Name: A انواع معينة ايليجانس النظام النموذجي للدراسات Amylopathy (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: تعلم تقييم سمية بيتا أميلويد على وظيفة الخلايا العصبية والبقاء باستخدام C. elegans المعدل وراثياً. تُظهر الدراسة تأثيرات السمية على السلوك والخلايا العصبية الأساسية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<p class="jove_content"&gt; نشكر الدكتور شوانغ ليو لقراءة نقدية للمخطوطة. كان PCL12 بناء هدية شكل الدكتور كريستوفر D. رابط. وأيد هذا العمل من قبل اثنين من المنح المؤسسة الوطنية للعلوم (0842708 و 1026958) ومنحة AHA (09GRNT2250529) إلى FS.</p

1. بناء الديدان المعدلة وراثيا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التحول. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد منصات حقن. وضع قطرة من الملفات الساخنة، 2٪ الاغاروز المذاب في الماء، على ساترة الزجاج. وضع بسرعة ساترة الثاني على انخفاض وبخفة ذلك. بعد عززت agarose، coverslips على الشرائح على حدة، وخبز وسادة ساترة في فرن فراغ في 80 درجة CO / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سحب الماصات. نستخدم سوتر P-97 ساحبة لسحب 1/0.5 مم OD / ID البورسليكات الشعيرات الدموية مع خيوط. هي مزورة ماصات مع طرف المغلقة التي مكسورة مفتوحة في مرحلة لاحقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد حقن المزيج. جعل الخليط الحقن التي تحتوي على الحمض النووي من الفائدة (20 نانوغرام / ميكرولتر لكل بناء)، بالإضافة إلى الحمض النووي البلازميد فارغة إلى تركيز النهائي من 150 نانوغرام / ميكرولتر. أجهزة الطرد المركزي الخليط الحقن لإزالة أي ملوثات. هذه الخطوة أمر بالغ الأهمية لأن الملوثات تقليل كفاءة التحول. نقل أعلى 5 ميكرولتر (الحطام وغيرها من الملوثات تتجمع في الجزء السفلي) إلى أنبوب جديد لبه المستخدمة في الحقن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل حقن مزيج من قبل الشعرية. هي مغمورة الجزء السفلي من ماصة في مزيج الحقن. عادة 0.5 ميكرولتر كافية لحقن 100 الديدان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل حقن ماصة. إدراج ماصة على حامل من مياداة مجهرية وكسرها مفتوحة عن طريق فرك طرفها ضد حافة الانزلاق الغطاء شنت على شريحة زجاجية أو بدلا من الحطام على لوحة الاغاروز. هذا هو خطوة حاسمة عن نصائح كبيرة من الضرر الدودة وانسداد بسهولة نصائح صغيرة جدا. نوعية من طرف مكسورة يمكن الحكم عليها من خلال الشكل والأهم من ذلك وفقا لمعدل التدفق. ويمكن تقييم معدل التدفق حسب حجم الفقاعات التي تتدفق من طرف المفتوحة مغمورة في قطرة من النفط 700 الهالوكربون استجابة لضغط الحقن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الديدان لوحة الحقن. وضع قطرة من النفط 700 الهالوكربون على وسادة الحقن ونقل العديد من (1 أو 2 للمبتدئين) الديدان للزيت. استخدام دودة اختيار لدفع الديدان أسفل على وسادة حتىY التمسك الاغاروز. يجب أن تكون الديدان الموجهة في الصفوف مع الجانبين بطني تواجه نفس الاتجاه. تجنب لمس رأس الدودة. إذا بعد عدة محاولات يفشل الديدان على الانضمام إلى وسادة، مع استبدال لوحة جديدة أو زيادة سماكة الاغاروز و / أو تركيز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج ماصة في دودة. عن طريق تحريك المرحلة، وضع دودة تحت ماصة. ضع ماصة في نواة مركزية من الغدد التناسلية بسبب السيتوبلازم لها يتم مشاركتها من قبل العديد من نوى الخلايا الجرثومية. وهذا يزيد من احتمال لتسليم الحمض النووي حقن لكثير من ذرية. ماصة يجب أن تقع موازية تقريبا لدودة (~ 15 درجة -25 درجة زاوية). دفع عموديا غيض من ماصة أسفل جسم الدودة حتى يتم الاكتئاب الجلد. ثم اضغط بلطف على مناور للحث على الإدراج غيض من. للحصول على أفضل النتائج على حد سواء حقن الغدد التناسلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن محلول الحمض النووي. ممارسة الضغط على لماصة حتى تتضخم الغدد التناسلية. وقف تدفق وسحب دودة قبالة ماصة. اختبار إبرة لتدفق ومن ثم الانتقالإلى دودة المقبلة والخطوات حقن تكرار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استرداد الديدان: إضافة قطرة (~ 10 ميكرولتر) من العازلة الاسترداد على الديدان واحتضان حتى تبدأ الديدان السباحة. إضافة حجم مساو من M9، انتظر حتى الديدان استئناف السباحة وكرر عدة مرات حتى الحل هو في الغالب M9. نقل فردي الديدان لوحات المصنف. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التكامل. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع 40 صحي، تغذية جيدة، L4 الديدان في لوحة جديدة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أشرق مع γ-ray مع 4،000 راد لمدة 40 دقيقة. نقل الديدان المشع (P0) في الطازجة، OP50 لوحات المصنف (4 الديدان / لوحة). ويمكن بدلا من ذلك للإشعاع الديدان مع جرعة من 300 ج / م 2 UVs و. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 10-20 transformants F1 من كل لوحة لوحات الفردية، وتسمية لوحات مع المقابلة P0 المنشأ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> واحد من 2-4 transformants F2 لكل F1 لوحات منفصلة. تحقق من ذرية F3 لنقل 100٪ من علامة التحول. عادة، 1-3٪ من ذرية من فيل دودة المشعl له حدثا التكامل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل الأسهم من ثلاثة أو أكثر من الخطوط المحولة مستقلة. </li></ol></li></ol> 2. فحوصات السلوكية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العمر التزامن. