جيل من العضلية الإنسان: البروتوكول التمايز من خالية من الطاعم المستحثة الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان

الهدف العام من هذا الإجراء هو التمييز بين خلايا عضلة القلب البشرية وخلايا IPS البشرية المزروعة في ظروف خالية من المغذيات. يتم تحقيق ذلك عن طريق طلاء خلايا IPS أولا في ألواح تعلق منخفضة للغاية لتشكيل أجسام الجنين. الخطوة الثانية من الإجراء هي نقل أجسام الأجنة المشكلة إلى أطباق مغلفة بالجيلاتين.

عندما تظهر مناطق الانقباض ، يتم تشريحها يدويا تحت المجهر الاستريو وطلاءها على أطباق مغلفة بالفيبرونيكتين. لمزيد من التمايز ، تتمثل الخطوة الأخيرة في الحصول على خلايا عضلة قلبية مفردة عن طريق الهضم الأنزيمي للعناقيد المتقلصة. في النهاية ، يمكن أن تظهر النتائج تمايزا في خلايا عضلة القلب مثل الخلايا التي تعبر عن العلامات الهيكلية النموذجية ، أي تروبونين القلب من خلال الفحص المجهري المناعي.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على سؤال رئيسي في مجال بيولوجيا القلب والأوعية الدموية ، مثل الآلية التي تقود تمايز القلب والخلل الوظيفي أثناء نمو القلب والأمراض على مستوى خلايا عضلة القلب البشرية. هذه تقنية مثيرة للاهتمام للغاية لأنها تسمح بتوليد خلايا عضلة القلب في المختبر من المرضى البشريين والأفراد من البشر. وفي الحالة الثانية ، يسمح بتلخيص المرض في أنبوب الاختبار بحيث يمكن تجربة أدوية جديدة في المختبر قبل الذهاب إلى الجسم الحي.

التجريب ابدأ بمزارع خلايا IPS المتجمعة المزروعة على ألواح مطلية ب 35 ملم. استبدل وسط النمو بملليلتر واحد من PBS يحتوي على مليغرام من diss. افحص الخلايا باستخدام ماصات زجاجية مسقطة.

قم بإزالة المناطق ذات الخلايا المتمايزة مثل الحفرة الشبيهة بالبوهة أو الهياكل الكيسية في وسط المستعمرات. قم أيضا بإزالة أي مناطق انفصلت فيها الخلايا وتسويتها ويبدو أنها تهاجر إلى الخارج. الآن احتضان الخلايا المتبقية عند 37 درجة مئوية تحت غطاء مزرعة حتى تصبح حدود المستعمرة أكثر إشراقا وتبدأ في الانفصال.

يستغرق هذا عادة ما بين خمس وسبع دقائق. في هذه المرحلة ، قم بإزالة محلول dispa وغسل الخلايا بملليلتر واحد من HESM. ثم تخلص من محلول الغسيل.

في مليلتر جديد من HESM ، استخدم رافع الخلايا لحصاد المستعمرات. اجمع المستعمرات في أنبوب سعة 15 مل. بعد ذلك ، اشطف الخلايا بمليلتر آخر من HESM وقم بتدويرها عند 1000 مرة جم لمدة أربع دقائق.

ثم تابع طلاء الخلايا على ماتريجيل وقم بتغيير الوسائط يوميا أثناء الزراعة. ابدأ بحصاد مستعمرات IPS غير المتمايزة كما هو موضح في القسم السابق. بمجرد عزل المجموعات السكانية غير المتمايزة ، قم بتعليقها برفق في مليلتر واحد من EBM 20.

باستخدام ماصة سعة ملليلترين ، لا تقم بتفتيت كتل الخلايا كثيرا. قلل من سحب العينات إلى ضربتين أو ثلاث ضربات. تحقق من حجم المستعمرات تحت المجسم بين السكتات الدماغية.

