إعادة تشكيل قناة كيلو فولت في الأغشية الدهنية للدراسات الهيكلية والوظيفية

الهدف العام من هذا الإجراء هو تقديم وصف تفصيلي لتقنيات الدراسة الوظيفية والتركيبية لتأثير الدهون على بروتينات الغشاء. ويتم تحقيق ذلك من خلال التعبير عن قناة البوتاسيوم ذات البوابة الجهدية وتنقيتها أولاً، تليها خطوة إعادة تشكيل القناة الأيونية.

بعد ذلك، يتم إجراء التسجيل الكهربائي للقنوات الأيونية في الطبقات الليبيدية المزدوجة لدراسة الوظيفة الوظيفية للقنوات الأيونية. والخطوة النهائية هي بلورة القنوات الأيونية في الغشاء لتحديد البنية. وفي الختام، تُستخدم المقايسات الكيميائية الحيوية، والطريقة الفيزيولوجية الكهربائية، ودراسة البلورات الإلكترونية لاستقصاء تأثيرات الليبيدات على حركة مستشعر الجهد في القنوات الأيونية.

بشكل عام، يواجه المبتدئون في هذه الطريقة صعوبات بسبب التفاصيل التقنية الكثيرة المتعلقة بإعادة تشكيل البروتين والتسجيلات الحيوية. نأمل أن يساعدك هذا الفيلم، من خلال استعراض العملية، في تنفيذ الإجراء بأكمله بنجاح. سيقوم الدكتور Hui Jim من مختبري بتقديم عرض توضيحي لكامل هذه العملية.

قبل تحضير الدهون، تم توفير أنبوب اختبار زجاجي مخصص للاستخدام مرة واحدة سعة 14 ملليلتر، وأنبوب زجاجي بغطاء لولبي، ومحقنة زجاجية سعة 250 ميكرولتر تحتوي على الكلوروفورم. ثم يتم نقل 10 ملليلتر من الكلوروفورم إلى أنبوب الاختبار. ولتحضير ليبوزومات POPE و POPG، يتم نقل 3.75 مليجرام من POPE و 1.25 مليجرام من POPG المذابين في الكلوروفورم إلى الأنبوب الزجاجي ذو الغطاء اللولبي.

جفف الدهون تحت تدفق مستمر من غاز الأرجون عندما لا يتبقى أي كلوروفورم مرئي. جفف الدهون بشكل إضافي تحت تفريغ الغرفة لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك، أضف 440 µL من محلول منظم منخفض الملوحة أو الماء إلى أنبوب الدهون المجففة باستخدام جهاز الفورتكس.

الأنبوب المخصص لترطيب الدهون. يجب أن يبدو معلق الدهون أبيض اللون وعكراً. بعد ذلك، قم بإجراء عملية السونكة (المعالجة بالموجات فوق الصوتية) لمعلق الدهون في حمام مبرد بالثلج حتى يصبح محلول الحويصلات شفافاً.

ثم أضف 50 µL من كلوريد البوتاسيوم بتركيز 3 M و 10 µL من DM بتركيز 0.5 M إلى الخليط بحيث يكون التركيز النهائي لمعلق الدهون 300 mM من كلوريد البوتاسيوم و 10 mM من DM، ثم حضن المحلول في جهاز تدوير لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة للسماح بتكوين خلايا M المختلطة من الدهون والمنظف. بعد التحضين، يجب أن يصبح المعلق عكراً قليلاً بسبب الاندماج الناجم عن المنظف للحويصلات الصغيرة من نوع ELLA. عندما يتم تركيز البروتين إلى أكثر من 2 mg/mL، أضف المكونات المدرجة، وخليط الدهون والمنظف للوصول إلى حجم نهائي قدره 1 mL.

بعد ذلك، يتم تحضين خليط البروتين والليبيد والمنظف في الأنبوب الزجاجي باستخدام جهاز تدوير (rotator) لمدة ساعتين إضافيتين. إن تحضير KVAP في خليط مع DTaP أو DOGS المذاب بالمنظف يشبه تحضير الليبيدات لحويصلات P-O-P-E-P-O-P-G. ومع ذلك، فإن عملية سونكة (sonication) الليبيدات المميّهة لتحويلها إلى حويصلات صغيرة غير شحمية تستغرق وقتاً أطول مما تستغرقه ليبيدات P-O-P-E-P-O-P-G، حيث قد تندمج حويصلات DOGS ببطء مع بعضها البعض وتكون قطرات زيتية صغيرة لإذابة dote أو DOGS تماماً.

