جيل من العضلية الإنسان: البروتوكول التمايز من خالية من الطاعم المستحثة الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان

الهدف العام من هذا الإجراء هو تمايز الخلايا القلبية البشرية من خلايا جذعية بشرية مستحثة متعددة القدرات (IPS cells) مستزرعة في ظروف خالية من الخلايا المغذية. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق زراعة خلايا IPS في أطباق ذات قدرة التزام منخفضة للغاية لتكوين أجسام جنينية. وتتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في نقل الأجسام الجنينية المتكونة إلى أطباق مطلية بالجيلاتين.

عندما تظهر المناطق المنقبضة، يتم تشريحها يدويًا تحت المجهر الستيريوزكوبي ونقلها إلى أطباق مطلية بالفبرونيكتين. ولتحقيق مزيد من التمايز، تتمثل الخطوة النهائية في الحصول على خلايا عضلة قلبية مفردة عن طريق الهضم الإنزيمي للتجمعات المنقبضة. وفي النهاية، يمكن أن تظهر النتائج تمايز خلايا تشبه الخلايا العضلية القلبية والتي تعبر عن علامات هيكلية نموذجية، مثل التروپونين القلبي من خلال مجهر الفلورة المناعية.

يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على سؤال محوري في مجال البيولوجيا القلبية الوعائية، مثل تحديد الآليات التي تدفع التمايز القلبي والخلل الوظيفي أثناء التطور القلبي والأمراض على مستوى الخلايا العضلية القلبية البشرية. وتعد هذه التقنية مثيرة للاهتمام للغاية لأنها تتيح توليد خلايا عضلية قلبية في المختبر (in vitro) من المرضى والأفراد البشر. وفي الحالة الثانية، فإنها تسمح بمحاكاة المرض في أنبوب الاختبار بحيث يمكن تجربة أدوية جديدة مخبرياً قبل الانتقال إلى التجارب الحيوية (in vivo).

بدء التجربة باستخدام مزارع خلايا IPS متلاصقة نمت على أطباق مقاس 35 مليمتر مغلفة بالماتريجيل. استبدل وسط النمو بـ 1 مل من PBS يحتوي على 1 مجم من diss. افحص الخلايا باستخدام ماصات زجاجية مسحوبة.

قم بإزالة المناطق التي تحتوي على خلايا متمايزة، مثل البنى الشبيهة بالفوهات أو البنى الكيسية في مركز المستعمرات. كما يجب إزالة أي مناطق انفصلت فيها الخلايا وتسطحت وبدت وكأنها تهاجر نحو الخارج. الآن، قم بحضن الخلايا المتبقية عند 37 °C تحت غطاء زراعة الخلايا حتى تصبح حدود المستعمرة أكثر سطوعاً وتبدأ في الانفصال.

تستغرق هذه العملية عادةً ما بين خمس إلى سبع دقائق. في هذه المرحلة، قم بإزالة محلول dispa واغسل الخلايا باستخدام 1 mL من HESM. ثم تخلص من محلول الغسيل.

في ملليلتر جديد من HESM، استخدم رافعة خلايا لحصد المستعمرات. اجمع المستعمرات في أنبوب سعة 15 ملليلتر. بعد ذلك، اشطف الخلايا بملليلتر آخر من HESM وقم بطردها مركزياً عند 1000 ×g لمدة أربع دقائق.

بعد ذلك، انتقل إلى زراعة الخلايا على matrigel وقم بتغيير الوسط الغذائي يومياً أثناء الاستزراع. ابدأ بحصاد مستعمرات IPS غير المتمايزة كما هو موضح في القسم السابق. وبمجرد عزل المجموعات غير المتمايزة، قم بإعادة تعليقها برفق في 1 mL من EBM 20.

باستخدام ماصة سعة 2 mL، تجنب تفتيت تكتلات الخلايا بشكل مفرط. اكتفِ بعمليتي أو ثلاث عمليات سحب ودفع بالماصة. تحقق من حجم المستعمرات تحت المجهر الستيريوسكوبي بين كل عملية سحب ودفع.