عندما تكون المستعمرات كلها بنفس الحجم تقريبا ، فإنها لا تحتاج إلى مزيد من الخلط. الآن قم بوضع الخلايا على ألواح مرفقة منخفضة للغاية تملأ صفيحة واحدة من ستة آبار لكل صفيحة من الخلايا التي تم حصادها. لا تنس شطف الأنبوب بملليلتر واحد من EBM 20 وتوزيع الشطف على اللوحة.

بعد اليوم الثالث من الحضانة ، قم بتغيير الوسائط باستخدام المجهر لتجنب إزالة جثث الأجنة. احتفظ بالماصة بالقرب من حافة اللوحة. في اليوم السابع ، انقل أجسام الأجنة إلى صفائح مغلفة ب 0.1٪ جيلاتين دافئ عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.

أضف 35 إلى 40 جثة جنينية إلى كل طبق 35 ملم في ملليلترين من المتوسط. أثناء الزراعة. قم بتغيير الوسيط مرتين في الأسبوع بانتظام.

افحص أجسام الجنين بحثا عن مناطق الضرب وحدد مكان وجود مناطق الديكور الخرزية. في الجزء العلوي من غطاء الطبق ، يجب أن تظهر مناطق التعاقد مع الخرز بعد حوالي 10 إلى 20 يوما. عندما تظهر المناطق ذات الانكماش التلقائي ، قم بتبديل وسيطها إلى EBM الثاني بعد ظهور مناطق الانقباض ، استمر في زراعة ومراقبة المناطق الأخرى على اللوحة لمدة تصل إلى شهر.

في المجموع. في EBM الثاني ، يعتمد نقص عملية التمايز بشكل كبير على عدة عوامل ، أهمها خطوط الخلايا المحددة ومجموعة المصل المستخدمة للحث على تمايز القلب. للحصول على أعلى كفاءة ، اختبر عدة خطوط للإمكانات القلبية ودفعات مختلفة من المصل ابدأ بطلاء 12.

أن تغطي ألواح الآبار التي تحتوي على خمسة ميكروغرام لكل سنتيمتر مربع من الفيبرونيكتين في PBS 300 ميكرولتر لكل بئر سطح كل بئر بالكامل. اترك الألواح تجف مكشوفة في غطاء مزرعة الخلايا. لإزالة منطقة الديكور من مزرعة الخلايا ، استخدم ماصة زجاجية مسحوبة ومشرط.

ثم باستخدام ماصة سعة مليلتر واحد ، انقل أربعة إلى خمسة مشابك إلى كل بئر من الصفيحة المطلية بالفيبرونيكتين. بمجرد إجراء جميع المجموعات ، أضف ملليلتر واحدا من EBM اثنين إلى الآبار المحملة على مناطق علامة لوحة التجميع حيث تمت إزالة الخلايا. ثم قم بتغيير الوسيط وأعد اللوحة إلى غطاء الغطاء.

إذا كانت هناك حاجة إلى كتل خفق أصغر تحت مجهر ستيريو ، فقم بتمرير المناطق المزروعة عبر ماصة. ينتج عن هذا مجموعات صغيرة تحتوي على عدد قليل من الخلايا النابضة. في الثقافة.

قم بتغيير الوسيط مرتين أسبوعيا حتى يصبح جاهزا للتحليل. أولا ، قم بإعداد شرائح غرفتين مربعة بحجم أربعة سنتيمترات عن طريق طلاءها ب 20 ميكروغراما من الفبرونيكتين المخففة في ما يكفي من PBS لتغطية السطح. إذا تم استخدام دعامة زجاجية ، أضف 20 ميكروغراما إضافيا من اللامينين.

عزل منطقة زراعة الخرز كما هو موضح سابقا. باستخدام ماصة سعة مليلتر واحد ، انقل الخلايا إلى أنبوب سعة 15 مليلتر يحتوي على 500 ميكرولتر من أنبوب الكولاجيناز. احتضان الخلايا لمدة 15 دقيقة ورج الأنبوب مرة واحدة أثناء الحضانة.

بعد 15 دقيقة ، حرك الخلايا عبر ماصة سعة 200 ميكرولتر لإزالة التكتلات إذا بقيت أي كتل. انقل الخلايا إلى الكولاجيناز الطازج الثاني وكرر الحضانة عندما لا تترك كتل كبيرة. قم بإنهاء عملية الهضم بإضافة ثلاثة ملليلتر من EBM اثنين بدون حمض الصويك كما يتم تحضير كل منهما.

