A انواع معينة ايليجانس النظام النموذجي للدراسات Amylopathy

الهدف العام من هذا الإجراء هو تقييم آثار سمية بيتا النشوانية على وظيفة الخلايا العصبية والبقاء على قيد الحياة. يتم تحقيق ذلك عن طريق إنشاء ديدان C أنيقة معدلة وراثيا أولا تعبر عن ببتيد بيتا الأميلويد مع مراسل GFP في الخلايا العصبية الحسية SE. بعد ذلك ، يتم تقييم النتيجة السلوكية للتعبير عن بيتا الأميلويد في الخلايا العصبية SE عن طريق اختبار الانجذاب الكيميائي.

تتمثل الخطوة الثالثة في الحصول على الثقافات الأولية للخلايا العصبية SE ثم معالجة الخلايا العصبية المستنبتة بعوامل دوائية مثل Q-V-D-O-P-H لقمع التأثير السام لبيتا النشوانية. في النهاية ، يمكن أن تظهر النتائج آثار سمية بيتا النشوانية على وظيفة الخلايا العصبية SE والبقاء على قيد الحياة من خلال المقايسات السلوكية والدوائية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول التنكس العصبي ، مثل توضيح آليات خلوية وجزيئية محددة.

التأثيرات السامة العصبية الكامنة لقلة بيتا النشوان. يوضح الإجراءات الدكتور زينغ دوان ، باحث ما بعد الدكتوراه من مختبري للتحول ، يلزم وجود 2٪ من منصات حقن agros. ضع قطرة من الأروس الساخنة المذابة في الماء على زلة غطاء زجاجي ، وقم بوضع زلة غطاء ثانية بسرعة على القطرة واضغط عليها برفق.

عند صنع مزيج الحقن ، تأكد من تحريك الميكرولترات الخمسة العلوية ونقلها ، الخالية من الحطام والملوثات الأخرى إلى أنبوب جديد لتحميل الحقن ومزيج الحقن وتفريغ البلازميد في ماصة الحقن عن طريق العمل الشعري. عادة ما يكون نصف ميكرولتر كافيا لحقن 100 دودة لتوسيع الفتحة الموجودة على ماصة الحقن ، وفرك طرفها على حافة زلة الغطاء المثبتة على شريحة زجاجية زيت هالو كربون 700. جودة الافتتاح أمر بالغ الأهمية.

يتم الحكم عليه من خلال شكل الطرف، والأهم من ذلك، من خلال معدل التدفق، الذي يتم تقييمه من خلال التدفق وحجم الفقاعات التي تتشكل عند طرف الماصة استجابة لضغط الحقن. الآن ضع قطرة من 700 زيت كربون مقدس على وسادة حقن وانقل عدة ديدان إلى الوسادة. استخدم عود دودة لدفع الديدان لأسفل على الوسادة حتى تلتصق بالعروق.

يجب توجيه الديدان في صفوف مع محاذاة جوانبها البطنية. تجنب لمس رؤوسهم. إذا فشلت الديدان بعد عدة محاولات في الالتصاق بالوسادة ، فجرب وسادة جديدة أو قم بزيادة سمك agros أو تركيز الوسادة.

الآن أدخل الماصة في الدودة. أولا ، حرك المرحلة لوضع الدودة أسفل الماصة ثانيا. ضع الماصة بجوار النواة المركزية للغدد التناسلية.

نظرا لأن السيتوبلازم مشترك بين العديد من نوى الخلايا الجرثومية ، فإن هذا يحسن من احتمالية انتقال الحمض النووي المحقون إلى النسل. يجب أن تكون الماصة موازية تقريبا للدودة. ثالثا ، حرك الطرف عموديا نحو الجسم حتى يكتئب الجلد.

أخيرا ، اضغط برفق على المعالج للحث على إدخال الأطراف. الآن حقن محلول الحمض النووي. اضغط على الماصة حتى تتضخم الغدد التناسلية.

ثم أوقف التدفق واسحب الدودة من الماصة. اختبر تدفق الإبر ، ثم حقن الغدد التناسلية الأخرى قبل الانتقال إلى الدودة التالية. بعد الحقن ، أضف حوالي 10 ميكرولتر من مخزن الاسترداد إلى الديدان وانتظر حتى تبدأ السباحة.

بمجرد السباحة ، أضف حجما متساويا من M تسعة. عندما تستأنف الديدان السباحة ، استمر في إضافة M تسعة حتى يصبح المحلول في الغالب M تسعة. الآن انقل كل دودة إلى طبق جالس.

اجمع ديدان GR في مليلتر واحد من M تسعة عازلة في أنبوب صقر سعة 50 مل. ثم باستخدام المخزن المؤقت M nine ، اغسل الديدان عن طريق الطرد المركزي المتكرر واستبدال المحلول حتى يصبح M تسعة صافيا بعد الغسيل. بعد ذلك ، أضف 10 أحجام من محلول هيبوكلوريت الأساسي إلى القمل.

تحتضن الديدان المحببة الديدان في درجة حرارة الغرفة حتى يتم كسر حوالي أربعة أخماسها ، والتي تستغرق عادة 10 دقائق. راقب التفاعل عن طريق أخذ حصص لعرضها بالمجهر. أوقف التفاعل عن طريق إضافة حجم متساو من المخزن المؤقت للبيض المعقم.