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو الديدان في معيار 10 سم لوحات NGM + OP50 E. يتم التوصل حتى القولونية عدد كبير من السكان البالغين حامل (3-5 أيام). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الديدان في 50 مل أنابيب فالكون من قبل تعليقها في 1 مل M9 العازلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 5 مل M9 العازلة وأجهزة الطرد المركزي في 450 x ج لمدة 3 دقائق. تجاهل طاف. كرر 3-4X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في نهاية الطرد المركزي الماضي، إزالة طاف وإضافة 10 مجلدا من محلول هيبوكلوريت الأساسية (0.5 M هيدروكسيد الصوديوم، هيبوكلوريت 1٪ مختلطة طازجة) إلى مكعبات الديدان. في احتضان RT ل~ 10 دقيقة. رد فعل تحلل يمكن رصدها عن طريق وضع قطرة من رد فعل تحلل على ساترة ودراسة الديدان تحت المجهر. عندما يتم تقسيم حوالي 80٪ من الديدان يجب أن تتوقف على رد الفعل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وقف رد فعل تحلل من قبل الدينز نفس الحجم من العازلة بيضة معقمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع البيض (والذبائح) بواسطة الطرد المركزي في 450 x ج لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل البيض مع العازلة بيضة معقمة 2-3X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان البيض O / N في المخزن M9 والبذور منهم على لوحات NGM القياسية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الكيميائي الفحص. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد عدة قطع من أجار تقريبا 0.5x0.5x0.5 سم. نحن إيداع أجار في لوحة 10 سم ونقطع قطع أجار من هناك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقع قطعة أجار في محلول يحتوي على جاذبة المطلوب (في تشبع، تركيزات شبه تشبع) لمدة 2 ساعة. جاذبة النموذجية هي يسين (0.5 M)، البيوتين (0.2 M). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إيداع صك قطعة أجار في 10 سم لوحة الاختبار الذي تم وضع علامة على مكان وجود بقعة وبقعة اختبار التحكم (الشكل 1A). تسمح موازنة وتشكيل التدرج O / N (الشكل 1B). إعداد 5 لوحات لتجربة واحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل التجربة إضافة 10 ميكرولتر من 20 ملي نان 3 (anesthetic) إلى كل بقعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع 20 الديدان متزامنة العمر في وسط اللوحة. وضع لوحة في الحاضنة عند 20 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 1 ساعة، والاعتماد على الحيوانات في الاختبار / مراقبة اماكن وحساب مؤشر الكيميائي، (CI) على النحو التالي: <img alt="المعادلة 1" fo:content-width=".863in" fo:src="/files/ftp_upload/50435/50435eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50435/50435eq1.jpg" /> حيث N، N و N اختبار المركز الوطني للاستشعار.، تشير إلى العدد الكلي للحيوانات، وعدد من الحيوانات في بقعة الاختبار وعدد من الحيوانات في بقعة السيطرة. </li></ol></li></ol> 3. زراعة الخلايا الأولية الجنينية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ليز الديدان كما هو موضح في سن التزامن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وقف رد فعل تحلل وذلك بإضافة نفس الحجم من العازلة بيضة معقمة وأجهزة الطرد المركزي في 450 x ج لمدة 5 دقائق. تجاهل بلطف طاف والحرص على عدم فقدان البيض مكعبات. كرر 2-3X أو حتى طاف هو واضح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend مكعبات البيض (والذبائح) في 2 مل العازلة بيضة معقمة وإضافة 2 مل من العقيمة السكروز 60٪ في المخزن البيض. خلط هذا الحل حتى يتم معلق البيض تماما (لأنها تميل إلى تشكيل كتل تحت الطرد المركزي) باليد أو قبل vortexing. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي في 450 x ج لمدة 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل بعناية طاف (يحتوي على بيض) إلى أنبوب العقيمة. تجاهل بيليه الذي يحتوي على الذبائح وغيرها من المنتجات من تحلل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة السكروز المتبقية عن طريق إعادة التعليق على البيض في المخزن البيض والطرد المركزي في 450 x ج لمدة 5 دقائق. جمع بلطف وتجاهل طاف. كرر 3X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت غطاء محرك السيارة الصفحي resuspend البيض مكعبات في المخزن العقيمة التي تحتوي على البيض 1 U / مل كيتيناز في RT لهضم قشر البيض. بعد 30 دقيقة تبدأ في رصد رد فعل (تحت المجهر مقلوب خلية ثقافة). كل دفعة من كيتيناز لديه نشاط مختلفة قليلا. اكتمال عادة الهضم في 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما يتم هضم ما يقرب من 70-80٪ قشر البيض بواسطة كيتيناز إضافة CM-15 (L-15 خلية ثقافة ميدالبوتاسيوم التي تحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني، 50 U / مل البنسلين، و 50 ميكروغرام / مل الستربتوميسين). فصل الخلايا باستخدام حقنة مع مقياس 27. تعليق تصفية الخلية مع 5.0 ميكرون فلتر لإزالة الأجنة سليمة، وكتل من الخلايا واليرقات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيليه تعليق خلية فصلها بواسطة الطرد المركزي في 450 x ج لمدة 15 دقيقة. إزالة طاف و resuspend بيليه في CM-15 خلية ثقافة المتوسط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل الخلايا لوحة على غطاء زجاجي زلات المغلفة سابقا مع كتين الفول السوداني (0.1 ملغ / مل) الذائب في الماء ملاحظة: الخلايا يجب أن تلتزم الركيزة من أجل التفريق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكن الحفاظ على الخلايا في RT (16-20 درجة مئوية) في الهواء لمدة أكثر من 2 اسابيع. </li></ol>