قم بتخزين الأنابيب في رف ساخن أسفل غطاء المحرك ، ثم قم بطردها بمعدل 1000 مرة جم لمدة أربع دقائق في درجة حرارة الغرفة. بمجرد الطرد المركزي ، قم بعمل تعليق لأجزاء الخلية من نفس العينة الأولية في مليلتر من 0.25٪ تريبسين EDTA في PBS. ثم احتضان التعليق لمدة خمس دقائق في الكتلة الساخنة ، وقم بتعطيل التربسين بأربعة ملليلتر من E BM اثنين بدون حمض الصويك.

بعد ذلك ، قم بتمرير الخلايا عبر إبرة قياس 18 على حقنة سعة 2.5 مليلتر حتى سبع مرات حتى لا تظهر كتل كبيرة تحت المجهر. ثم قم بالطرد المركزي للخلايا عند 1000 مرة G لمدة أربع دقائق. الآن قم بإعادة تعليق حبيبات الخلية في E BM اثنين وقم بوضعها على شريحتين لغرفة البئر.

ستكون الخلايا جاهزة للتحليل بعد يومين إلى ثلاثة أيام من الحضانة. تم إنشاء CMS من العديد من خطوط خلايا IPS. تم إنشاء هذه الخطوط في البداية على طبقة تغذية الميثامفيتامين ووضعها على الفور على ماتريجيل باستخدام وسيط محدد.

أظهرت الخلايا مورفولوجيا شبيهة ب ESC البشري مع حواف مشرقة ونوى بارزة. أظهر تحليل التألق المناعي أن خلايا IPS عبرت بشكل صحيح عن عامل النسخ T four وعبرت عن مستضد سطحي TRA one 60. أكد التحليل المتري Cyto fluoro التعبير عن مستضدات متعددة القدرات السطحية النموذجية ، SS EEA four و TRA one 60.

يتم عرض استراتيجية البوابات في المبعثر الأيسر. كما تم إجراء تحليل النمط النووي لخلايا IP FS المزروعة على هلام المصفوفة. تم تحفيز الحث في سلالة القلب عن طريق تجميع خلايا IPS في ebs ، جنبا إلى جنب مع الزراعة في وجود نوع معين من المصل.

وبما أن مناطق تقلص حمض السوربيك تمثل 20 إلى 35٪ من إجمالي الثقافة اعتمادا على خط الخلية المستخدم. تم عزل CMS المتعاقد من هذه المناطق عن طريق الهضم الأنزيمي وتحليله للتعبير عن البروتين. وجد R-T-P-C-R تعبيرا عن القنوات الأيونية الخاصة بالقلب المعبر عنها في الخلايا النابضة المشتقة من IPS ، ولكن ليس في الخلايا غير النابضة.

تضمنت هذه القنوات ألفا واحدة ، ووحدة فرعية لقناة الكالسيوم المعتمدة على الجهد ، ووحدة فرعية ألفا لقناة الصوديوم ذات الجهد الخامس ، وقناة بوابات بجهد البوتاسيوم من KQT ، مثل الفصيلة الفرعية ، وكلا الشكلين من الميوسين. كشف تحليل التألق المناعي ذو السلسلة الثقيلة أن خلايا عضلة القلب المشتقة من IPS المفردة تعبر عن البروتينات الهيكلية ، وساركوميري ألفا ، والأكتين ، والتروبونين القلبي الأول ، والوصلة الخاصة بالقلب ، Conexion 43. بعد كل شيء ، مهدت هذه التقنية الطريق حقا لنمذجة أمراض عضلة القلب في المختبر وتسمح بتجربة الأدوية في البيئة البشرية دون حقن الدواء في أجسام الإنسان.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية الحفاظ على خلايا IPS في ظروف حرة وتمييزها إلى خلايا عضلة القلب من خلال طريقة تعتمد على تجميع أجسام الأجنة.