كله المشبك التصحيح الخلايا لدراسة آليات التحفيز العصبية الأشعة تحت الحمراء

الهدف العام من التجربة التالية هو إنتاج نظام نموذجي لدراسة تأثيرات إضاءة الليزر بالأشعة تحت الحمراء على الخلايا العصبية السمعية في المختبر. يتم تحقيق ذلك عن طريق لقط التصحيح ، والخلايا العصبية السمعية المستنبتة في تكوين الخلية بأكملها من أجل استكشاف خصائصها الكهربائية. بعد ذلك ، يمكن أن يؤدي تعريض الخلايا العصبية للإشعاع بالليزر إلى استجابات كهربائية في الخلية المكشوفة ، والتي يمكن قياسها باستخدام إعداد مشبك التصحيح.

يمكن بعد ذلك تغيير معلمات الإضاءة والمتغيرات البيئية من أجل مراقبة تأثيراتها على الاستجابات الكهربائية المستحثة بالليزر. ستظهر الخلايا العصبية السمعية المعرضة لضوء الليزر نشاطا كهربائيا قابلا للتكرار استجابة لكل نبضة ليزر لتحليلها لاحقا. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول الآليات الكامنة وراء التحفيز بالأشعة تحت الحمراء للخلايا العصبية العقدية الحلزونية.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة للتحفيز بالأشعة تحت الحمراء للخلايا العقدية الحلزونية على وجه التحديد ، إلا أنه يمكن أيضا توسيعها لتشمل أنواع الخلايا الأخرى أو النماذج المبسطة مثل الطبقات الدهنية الثنائية لتوضيح العمليات الفيزيائية التي تنطوي عليها. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا مهما لضمان تحديد المواقع بدقة للألياف الضوئية لتوصيل الضوء ، لأن التعرض للإشعاع الناتج هو معلمة مهمة ، وقد أعدت ماصات دقيقة للتسجيل بمقاومة من اثنين إلى ستة ميجا أوم. يمكن سحبها من زجاج السيليكات المستعار باستخدام مجتذب ليزر CO2.

تحضير الليزر المقترن بالألياف. ستعمل مجموعة واسعة من الألياف الضوئية. ينتج عن قطع الألياف في تكوين سلك التصحيح مع موصلات FCPC إلى النصف رابطين من الألياف مع موصل في أحد طرفيه وألياف مكشوفة في الطرف الآخر.

هذه هي أسلاك التوصيل المصنوعة. قم بإعداد طرف الدب من ضفيرة واحدة عن طريق إزالة سترة الألياف وتنظيفها بالإيثانول والشق بأداة مناسبة تحت المجهر. تأكد من أن الطرف عمودي على محور الألياف وأنه يبدو مسطحا.

قم بتوصيل الطرف الآخر من ضفيرة الألياف بإخراج ليزر التحفيز باستخدام موصل مناسب إذا لزم الأمر. في هذه المرحلة ، تأكد دائما من قياس طاقة الليزر الناتجة من الألياف. افعل ذلك بعد أي تلاعب آخر بالنصيحة أيضا.

الآن أدخل الألياف في ظرف وقم بتثبيت الظرف في محدد الموضع الصغير المناسب. بعد ذلك ، حدد الزاوية التي تصنعها الألياف الضوئية مع زلة الغطاء. التقط صورة للترتيب واحسب الزاوية باستخدام الصورة J.Now ، قم بتأمين التوصيلات التي تزامن الليزر مع نظام الحصول على بيانات مشبك التصحيح.

يجب توصيل الإخراج الرقمي من نظام الحصول على بيانات مشبك التصحيح بالليزر عبر مولد وظيفة خارجي ، مما يجعل من الممكن تحديد معلمات نبض الليزر بشكل مستقل عن نظام الحصول على البيانات ، ويجب توصيل الإشارة المستخدمة لتشغيل الليزر مرة أخرى بمدخلات نظام الحصول على البيانات لضمان إمكانية تسجيل توقيت وطول نبضات الليزر بالتزامن مع الإشارة الفيزيولوجية الكهربية ، اضبط معدل تدفق نظام التروية على ما بين ملليلتر وملليلترين في الدقيقة. سيعمل نظام تغذية بالجاذبية مع سخان مضمن للتسخين السريع للمحلول ومضخة تمعجية لإزالة المحلول المستهلك عن طريق الشفط. حسنا. ضع زلة غطاء مع الخلايا المستنبتة في غرفة تسجيل المجهر المستقيم باستخدام هدف غمر الماء عالي التكبير وتباين الطور ، وحدد موقع الخلايا العصبية العقدية الحلزونية.

يتم تشكيل الخلايا العصبية العقدية الحلزونية النموذجية بشكل دائري وقطرها حوالي 15 ميكرون مع نواة بارزة. بمجرد تحديد موقع خلية عصبية مناسبة ، قم بالتبديل إلى هدف تكبير أقل وحدد موقع الخلية العصبية المستهدفة. ثم استخدم محدد الموضع الجزئي لتحريك الألياف الضوئية حتى يقترب الطرف من الخلايا العصبية المستهدفة في كل من المستويين الأفقي والرأسي.