عندما تصبح المستعمرات جميعها بنفس الحجم تقريبًا، فإنها لا تحتاج إلى مزيد من الخلط. الآن، قم بزراعة الخلايا في أطباق ذات ارتباط فائق الانخفاض، مع ملء طبق واحد بستة آبار لكل طبق من الخلايا التي تم حصادها. لا تنسَ شطف الأنبوب بـ 1 mL من EBM 20 وتوزيع سائل الشطف على الطبق.

بعد اليوم الثالث من الحضن، استبدل الوسط الغذائي باستخدام المجهر لتجنب إزالة أجسام الأجنة. حافظ على وضع الماصة بالقرب من حافة الطبق. وفي اليوم السابع، انقل أجسام الأجنة إلى أطباق مغطاة بـ 0.1% Gelatin مُدفأة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.

أضف من 35 إلى 40 جسماً جنينياً إلى كل طبق بقطر 35 مليمتر في 2 مليلتر من الوسط الغذائي. وأثناء عملية الزرع، قم بتغيير الوسط الغذائي بانتظام مرتين أسبوعياً.

افحص أجسام الأجنة بحثاً عن مناطق خفقان وحدد مواقع مناطق التبرعم. يجب أن تظهر مناطق انقباض التبرعم على الجزء العلوي من غطاء الطبق بعد حوالي 10 إلى 20 يوماً. عند ظهور مناطق ذات انقباض تلقائي، قم بتغيير الوسط الخاص بها إلى EBM two. بعد ظهور مناطق الانقباض، استمر في زراعة ومراقبة المناطق الأخرى في الطبق لمدة تصل إلى شهر.

إجمالاً، تعتمد كفاءة عملية التمايز في وسط EBM بشكل كبير على عدة عوامل، وأهمها الخطوط الخلوية المحددة ودفعة المصل المستخدمة لتحفيز التمايز القلبي. ولتحقيق أعلى كفاءة، يجب اختبار عدة خطوط خلوية لتقييم قدرتها على تكوين الخلايا القلبية واختبار دفعات مختلفة من المصل. ابدأ بطلاء 12.

يجب أن تغطي الأطباق ذات الآبار، التي تحتوي على 5 µg/cm² من الفيبرونكتين في PBS بتركيز 300 µL لكل بئر، سطح كل بئر بالكامل. تُترك الأطباق لتجف وهي مكشوفة داخل غطاء استزراع الخلايا. ولإزالة منطقة التكويير في المزرعة الخلوية، استخدم ماصة زجاجية مسحوبة ومشرطًا.

بعد ذلك، وباستخدام ماصة سعة 1 mL، انقل من أربعة إلى خمسة مشابك إلى كل بئر من آبار طبق مطلي بالفبرونيكتين. وبمجرد إتمام جميع عمليات الجمع، أضف 1 mL من وسط EBM 2 إلى الآبار المحملة في طبق الجمع وقم بتحديد المناطق التي أزيلت منها الخلايا. ثم قم بتغيير الوسط وأعد الطبق إلى غطاء زراعة الخلايا.

إذا كانت هناك حاجة إلى تجمعات نابضة أصغر تحت المجهر الستيريو، فقم بتمرير المناطق المستأصلة عبر ماصة. ينتج عن ذلك مجموعات صغيرة تحتوي على عدد قليل من الخلايا النابضة في المزرعة.

قم بتغيير الوسط مرتين أسبوعياً حتى تصبح العينات جاهزة للتحليل. أولاً، قم بتجهيز شرائح ذات غرفتين بمساحة أربعة سنتيمترات مربعة عن طريق طلائها بـ 20 micrograms من الـ fibronectin المخفف في كمية كافية من PBS لتغطية السطح. وفي حال استخدام دعامة زجاجية، أضف 20 micrograms إضافية من الـ laminin.

اعزل منطقة استزراع الخرز كما وصف سابقاً. باستخدام ماصة سعة 1 مل، انقل الخلايا إلى أنبوب سعة 15 مل يحتوي على 500 µL من الكولاجيناز. قم بحضن الخلايا لمدة 15 دقيقة مع رج الأنبوب مرة واحدة أثناء فترة الحضن.