تُخلط الحويصلات التي تم تعريضها للموجات فوق الصوتية مع 10 millimolar من DM و 40 millimolar من beta og. يُحضن خليط الدهون والمنظف طوال الليل في درجة حرارة الغرفة، ويجب أن يكون الخليط رائقاً تماماً وخالياً من أي جسيمات أو قطرات صغيرة. بعد ذلك، يُخلط بروتين KVAP مع DTaP أو DOGS المذاب في المنظف بنسبة بروتين إلى دهون تقل عن أو تساوي 1 إلى 10.

يُترك خليط البروتين والمنظف والليبيدات ليتحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة تتراوح بين ساعتين إلى ثلاث ساعات مع التدوير المداري المستمر. ولإثبات الإزالة البطيئة للمنظفات التي تمتلك تركيزاً حرجاً للمذيلات (CMC) مرتفعاً نسبيًا، مثل DM و Beta og، يتم أولاً تحضير لترين من محلول الديلزة المنظم لكل مليلتر واحد من الخليط.

ثم قم بقص طول مناسب من أنابيب الديلزة واغسلها بماء منزوع الأيونات (DI water) للتأكد من عدم وجود أي تسريب في الأنابيب. بعد ذلك، قم بتعبئة خليط البروتين والدهون والمنظف داخل أنابيب الديلزة. قم بإغلاق طرفي الأنابيب بالمشابك مع ترك أقل مساحة ممكنة فوق المحلول.

ضع الأنبوب المملوء على لوحة تحريك في محلول الديلزة بحيث يدور الأنبوب ببطء في المحلول. قم بتغيير محلول الديلزة مرة كل ثماني ساعات. والآن، قم بتجهيز حبيبات البوليسترين لإزالة المنظفات ذات التركيز الميكلي الحرج (CMC) المنخفض عن طريق وزن 0.5 grams من الحبيبات الجافة أولاً.

ثم ضعها في أنبوب Corning سعة 50 milliliter وأضف 20 milliliters من الميثانول، ثم قم بمعالجة المحلول باستخدام الموجات فوق الصوتية في حمام sonicate لمدة خمس دقائق لإزالة الفقاعات المحتبسة، وقم بتدوير الخرز بسرعة 5,000 RP لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، قم بتصريف الميثانول تماماً وكرر عملية الغسل باستخدام الإيثانول ومياه milli Q. ثم خزن الخرز المغسول في إيثانول بتركيز 20% عند درجة حرارة أربع درجات Celsius وقم بتغييره إلى محلول منظم خالٍ من المنظفات قبل الاستخدام. قم بتقدير كمية المنظفات في خليط البروتين والدهون والمنظفات المراد معالجته، واحسب كمية الخرز اللازمة لإزالة المنظفات.

قم بوزن الخرزات الرطبة دون وجود ماء زائد وأضفها مباشرة إلى خليط البروتين، ثم انتظر لمدة لا تقل عن 15 إلى 20 دقيقة حتى تصبح الخرزات فعالة تماماً. لإزالة 8.7 mg من DDM في 1 mL من المحلول، يتم تقسيم إجمالي 87 mg من خرزات البوليسترين، مثل bio beads SM two، إلى خمسة أجزاء متساوية. اخلط خليط البروتين والليبيدات والمنظف مع كل جزء لمدة 20 إلى 30 دقيقة مع تدوير مستمر من الطرف إلى الطرف في درجة حرارة الغرفة.

قم بطرد الخرزات بالتطويق، ثم انقل الطافي إلى الجزء التالي من الخرزات وكرر العملية حتى النهاية. في هذه الخطوة، ابدأ بتنظيف أنبوب اختبار زجاجي وقارورة عنبرية ذات غطاء لولبي مكسو بالتفلون ومجموعة من المحاقن الزجاجية باستخدام الكلوروفورم. بعد ذلك، جفف القارورة العنبرية تحت تدفق من غاز argon.