<ol><li>Hardy, J., Allsop, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+deposition+as+the+central+event+in+the+aetiology+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Pharmacological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Amyloid deposition as the central event in the aetiology of Alzheimer's disease.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 12 (10), 383-388 (1991).</li>
<li>Kotzbauer, P. T., Trojanowsk, J. Q., Lee, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lewy+body+pathology+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Lewy body pathology in Alzheimer's disease.</a> Journal of Molecular Neuroscience. 17 (2), 225-232 (2001).</li>
<li>Greenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inclusion+body+myositis%3A+review+of+recent+literature%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Neurology+and+Neuroscience+Reports%22%5BJournal%5D)">Inclusion body myositis: review of recent literature.</a> Current Neurology and Neuroscience Reports. 9 (1), 83-89 (2009).</li>
<li>Revesz, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sporadic+and+familial+cerebral+amyloid+angiopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathology%22%5BJournal%5D)">Sporadic and familial cerebral amyloid angiopathies.</a> Brain Pathology. 12 (3), 343-357 (2002).</li>
<li>Hartmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+sites+of+intracellular+production+for+Alzheimer%27s+disease+A+beta40%2F42+amyloid+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Distinct sites of intracellular production for Alzheimer's disease A beta40/42 amyloid peptides.</a> Nature Medicine. 3 (9), 1016-1020 (1997).</li>
<li>Ohnishi, S., Takano, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+fibrils+from+the+viewpoint+of+protein+folding%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+sciences%3A+CMLS%22%5BJournal%5D)">Amyloid fibrils from the viewpoint of protein folding.</a> Cellular and Molecular Life sciences: CMLS. 61 (5), 511-524 (2004).</li>
<li>C. elegans II. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Cold+Spring+Harbor+Monograph%22">Cold Spring Harbor Monograph</a>. DL, R. iddle, et al. 1, M. 33, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. 1222(1997).</li>
<li>Cotella, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxic+role+of+k%2B+channel+oxidation+in+Mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Toxic role of k+ channel oxidation in Mammalian brain.</a> The Journal of Neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 32 (12), 4133-4144 (2012).</li>
<li>Link, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+human+beta-amyloid+peptide+in+transgenic+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Expression of human beta-amyloid peptide in transgenic Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (20), 9368-9372 (1995).</li>
<li>Cai, S. Q., Sesti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidation+of+a+potassium+channel+causes+progressive+sensory+function+loss+during+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Oxidation of a potassium channel causes progressive sensory function loss during aging.</a> Nature Neuroscience. 12 (5), 611-617 (2009).</li>
<li>Yu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guanylyl+cyclase+expression+in+specific+sensory+neurons%3A+a+new+family+of+chemosensory+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Guanylyl cyclase expression in specific sensory neurons: a new family of chemosensory receptors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 3384-3387 (1997).</li>
<li>Bargmann, C. I., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemosensory+neurons+with+overlapping+functions+direct+chemotaxis+to+multiple+chemicals+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Chemosensory neurons with overlapping functions direct chemotaxis to multiple chemicals in C. elegans.</a> Neuron. 7 (5), 729-742 (1991).</li>
<li>Caserta, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Q-VD-OPh%2C+a+broad+spectrum+caspase+inhibitor+with+potent+antiapoptotic+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis+%3A+an+international+journal+on+programmed+cell+death%22%5BJournal%5D)">Q-VD-OPh, a broad spectrum caspase inhibitor with potent antiapoptotic properties.</a> Apoptosis : an international journal on programmed cell death. 8 (4), 345-352 (2003).</li>
<li>Christensen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primary+culture+system+for+functional+analysis+of+C.+elegans+neurons+and+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A primary culture system for functional analysis of C. elegans neurons and muscle cells.</a> Neuron. 33 (4), 503-514 (2002).</li>
</ol>

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

نحن هنا وصف نهج موحد، لدراسة الجوانب الخلوية والجزيئية من amylopathies باستخدام C. ايليجانس. مزايا هذا النهج ما يلي: 1) يتم الاحتفاظ منخفضة التكلفة C.elegans في طبق بتري العادية المصنف مع البكتيريا، في درجة حرارة الغرفة. 2) علم الوراثة قوية. ويمكن الحصول على الحيوانات المعدلة وراثيا في بضعة أشهر، ومجموعة واسعة من متواليات المروج هو متاح لدفع التعبير عن الجينات المرغوب في الخلايا العصبية المحددة. 3) بسيطة، وتتميز بشكل جيد، والجهاز العصبي. C. ايليجانس يمتل...

