، وتخزينها في درجة حرارة الغرفة. قبل تقطيع الأنسجة ، قم بتبريد كتلة البارافين طوال الليل على الطبق البارد أو في الثلاجة.

بعد تبريد كتلة البارافين ، ضع الكتلة في الحامل الثابت لميكروتوم الزلاجة الذي يمكن أن يتحرك للخلف وللأمام عبر السكين. بعد ذلك ، اضبط الكتلة والسكين الميكروتوم على الزاوية المثلى ، والتي تعتمد على هندسة السكين وسرعة القطع وتقنيتها. قطع ثلاثة مقاطع عرضية بسمك خمسة ميكرون من كتلة البارافين.

بعد ذلك ، انقل الأقسام المقطوعة إلى وعاء ماء وقم بتركيب الأقسام من الماء على شريحة زجاجية لاصقة تجارية مطلية مسبقا. بعد ذلك ، اضغط على القسم المركب بعناية على منشفة ورقية لإزالة الماء المتبقي وفقاعات الهواء المحتملة. جفف الشرائح المثبتة لبضع ساعات في موقد مضبوطا على 50 إلى 60 درجة مئوية.

بمجرد أن تجف الشرائح ، اغمر الشرائح مرتين في إكسيلول لمدة 15 إلى 20 دقيقة لكل منهما. ثم اشطف كل شريحة بنسبة 99 بالمائة من الإيثانول. لمنع نشاط البيروكسيديز الداخلي ، احتضان الأقسام لمدة 30 دقيقة في محلول ميثانول يحتوي على 0.25 في المائة بيروكسيد الهيدروجين.

بعد ذلك ، استمر في إعادة ترطيب أقسام الأنسجة عن طريق الشطف بمحاليل الإيثانول التي تحتوي على محتوى مائي متزايد. قم بإجراء خطوة الجفاف النهائية في الماء المقطر. تأكد من الحفاظ على رطوبة الأقسام حتى ينزلق الغطاء.

لاسترداد المستضد ، قم بتسخين الشرائح باستخدام قدر بخاري منزلي ومخزن EDTA المؤقت عند درجة الحموضة 8.5 لمدة 60 دقيقة. ثم قم بتبريد الشرائح في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة تقريبا. بمجرد أن تبرد الشرائح ، اشطف كل شريحة ثلاث إلى خمس مرات في محلول ملحي مخزن في Tris-buffered ، أو T-B-S.

بعد ذلك ، احتضان أقسام الأنسجة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة في محلول مانع يحتوي على 10 في المائة من مصل ربلة الساق الجنينية و 90 في المائة من محلول الغسيل لمنع أي تفاعلات خلفية غير محددة. بعد انسداد أقسام الأنسجة ، قم بتخفيف الكمية المطلوبة من الأجسام المضادة الأولية في محلول الحجب ، واحتضان الشرائح في محلول الجسم المضاد الأساسي هذا طوال الليل عند أربع درجات مئوية. في اليوم التالي ، اشطف الشرائح ثلاث إلى خمس مرات باستخدام المخزن المؤقت T-B-S.

ثم احتضان الشرائح بأجسام مضادة ثانوية مخففة في محلول الحجب لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، اشطف الشرائح مرة أخرى ثلاث إلى خمس مرات باستخدام المخزن المؤقت T-B-S. بعد ذلك ، احتضان الشرائح بمركب بيروكسيداز الفجل الحار أفيدين ، المخفف من واحد إلى 100 في محلول المنع ، لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.

بمجرد اكتمال الحضانة لمدة ساعة واحدة ، اشطف الشرائح ثلاث إلى خمس مرات باستخدام المخزن المؤقت T-B-S. بعد تحضير المحلول الأزرق السريع كما هو موضح في بروتوكول النص ، رج الطبق برفق وقم بتصفية الخليط الذي تم الحصول عليه. صب المحلول على الشرائح في الكوفيت الزجاجي.

ابدأ الحضانة عند 37 درجة مئوية ، وراقب عملية التطور تحت المجهر الضوئي كل 15 إلى 30 دقيقة. بمجرد اكتمال الحضانة ، اشطف الشرائح ثلاث إلى خمس مرات باستخدام المخزن المؤقت TBS ، ثم انقل الشرائح لاحقا إلى المخزن المؤقت PBS. لصنع محلول تطوير بيروكسيد الهيدروجين D-AB ، قم أولا بتخفيف مليلتر واحد من محلول مخزون D-AB في 49 مل من P-B-S.

أضف 16.5 ميكرولتر من بيروكسيد الهيدروجين ، ثم قم بتصفية المحلول. صب المحلول على الشرائح ، وتأكد من التحكم في عملية التطوير تحت المجهر الضوئي لتجنب الخلفية العالية التي يمكن أن تخفي الإشارة المحددة. بعد ذلك ، اشطف الشرائح ثلاث إلى خمس مرات باستخدام PBS ، متبوعا بغسل أخير بالماء المقطر أو ماء الصنبور.

قم بتركيب الشرائح مع زلات الغطاء مباشرة من الماء ، باستخدام وسط تركيب مائي. تجنب إنشاء فقاعات هواء بين زلة الغطاء والشريحة. بعد تركيب الأقسام ، احتضان الشرائح طوال الليل عند أربع درجات مئوية للسماح لوسط التثبيت بالجفاف تماما.

قم بتخزين الشرائح المجففة في درجة حرارة الغرفة. كشف التلوين المزدوج لأقسام أنسجة العقدة الليمفاوية الطرفية المعزولة من الفئران في اليوم السابع بعد التحصين أن الخلايا الليمفاوية التائية الإيجابية CD8 لم تفرز الكيموكين C-C-L 11. بدلا من ذلك ، تم العثور على C-C-L 11 ليكون موضعيا مع E-D one ، وهو علامة للبروتين الليزوزومي في الضامة المنشطة.

حدد التلوين المزدوج I-H-C للحبل الشوكي للفئران إنتاج CC أحد عشر في البريكاريا العصبية والتشعبات والمحاور ، ولكن ليس في I-B-A واحد الضامة الإيجابية والخلايا الدبقية الصغيرة المقيمة في الدماغ. بالإضافة إلى ذلك ، تم العثور أيضا على غالبية البلاعم الإيجابية E-D والخلايا الدبقية الصغيرة المقيمة في الدماغ لتكون إيجابية C-C-L 11. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء استهداف كيميائي مناعي محدد وموثوق به للبروتين مباشرة في أقسام الأنسجة.