بعد ذلك، انقل 0.75 milligrams من POPE و 0.25 milligrams من POPG في الكلوروفورم إلى القارورة العنبرية وبخّر الكلوروفورم باستخدام غاز الأرجون. بعد ذلك، أضف 0.2 milliliters من البنتان إلى القارورة لإذابة الدهون المجففة وجففها تماماً لإزالة الكلوروفورم المتبقي. ثم أضف 50 microliters من الديكان إلى القارورة لإذابة الدهون المجففة.

الآن، قم بطلاء الفتحة المستديرة الموجودة على السطح الأسطواني للكأس ثنائي الطبقة بالليبيدات مع الحرص على عدم دخول أي محلول ليبيدي إلى داخل الفتحة. انتظر لمدة دقيقة إلى دقيقتين حتى يتبخر المذيب تماماً لإجراء التسجيلات الكهربائية من قنوات KVAP في الطبقات الليبيدية الثنائية. أدخل الكأس في غرفة التسجيل، وضع الجسور الملحية وقم بتوصيل الأقطاب الكهربائية بجانبي كأس التسجيل.

أضف محلول الكيسات إلى فتحات القطب الكهربائي، ومحلول CYS والمحلول الانتقالي (trans solution) إلى الكؤوس الخارجية والداخلية في الغرفة. بعد ذلك، اضبط إزاحة الجهد بين جانبي الكأس لتكون أقل من 2 millivolts، ثم ادهن الليبيد عبر الفتحة الموجودة في الغطاء. انتظر حتى يرق الغشاء ويصبح مستقراً نسبياً.

بمجرد استقرار الغشاء، قم بحقن 0.5 إلى 1 µL من القناة التي تحتوي على الحويصلات عن طريق وضع الطرف الدقيق لرأس ماصة P2 فوق الفتحة مباشرةً. تسقط الحويصلات عبر الفتحة إلى قاع الكوب.

لاختبار قنوات KVAP في الطبقة الثنائية، يتم تسليط نبضة قصيرة بقيمة 80 millivolts انطلاقاً من جهد التثبيت البالغ -80 millivolts؛ ونظراً للخمول السريع والتعافي البطيء من التنشيط، تترك فترة زمنية طويلة، تبلغ حوالي 120 seconds للقنوات في أغشية PEPG، بين نبضتين. وبمجرد أن يصبح حجم التيار مناسباً، يتم موازنة تركيزات الأيونات في المحاليل على كلا جانبي الغشاء عن طريق إضافة أملاح أيونية إضافية إلى الجانب ذي التركيز المنخفض.

توضح هذه الصورة بلورة ثنائية الأبعاد مصبوغة صبغاً سالباً، وذلك في منتصف عملية تحسين البلورات. صُبغت البلورات باستخدام 6%ammonium moate، بقيمة pH 6.4 بالإضافة إلى 0.5%triose، وذلك بسبب ميل السكريات إلى التراكم فوق بعضها البعض في بعض الأحيان. يشير المربع الأسود هنا إلى المنطقة التي ينتج عنها نمط الحيود الذي يحتوي على بقع الحيود.

عند دقة تصل إلى حوالي 20 angstrom، تظهر هنا صورة cryo EM لبلورة ثنائية الأبعاد من عينة مشابهة لتلك التي عُرضت سابقاً. خُلطت العينة مع 3%TLOs وجُمدت عن طريق الغمس المباشر، ثم صُوّرت باستخدام cryo EM عند 50,000 decks. ومن الواضح وجود عيوب موضعية في التراص البلوري.

إليك صورة أخرى مجهرية مبردة (cryo-EM) لبلورة جرى تحسينها بشكل أكبر. تم تضمين العينة في 0.75% tannin و10% tree hellos، والتقطت الصورة بتكبير 50,000 x. تشير الخطوط المستقيمة في التعبئة المتراصة إلى أن القنوات كانت منظمة جيداً في هذا النوع من البلورات، بينما يشير السهمان الأسودان إلى المتجهات المربعة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، آمل أن تكتسب تصوراً جيداً حول كيفية التعامل مع الدهون والبروتينات بشكل صحيح، وبإذن الله سيساعدك هذا الفيديو على دراسة تفاعل البروتينات الدهنية في الغشاء بشكل أكثر كفاءة.