بيتا اميلويد (Aβ) هي الببتيد من 36-43 الأحماض الأمينية التي يتم تشكيلها بعد انشقاق متتابعة من البروتين اميلويد السلائف (APP) بواسطة β γ وsecretases 1. يعالج secretase γ نهاية C-محطة من الببتيد Aβ، وهي مسؤولة عن أطوال متغير ل 5. الأشكال الأكثر شيوعا من Aβ هي Aβ 40 و 42 Aβ، وهذا الأخير مرتبطا أكثر شيوعا لظروف مرضية مثل 5 م. بتركيزات عالية Aβ شكل β-الأوراق التي تتجمع لتشكيل الألياف اميلويد 6. الودائع الألياف هي المكون الرئيسي لويحات خرف المحيطة الخلايا العصبية. ويعتقد أن كلا ويحات وإنتشاري، الأوليغومرات Aβ غير لوحة، لتشكل أشكال المسببة للأمراض الكامنة وراء Aβ. معقد دراسة مختبرية من amylopathies العصبية من حقيقة أن هذه الشروط التقدم مع مرور الوقت. وبالتالي، فمن مهمر لتطوير الحيوانية لين العريكة وراثيا نماذج تكميلية لالفئران مع قصيرة العمر. هذه النماذج يمكن استخدامها لتوضيح جوانب محددة من amylopathies-عادة الخلوية والجزيئية وبحكم بساطتها، وتساعد على التقاط جوهر المشكلة. الدودة انواع معينة ايليجانس السقوط هو هذه الفئة. لديها فترة حياة قصيرة، ~ 20 يوما وبالإضافة العمليات الخلوية الأساسية بما في ذلك تنظيم التعبير الجيني، والاتجار البروتين، والربط العصبية synaptogenesis، و، إشارة الخلية، والموت تشبه الثدييات 7. ميزات فريدة من الدودة تشمل الوراثة قوية وعدم وجود نظام السفينة، والتي تمكن لدراسة الأضرار العصبية بشكل مستقل عن تلف الأوعية الدموية. من ناحية أخرى، فإن عدم وجود الدماغ يحد من استخدام C. ايليجانس لدراسة جوانب كثيرة من التنكس العصبي. وبالإضافة إلى ذلك، لا يمكن استنساخ وتحديد التوزيعات التشريحية للآفات أن يؤديها في هذا الحي. الحد الأخرىوتشمل ations صعوبة تقييم كل الاختلافات في ملامح التعبير الجيني وضعف السلوك معقدة وظيفة الذاكرة. نحن هنا وصف الطرق لتوليد C. ايليجانس نماذج من amylopathies.