بعد مرور 15 دقيقة، انقل الخلايا باستخدام ماصة سعة 200 microliter لإزالة التكتلات في حال استمرار وجودها. انقل الخلايا إلى محلول collagenase two جديد وكرر عملية الحضن عندما لا تبقى أي تكتلات كبيرة. أنهِ عملية الهضم بإضافة ثلاثة milliliters من EBM two بدون as soic acid وفقاً لتحضير كل منها.

احفظ الأنابيب في حامل ساخن تحت غطاء السحب، ثم قم بطردها مركزياً عند 1000 ×g لمدة أربع دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد عملية الطرد المركزي، قم بإعداد معلق من كسور الخلايا من نفس العينة الأولية في 1 مل من 0.25% trypsin EDTA في PBS. ثم حضن المعلق لمدة خمس دقائق في الكتلة الساخنة، ثم قم بتثبيط trypsin باستخدام 4 مل من EBM-2 بدون ascorbic acid.

بعد ذلك، مرر الخلايا عبر إبرة قياس 18 في حقنة سعة 2.5 milliliter حتى سبع مرات إلى أن تختفي التكتلات الكبيرة تحت المجهر. ثم قم بطرد الخلايا مركزياً عند 1000 ×g لمدة أربع دقائق. الآن، أعد تعليق كتلة الخلايا في E BM two ووزعها على شرائح غرف ذات بئرين.

ستكون الخلايا جاهزة للتحليلات بعد يومين إلى ثلاثة أيام من الحضن. تم توليد CMS من عدة خطوط خلايا IPS. تم توليد هذه الخطوط في البداية على طبقة مغذية من خلايا meth، ثم وُضعت مباشرة على matrigel باستخدام وسط محدد.

أظهرت الخلايا مورفولوجيا مشابهة للخلايا الجذعية الجنينية البشرية (human ESC) مع حواف ساطعة في مجهر تباين الأطوار ونوى بارزة. وأظهر تحليل التألق المناعي أن خلايا IPS عبرت بشكل صحيح عن عامل النسخ T four وعن المستضد السطحي TRA one 60. كما أكد تحليل قياس التدفق الخلوي التعبير عن مستضدات تعدد القدرات السطحية النموذجية، SS EEA four و TRA one 60.

تظهر استراتيجية تحديد البوابات في مخطط التشتت الأيسر. كما أُجري تحليل للنمط النووي لخلايا IP FS التي نمت على هلام المصفوفة (matrix gel). وقد تم تحفيز التمايز إلى السلالة القلبية عن طريق تجميع خلايا IPS في أجسام جنينية (ebs)، بالإضافة إلى الزرع في وجود نوع محدد من المصل.

وبما أن المناطق التي تتقلص فيها حمض السوربيك قد مثلت من 20 إلى 35% من إجمالي المزرعة اعتماداً على الخط الخلوي المستخدم، فقد تم عزل الخلايا العضلية القلبية (CMS) المتقلصة من هذه المناطق عن طريق الهضم الإنزيمي وتحليل التعبير البروتيني. وقد كشف تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي (R-T-P-C-R) عن تعبير للقنوات الأيونية النوعية للقلب في الخلايا النابضة المشتقة من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (IPS)، ولكن ليس في الخلايا غير النابضة.

شملت هذه القنوات قناة ألفا 1، وهي وحدة فرعية من قناة كالسيوم المعتمدة على الجهد، ووحدة فرعية ألفا من قناة صوديوم من النوع الخامس المعتمدة على الجهد، وقناة بوتاسيوم معتمدة على الجهد من العائلة الفرعية الشبيهة بـ KQT، وكلا شكلي الميوسين. كشف تحليل الفلورة المناعية للسلسلة الثقيلة أن الخلايا العضلية القلبية المنبثقة من IPS عبرت عن البروتينات الهيكلية، وألفا الساركوميرية، والأكتين، وتروبونين I القلبي، وبروتين الوصل النوعي للقلب، كونيكسين 43. وفي النهاية، مهدت هذه التقنية الطريق فعلياً لنمذجة أمراض عضلة القلب في المختبر وتسمح بتجربة الأدوية في سياق بشري دون الحاجة إلى حقن الدواء في أجسام البشر.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية الحفاظ على خلايا IPS في ظروف خالية من السيروم وتمايزها إلى خلايا عضلة القلب من خلال طريقة تعتمد على تجميع الأجسام الجنينية.