ثم اجمع البيض والذبائح عن طريق الطرد المركزي عند 450 جم لمدة خمس دقائق. قم بإزالة المادة الطافية برفق. أضف حجما متساويا من المخزن المؤقت للبيض وقم بالطرد المركزي للأنبوب مرة أخرى عند 450 جم لمدة خمس دقائق.

كرر الإجراء حتى يصبح المخزن المؤقت واضحا. الآن قم باحتضان البيض طوال الليل في M nine buffer ، وفي اليوم التالي ، قم بزرعها على ألواح NGM القياسية. تحضير عدة مكعبات من أجار ، حوالي نصف سنتيمتر على الجانب.

انقعي قطع الأجار في محلول يحتوي على الجاذب المطلوب لمدة ساعتين. قم بإيداع قطعة أجار في لوحة اختبار 10 سنتيمترات حيث تم تحديد موقع بقعة الاختبار ونقطة التحكم. قم بإعداد خمسة لوحات من هذا القبيل لكل تجربة.

اسمح للصفائح بتكوين تدرج كيميائي عن طريق تركها طوال الليل عند 20 درجة مئوية في اليوم التالي. قبل التجربة ، أضف 10 ميكرولترات من أزيد الصوديوم 20 مللي مولار إلى كل بقعة على الألواح. هذا بمثابة مخدر.

ابدأ التجربة بوضع 20 دودة متزامنة في وسط اللوحة ، ثم وضع اللوحة في حاضنة 20 درجة مئوية لمدة ساعة. بعد ساعة ، عد في الاختبار على نقاط التحكم واحسب مؤشر CI. بعد تحلل الديدان gr وتنظيف البيض والجثث كما هو موضح سابقا ، أعد تعليقها في ملليلترين من مخزن البيض المعقم وأضف ملليلترين من السكروز المعقم بنسبة 60٪ في عازلة البيض.

ثم امزج الأنبوب يدويا أو عن طريق الدوامة حتى يتم تعليق البيض تماما. الطرد المركزي للبيض المعلق عند 450 مرة جم لمدة 15 دقيقة. ثم اجمع المادة الطافية المملوءة بالبيض بعناية وتخلص من الحنك لإزالة السكروز المتبقي ، وأعد تعليق البيض في عازلة البيض وقم بطردها عند 450 جم لمدة خمس دقائق.

اجمع المادة الطافية وتخلص منها برفق ثم كرر عملية التنظيف ثلاث مرات على الغطاء. استخدم عازلة بيض معقمة تحتوي على وحدة واحدة لكل مليلتر من الكيتيناز لإعادة تعليق البيض المحبب. اسمح للبويضات بالهضم في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة ، ثم ابدأ في مراقبة التفاعل تحت مجهر زراعة الخلايا المقلوب.

عندما يتم هضم 70 إلى 80٪ من قشر البيض ، أضف خمسة ملليلتر من وسائط ثقافة L 15 الكاملة أو CM 15. لعزل الخلايا ، قم بفصل الخلايا حتى لا تشكل كتل عن طريق تدفقها عبر إبرة قياس 27 عدة مرات. الآن قم بتمرير المحلول من خلال حقنة بمرشح خمسة ميكرون.

حبيبات تعليق الخلية المنفصلة عن طريق الطرد المركزي عند 450 جم لمدة 15 دقيقة. ثم قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا المحببة في CM 15. للتأكد من انفصال الخلايا ، تحقق من المعلق تحت المجهر.

أخيرا ، قم بلوحة الخلايا المنفصلة على زلات الغطاء الزجاجي المطلية مسبقا. باستخدام ليكتين الفول السوداني ، يمكن الحفاظ على الخلايا في درجة حرارة الغرفة مع الهواء العادي لأكثر من أسبوعين. باستخدام تقنيات التحويل الموصوفة ، تم إنشاء دودة معدلة وراثيا للتعبير عن الإنسان بيتا 42 في الخلايا العصبية SE ، وهي الخلايا العصبية التي تكتشف الجاذبات القابلة للذوبان في الماء مثل البيوتين باستخدام مقايسة الانجذاب الكيميائي.

تم اختبار الديدان المعدلة وراثيا عمرها سبعة أيام. لم تواجه الضوابط مشكلة في العثور على البيوتين. على النقيض من ذلك ، يمكن لعدد قليل فقط من الديدان التي تعبر عن بيتا 42 العثور على بقعة الجاذبة.

مؤشر الانجذاب الكيميائي للبيوتين 0.68 مقابل 0.12 للديدان الضابطة والتجريبية على التوالي في ثلاثة إلى أربعة أيام. كان هناك أيضا انخفاض طفيف ولكن يمكن اكتشافه في المؤشر. خلية عصبية A SER مزروعة في أربعة أيام لا تزال تعبر عن GFP بعد تسعة أيام من الحياة.

ومع ذلك ، اختفى مضان GFP وكان يشتبه في أن موت الخلايا المبرمج يختبر هذه النظرية. تم تحضير الخلايا العصبية الأولية A SER كما هو موضح واستكمالها بمثبط كاسباز واسع الطيف. كما هو متوقع ، أوقف العلاج فقدان التألق مما يؤكد أن التعبير عن بيتا 42 البشري يؤدي إلى موت الخلايا المبرمج في الخلايا العصبية A SER.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية بناء الديدان المعدلة وراثيا الأنيقة ، ودراستها في المقالات السلوكية ، وكيفية الحصول على الثقافة الأولية من أمبروز.