<table><tbody><tr><td colspan = "4" ><قوي>1. NGM< / قوي ></td></tr> <tr><td>كلوريد الصوديوم</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>S5886</td><td>3 جم</td></tr><tr><td>أجار بكتريولوجي</td><td>أمريسكو</td><td>J637</td><td>17 جم</td></tr><tr><td>باكتو ببتون</td><td>أمريسكو</td><td>J636</td><td>2.5 جم</td></tr><tr><td>ماء</td><td></td><td></td> مقطر <td>إحضاره إلى 975 مل</td></tr><tr> < td colspan = "4" > معقم بالتعميم ، ثم أضف العناصر التالية واخلط جيدا</td></tr><tr><td>كبريتات</td> <td>المغنيسيومSigma-Aldrich</td><td>M2643</td><td>1 مل من 1 م مخزون</td></tr><tr><td>كلوريد الكالسيوم</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td>1 مل من مخزون 1 M</td></tr><tr><td>الكوليسترول</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3045</td><td>1 مل من مخزون 5 مجم / مل (في الإيثانول)</td></tr> <tr><td>مخزن فوسفات</td><td></td><td></td> البوتاسيوم <td>25 مل من مخزون 1M</td></tr> <tr>< td colspan = "4" >2. عازلة فوسفات البوتاسيوم< / قوي></td></tr><tr><td>فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدة</td><td>سيجما-ألدريتش</td><td>P5655</td><td>108.3 جم</td></tr><tr><td>فوسفات البوتاسيوم ثنائي القاعدة</td><td>سيجما-ألدريتش</td><td>P3786</td><td>35.6 جم</td></tr><tr><td>ماء</td><td></td><td></td> مقطر <td>يصل إلى 1 لتر</td></tr><tr> < td colspan = "4" >معقم عن طريق التعقيم</td></tr> <tr><td colspan = "4" >3. M9 buffer < / قوي ></td></tr> <tr><td>فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدة</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td>3 جم</td></tr><tr><td>فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5136</td><td>6 جم</td></tr><tr><td>كلوريد الصوديوم</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td>5 جم</td></tr><tr><td>كبريتات المغنيسيوم</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2643</td><td>1 مل من الماء المقطر 1 متر</td></tr> من الماء <tr><td>المقطر</td><td></td><td></td><td>إحضاره إلى 1 لتر</td></tr><tr><td colspan = "4" >تعقيم عن طريق التعقيم</td></tr> <tr>< td colspan = "4" ><قوي>4. عازلة البيض (درجة الحموضة 7.3 ، 340 مللي أسم) < / قوي ></td></tr> <tr><td>كلوريد الصوديوم</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>S5886</td><td>118 ملي</td></tr><tr><td>كلوريد البوتاسيوم</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>P5405</td><td>48 ملي</td></tr><tr><td>كلوريد الكالسيوم</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>C5670</td><td>2 ملي</td></tr><tr><td>كلوريد المغنيسيوم</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>M4880</td><td>2 ملي مولار</td></tr><tr><td>هيبس</td><td>فيشر العلمي</td><td>BP310</td><td>25 ملم</td></tr><tr><td>الماء</td><td></td><td></td> المقطر <td>يصل إلى 1 لتر</td></tr><tr> <td colspan = "4" >معقم عن طريق التعقيم</td></tr> <tr><td colspan = "4" >5. CM-15</td></tr><tr><td>L-15 متوسط</td><td>ثقافة جيبكو</td><td>11415</td><td>450 مل</td></tr><tr><td>مصل الأبقار الجنيني</td><td>جيبكو</td><td>10437-028</td><td>50 مل</td></tr><tr><td>بنسلين</td><td>جيبكو</td><td>15140</td><td>50 وحدة / مل</td></tr><tr><td>ستربتومايسين</td><td>جيبكو</td><td>15140</td><td>50 جم / مل</td></tr> <tr>< td colspan = "4" > اضبط على 340 مللي أوسالم مع السكروز ثم فلتر معقم في زجاجات معقمة وتخزينها عند 4 درجات ؛ C</td></tr><tr><td colspan = "4" ><قوي>6. الكواشف الأخرى < / قوية ></td></tr> <tr><td>هالوكربون 700 زيت</td><td>منتجات الهالوكربون</td><td>9002-83-9</td><td></td></tr><tr><td>5 & م Acrodisc حقنة مرشح</td><td>PALL Co.</td><td>4199</td><td></td></tr><tr><td>كيتيناز</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>C6137-5UN</td><td></td></tr><tr><td>ليكتين (فول سودي)</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>L0881-10 ملغ</td><td></td></tr><tr><td>هيدروكسيد الصوديوم</td><td>فيشر Scientific</td><td>S320</td><td></td></tr><tr><td>ليسين</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>L5501</td><td></td></tr><tr><td>البيوتين</td><td>سيجما-ألدريتش</td><td>B4639</td><td></td></tr><tr><td>محلول</td> <td>هيبوكلوريت الصوديومسيجما ألدريتش</td><td>425044</td><td></td></tr><tr><td>أزيد الصوديوم</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>71289</td><td></td></tr><tr><td>السكروز</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>S0389</td><td></td></tr></tbody></table>

a<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em&gt; النظام النموذجي للدراسات amylopathy

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

Amylopathy هو المصطلح الذي يصف تركيب غير طبيعي وتراكم اميلويد بيتا (Aβ) في الأنسجة مع مرور الوقت. Aβ هو السمة المميزة لمرض الزهايمر (AD)، ويوجد في الجسم ليوي الخرف، إدراج التهاب العضل في الجسم واعتلال الأوعية الدماغية اميلويد 1-4. Amylopathies تطوير تدريجيا مع مرور الوقت. لهذا السبب الكائنات بسيطة مع أعمار قصيرة قد يساعد في توضيح الجوانب الجزيئية لهذه الشروط. هنا، نحن تصف البروتوكولات التجريبية لدراسة تنكس عصبي Aβ بوساطة استخدام انواع معينة ايليجانس دودة. وهكذا، ونحن بناء الديدان المعدلة وراثيا عن طريق حقن الحمض النووي الترميز Aβ الإنسان 42 إلى الغدد التناسلية المخلوي من المنحرفين الكبار. واستقرت خطوط المحولة من قبل التكامل الطفرات التي يسببها. الديدان الخيطية هي سن متزامنة من خلال جمع وبذر بيضها. يتم اختبار وظيفة الخلايا العصبية معربا عن Aβ 42 في المقايسات السلوكية المناسب (الكيميائي مقايسةق). وتستخدم الثقافات العصبية الأولية التي تم الحصول عليها من الأجنة لاستكمال البيانات السلوكية واختبار آثار اعصاب من المركبات المضادة للأفكارك.

مع بروتوكولات لدينا دراسة آثار الإنسان Aβ 42 قليل وحدات في وظيفة الخلايا العصبية 8. وتتسع دائرة أي جزء ترميز Aβ الإنسان (42) وإشارة الببتيد الاصطناعي تسلسل الترميز من النار ناقلات pPD50.52 من بناء PCL12 9 باستخدام بادئات التي ادخلت سما 1 موقع نوكلياز داخلية التقييد في نهايات. ثم تم إدراج جزء في بناء تحتوي على 2،481-BP-6 FLP تسلسل المروج في ناقلات النار pPD95.75 بين فريد سما 1 موقع 10. باستخدام تقنيات التحول هو موضح في...

نحن تصف أساليب لدراسة جوانب amylopathies في الدودة<em&gt; C. ايليجانس</em&gt;. وتبين لنا كيفية بناء الديدان معربا عن Aβ الإنسان<sub&gt; 42</sub&gt; في الخلايا العصبية وكيفية اختبار وظيفتها في المقايسات السلوكية. وتبين لنا كيفية الحصول على مزيد من الثقافات العصبية الأولية التي يمكن استخدامها لاختبار الدوائية.

A<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em&gt; النظام النموذجي للدراسات Amylopathy

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of ...

الهدف العام من هذا الإجراء هو تقييم آثار سمية أميلويد بيتا على وظيفة الخلايا العصبية وبقائها. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق إنشاء ديدان *C. elegans* معدلة وراثياً تعبر عن ببتيد أميلويد بيتا مع مراسل GFP في الخلايا العصبية الحسية SE. بعد ذلك، يتم تقييم العواقب السلوكية للتعبير عن أميلويد بيتا في الخلايا العصبية SE من خلال مقايسة الانجذاب الكيميائي.تتمثل الخطوة الثالثة في الحصول على مستنبتات أولية من عصبونات SE، ومن ثم معالجة العصبونات المستنبتة بعوامل دوائية مثل Q-V-D-O-P-H لتثبيط التأثير السام لـ amyloid beta. وفي النهاية، يمكن أن تُظهر النتائج تأثيرات سمية amyloid beta على وظيفة وبقاء عصبونات SE من خلال المقايسات السلوكية والدوائية. ويمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية حول التنكس العصبي، مثل توضيح آليات خلوية وجزيئية محددة.الآثار السمية العصبية الكامنة لأوليغومرات أميلويد بيتا. سيقوم الدكتور زينج دوان، باحث ما بعد الدكتوراه من مختبري، بتوضيح الإجراءات. لعملية التحويل، يلزم توفير وسادات حقن أغاروز بنسبة 2%. ضع قطرة من أغاروز الساخن المذاب في الماء على شريحة غطاء زجاجية، ثم ضع بسرعة شريحة غطاء ثانية فوق القطرة وانقر عليها بخفة.عند تحضير خليط الحقن، تأكد من إجراء عملية الطرد المركزي ونقل الخمسة ميكرولتر العلوية، الخالية من الشوائب والملوثات الأخرى، إلى أنبوب جديد لشحنة الحقن، ثم اسحب خليط الحقن والبلازميد الفارغ إلى ماصة الحقن عن طريق الخاصية الشعرية. عادة ما يكون نصف ميكرولتر كافياً لحقن 100 دودة. ولتوسيع الفتحة في ماصة الحقن، قم بفرك طرفها مقابل حافة غطاء شريحة مثبت على شريحة زجاجية في زيت Halo carbon 700. وتُعد جودة الفتحة أمراً بالغ الأهمية.يتم الحكم على ذلك من خلال شكل الطرف، والأهم من ذلك، من خلال معدل التدفق، الذي يتم تقييمه عبر التدفق وحجم الفقاعات التي تتشكل عند طرف الماصة استجابة لضغط الحقن. الآن، ضع قطرة من زيت الكربون المجوف 700 على وسادة الحقن وانقل عدة ديدان إلى الوسادة. استخدم أداة التقاط الديدان لدفع الديدان لأسفل على الوسادة حتى تلتصق بالـ aros.يجب توجيه الديدان في صفوف بحيث تكون جوانبها البطنية متوازية. تجنب لمس رؤوسها. إذا فشلت الديدان في الالتصاق بالوسادة بعد عدة محاولات، فاستخدم وسادة جديدة أو قم بزيادة سمك الأجار أو تركيز الوسادة.أدخل الآن الماصة في الدودة. أولاً، حرك المنصة لوضع الدودة أسفل الماصة، ثانياً، ضع الماصة بجوار النواة المركزية للمناسل.نظرًا لأن السيتوبلازم مشترك بين العديد من نوى الخلايا الجرثومية، فإن هذا يزيد من احتمالية انتقال الحمض النووي DNA المحقون إلى النسل. يجب أن تكون الماصة في وضع موازٍ تقريبًا للدودة. ثالثًا، حرك الطرف رأسيًا باتجاه الجسم حتى ينضغط الجلد.أخيرًا، قم بالنقر برفق على أداة التحكم لتحفيز إدخال الرؤوس. الآن، قم بحقن محلول DNA. اضغط على الماصة حتى تنتفخ الغدد التناسلية.ثم أوقف التدفق واسحب الدودة بعيداً عن الماصة. اختبر تدفق الإبر، ثم احقن الغدد التناسلية الأخرى قبل الانتقال إلى الدودة التالية. بعد عمليات الحقن، أضف حوالي 10 µL من محلول الاسترداد (recovery buffer) إلى الديدان وانتظر حتى تبدأ في السباحة.بمجرد بدء السباحة، أضف حجماً مساوياً من منظم M nine. وعندما تستأنف الديدان السباحة، استمر في إضافة M nine حتى يصبح المحلول في معظمه من M nine. الآن انقل كل دودة إلى طبق استزراع.اجمع ديدان GR في 1 مل من محلول M9 المنظم في أنبوب فالكون سعة 50 مل. بعد ذلك، وباستخدام محلول M9 المنظم، اغسل الديدان عن طريق تكرار عمليات الطرد المركزي واستبدال المحلول حتى يصبح محلول M9 صافياً بعد الغسيل. بعد ذلك، أضف 10 أضعاف الحجم من محلول هيبوكلوريت قاعدي إلى الديدان.تُحضن الديدان المجمعة في شكل كريات في درجة حرارة الغرفة حتى يتم تكسير نحو خمسة أرباعها، وهو ما يستغرق عادةً 10 دقائق. يتم مراقبة التفاعل عن طريق أخذ عينات لمشاهدتها تحت المجهر. يتم إيقاف التفاعل بإضافة حجم مساوٍ من منظم البيض المعقم.بعد ذلك، يتم تجميع البيض والجثث عن طريق الطرد المركزي عند 450 G لمدة خمس دقائق. أزل السائل الطافي برفق. أضف حجماً مساوياً من محلول منظم للبيض (egg buffer) وقم بطرد الأنبوب مركزياً مرة أخرى عند 450 G لمدة خمس دقائق.كرر الإجراء حتى يصبح المحلول المنظم صافياً. الآن قم بحضن البيض طوال الليل في محلول M nine المنظم، وفي اليوم التالي، قم بزراعتها على أطباق NGM القياسية. قم بتحضير عدة مكعبات من الآجار، بطول نصف سنتيمتر تقريباً لكل ضلع.انقع قطع الآجار في محلول يحتوي على الجاذب المطلوب لمدة ساعتين. ضع قطعة آجار في طبق اختبار قطره 10 سنتيمتر، حيث تم تحديد موقع نقطة الاختبار ونقطة التحكم. جهز خمسة أطباق من هذا النوع لكل تجربة.اترك الأطباق لتكوين تدرج كيميائي عن طريق تركها طوال الليل عند 20 °C حتى اليوم التالي. قبل بدء التجربة، أضف 10 µL من sodium azide بتركيز 20 mM إلى كل بقعة على الأطباق. يعمل هذا كمخدر.ابدأ التجربة بوضع 20 دودة متزامنة العمر في مركز الطبق، ثم ضع الطبق في حاضنة بدرجة حرارة 20 °C لمدة ساعة واحدة. وبعد مرور ساعة، قم بعدد الحيوانات الموجودة في بقع الاختبار مقابل بقع التحكم واحسب مؤشر CI. بعد تحلل الديدان وتنظيف البيض والجثث كما تم وصفه سابقاً، أعد تعليقها في 2 mL من منظم البيض المعقم وأضف 2 mL من سكروز 60% المعقم في منظم البيض.بعد ذلك، اخلط الأنبوب يدوياً أو باستخدام جهاز الدوامة (vortex) حتى يتم إعادة تعليق البيوض تماماً. قم بطرد مركزي للبيوض المعاد تعليقها بسرعة 450 ×g لمدة 15 دقيقة. ثم اجمع بعناية الطافي المحتوي على البيوض وتخلص من الراسب لإزالة السكروز المتبقي، وأعد تعليق البيوض في محلول منظم للبيوض (egg buffer) ثم قم بطردها مركزياً بسرعة 450 ×g لمدة خمس دقائق.اجمع السائل الطافي بلطف وتخلص منه، ثم كرر عملية التنظيف ثلاث مرات تحت غطاء التدفق الصفحي. استخدم منظم بيض معقماً يحتوي على وحدة واحدة لكل ملليلتر من chitinase لإعادة تعليق البيض المترسب. اترك البيض لِيُهضم في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة، ثم ابدأ بمراقبة التفاعل تحت مجهر مقلوب لزراعة الخلايا.عند هضم 70 إلى 80% من قشور البيض، أضف خمسة milliliters من وسط استنبات L 15 الكامل أو CM 15. لعزل الخلايا، قم بفصل الخلايا بحيث لا تشكل تكتلات عن طريق تمريرها عبر إبرة قياس 27 gauge عدة مرات. الآن مرر المحلول عبر محقنة تحتوي على مرشح بحجم خمسة micron.قم بترسيب معلق الخلايا المفككة عن طريق الطرد المركزي عند 450 G لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك، قم بإزالة الطافي وأعد تعليق الخلايا المترسبة في CM 15. وللتأكد من تفكك الخلايا، افحص المعلق تحت المجهر.وأخيرًا، يتم توزيع الخلايا المفككة على شرائح زجاجية مطلية مسبقًا. وباستخدام ليكتين الفول السوداني، يمكن الحفاظ على الخلايا في درجة حرارة الغرفة وفي الهواء الطبيعي لأكثر من أسبوعين. وباستخدام تقنيات التحويل الموصوفة، تم بناء دودة معدلة وراثيًا للتعبير عن بروتين Beta 42 البشري في عصبونات a SE، وهي العصبونات التي تكتشف الجواذب القابلة للذوبان في الماء مثل البيوتين باستخدام مقايسة الانجذاب الكيميائي.تم اختبار ديدان معدلة وراثياً تبلغ من العمر سبعة أيام. ولم تواجه مجموعات الضبط أي صعوبة في العثور على البيوتين. وفي المقابل، تمكن عدد قليل فقط من الديدان التي تعبر عن beta 42 من العثور على بقعة الجذب.بلغ مؤشر الانجذاب الكيميائي للبيوتين 0.68 مقابل 0.12 للديدان الضابطة والتجريبية على التوالي في اليوم الثالث إلى الرابع. كما لوحظ انخفاض طفيف ولكن يمكن اكتشافه في المؤشر. عصبون A SER مستزرع في اليوم الرابع لا يزال يعبر عن GFP بعد تسعة أيام من الحياة.ومع ذلك، اختفى وميض GFP ويُشتبه في حدوث الموت الخلوي المبرمج (apoptosis)، ولاختبار هذه النظرية، تم تحضير عصبونات A SER الأولية كما هو موصوف مع إضافة مثبط كاسبيز واسع الطيف. وكما هو متوقع، أدى العلاج إلى وقف فقدان الوميض، مما يؤكد أن تعبير human A beta 42 يحفز الموت الخلوي المبرمج في عصبونات A SER.بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يتكون لديك فهم جيد لكيفية إنشاء الديدان المعدلة وراثياً، ودراستها في تجارب سلوكية، وكيفية الحصول على مزرعة أولية من Ambrose.

a-caenorhabditis-elegans-model-system-for-amylopathy-study

Research

JoVE Journal

Neuroscience

علم الأعصاب

يعاير β اميلويد السمية باستخدام المعدلة وراثيا C. ايليجانس النموذجي

لدراسة العلاقة بين توازن البروتين والإجهاد والشيخوخة ، راقبنا التغيرات في طي البروتين باتباع خلل البروتين ، وتوطين البروتين في الخلية واستقرار البروتين على مستويات الكائنات الحية والخلوية والبروتين ، باستخدام metazoan Caenorhabditis elegans القابل للتتبع وراثيا كنظام نموذجي.

استخدام Caenorhabditis elegans كنظام نموذجي لدراسة توازن البروتين في كائن حي متعدد الخلايا

نقدم هنا، ديدان أسطوانية ايليجانس كاينورهابديتيس كنموذج مضيف تنوعاً لدراسة التفاعل الميكروبية.

ايليجانس كاينورهابديتيس السلكية-نموذج تنوعاً في فيفو لدراسة التفاعلات بين الميكروبات والمضيف

هذا البروتوكول وصف أسلوب لزراعة ايليجانس كاينورهابديتيس على نطاق واسع في وسائل الإعلام الصلبة. كبديل لثقافة السائل، يسمح هذا البروتوكول الحصول على معلمات جداول مختلفة المزروعة المستندة إلى اللوحة. وهذا يزيد من قابلية النتائج للمقارنة بإهمال الاختلافات المورفولوجية والأيضية بين ثقافة وسائل الإعلام السائلة والصلبة.

زراعة الواسعة النطاق على أساس لوحة ايليجانس كاينورهابديتيس: "إعداد نموذج" "دراسة التعديلات الأيضي" في مرض السكري

المنتجات المترجمة غير المعتمدة على ATG المتكررة هي ميزات مسببة للأمراض الناشئة للعديد من الأمراض المتكررة القائمة على التوسع. الهدف من البروتوكول الموصوف هو تقييم السمية الناجمة عن هذه الببتيدات باستخدام المقالات السلوكية والخلوية في النظام النموذجي C. elegans.

قياس سمية الببتيد RAN في C. elegans

هنا ، نقدم ونصف منهجيات يمكن الوصول إليها على نطاق واسع باستخدام بعض نماذج الديدان الخيطية متعددة الاستخدامات ، بما في ذلك النخر الناجم عن القناة الأيونية المفرطة التنشيط وتكسية الأعصاب الناتجة عن البروتين ، لرصد وتشريح الأسس الخلوية والجزيئية للأمراض العصبية المرتبطة بالعمر.

النمذجة العمر المرتبطة الأمراض العصبية في Caenorhabditis elegans

يصف هذا البروتوكول اثنين من المقايسات الحساسة للتمييز بين خفيفة, معتدلة, وضعف الحركة الشديدة في نماذج C. elegans من التصلب الجانبي الضموري, مع فائدة عامة لسلالات C. elegans , مع تغيير الحركة.

تقييم ضعف المحرك في نماذج C. elegans من التصلب الجانبي الضموري

في هذه المقالة, نعرض كيفية استخدام نظام تسجيل النقاط السبع لقياس التغييرات التي تطرأ باستمرار على مورفولوجيا الخلايا العصبية الدوبامين في C. elegans. ويهدف هذا النظام لتحليلات المقايسات التنكس العصبي الدوبامين باستخدام النماذج الوراثية والكيميائية والعمرية من الاضطرابات العصبية.

تحديد مستويات الدوبامين الخلايا العصبية التغيير المورفولوجي وانحطاط في Caenorhabditis elegans

هنا ، نقدم بروتوكولا لتقييم أنشطة الحماية العصبية لمركبات الاختبار في Caenorhabditis elegans ، بما في ذلك تجميع polyglutamine ، وموت الخلايا العصبية ، وسلوك تجنب العلاج الكيميائي ، بالإضافة إلى تكامل مثالي للأنماط الظاهرية المتعددة.

Caenorhabditis elegans كنظام نموذجي لاكتشاف المركبات النشطة بيولوجيا ضد السمية العصبية بوساطة البولي جلوتامين

وأظهرت النهج لاختبار آثار العقاقير المضادة للذهان (APDS) في انواع معينة ايليجانس. وصفت فحوصات لاختبار آثار المخدرات على التنمية وقدرتها على البقاء وعلى معدل ضخ البلعوم. هذه الأساليب قابلة للتطبيق لتجارب pharmacogenetic مع فئات أخرى من المخدرات APDS أيضا.

أساليب لدراسة آليات عمل المضادة للذهان من أدوية في<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em

تعلم تقييم سمية بيتا أميلويد على وظيفة الخلايا العصبية والبقاء باستخدام C. elegans المعدل وراثياً. تُظهر الدراسة تأثيرات السمية على السلوك والخلايا العصبية الأساسية.

A

استكشف المزيد من الفيديوهات