ارجع إلى هدف التكبير العالي وضع طرف الألياف الضوئية في موضعه المقصود بجوار الخلايا العصبية. عند ضبط الوضع الرأسي للألياف ، من المهم أن تستقر الحافة السفلية للألياف على شفة الغطاء. لتقليل عدم اليقين في موقع الألياف ، يمكن تحديد نقطة الاتصال من الإشارات المرئية في صورة المجهر.

بمجرد أن تصبح الألياف في موضعها ، حركها للخارج بكمية معروفة على طول محورها الطولي حتى لا تؤثر على موضع الماصة الدقيقة. يجب ملء الماصة الدقيقة بمحلول داخل الخلايا وتثبيتها بإحكام في مكانها على مرحلة رأس مكبر الصوت. باستخدام أنبوب متصل بجانب حامل القطب الكهربائي الصغير، استخدم كمية صغيرة من الضغط الإيجابي لمنع انسداد الماصة الدقيقة.

باستخدام مناور ميكروم، حرك الماصة الدقيقة إلى موضعها فوق الخلايا العصبية المستهدفة مباشرة واستمر في عمل ختم جيجا أوم. قم بعمل سجل لمقاومة سلسلة سعة الغشاء ومقاومة الإدخال على النحو المحدد من المنحنى الأسي المثبت على التيار. أثناء نبض اختبار الختم.

قم بتقليل عابر السعة عن طريق ضبط عناصر التحكم في CP السريع و CP البطيء على مكبر الصوت. ثم قم بتبديل مكبر الصوت إلى وضع الخلية بالكامل وقم بتعديل السعة وتعويض المقاومة حتى يتم ملاحظة تيار مسطح أثناء اختبار SEAL. بعد ذلك ، قم بتطبيق تعويض المقاومة المتسلسلة مع تصحيح 70٪ تقريبا ، وتنبؤ بنسبة 70٪ ، وضبط ضوابط تعويض السعة والمقاومة للحفاظ على استجابة ختم اختبار مسطحة.

ثم قم بتبديل مكبر الصوت إلى وضع المشبك الحالي. لاحظ إمكانات غشاء الراحة في حالة عدم وجود حقن حالي. الآن قم بتعيين تيار تثبيت لتثبيت إمكانات الغشاء عند المستوى المطلوب.

قم بتحييد سعة الماصة واضبط توازن الجسر لموازنة انخفاض الجهد. تحقق من خصائص إطلاق الخلايا العصبية عن طريق التحفيز بتيار إزالة الاستقطاب. في هذه المرحلة ، حرك الألياف الضوئية مرة أخرى إلى موضعها بجوار الخلايا العصبية باستخدام برنامج تصوير مقترن بكاميرا CCD تلتقط صورا مركزة على مستوى الخلايا العصبية في البداية ثم تركز على الحافة العلوية للألياف الضوئية.

قم بتحليل الصور لتحديد قيمة دلتا ، وهي موضع الحافة العلوية للألياف الضوئية بالنسبة لمركز الخلية العصبية المستهدفة. من المهم جدا معرفة موضع الألياف الضوئية بدقة. وذلك لأن الطاقة لكل وحدة أو منطقة أو تعرض للإشعاع يتم توصيله إلى الخلية المستهدفة هو معلمة مهمة للتحفيز العصبي بالأشعة تحت الحمراء ، ويمكن أن يتأثر هذا بشكل كبير بموضع الألياف بالنسبة للخلية.

يتم التحكم في هذا الليزر بالطاقة الضوئية عن طريق الكمبيوتر عبر إدخال مباشر لليزر ويمكن تحديده يدويا قبل كل تسجيل. يمكن التحكم في طول النبضة ومعدل التكرار عبر مولد الوظيفة كما هو موضح من قبل ، وتأكد من تسجيل البيانات من كل من قناة مشبك التصحيح وقناة زناد الليزر من نصف إلى 15 مللي ثانية نبضات ليزر عند 0.25 إلى خمسة. عادة ما ينتج عن الملي جول استجابات كهربائية قابلة للقياس. البدايه.

قد يكون من المفيد ضبط معدل تكرار نبضات الليزر على هرتز واحد أو أقل لتقليل التأثيرات غير المرغوب فيها. بمجرد تعيين جميع معلمات الليزر. تابع جمع البيانات.

تستجيب الخلايا العصبية العقدية الحلزونية لإضاءة الليزر بأشكال موجية قابلة للتكرار في كل من مشبك الجهد ومشبك التيار تكوينات التسجيل استجابة لنبضات ليزر 2.5 مللي ثانية 0.8 مللي جول. تنتج الخلية النموذجية تيارا داخليا صافيا عند إمكانات احتفاظ مختلفة. تظهر تسجيلات المشبك الحالية إزالة استقطاب غشاء ثابت على مدار نبضات الليزر هذه ، متبوعا بانخفاض أسي تقريبا نحو إمكانات الغشاء المريح بعد النبض.

في بعض الحالات ، هناك أيضا إزالة استقطاب غشائية إضافية صغيرة بعد نبضة الليزر. قد يؤدي الإضاءة بالطاقة الزائدة أو التعرض لزيادات كبيرة في درجة الحرارة إلى تلف الخلايا الذي لوحظ من خلال تدهور الخصائص الكهربائية للخلية أو الموت الفوري للخلية. باتباع هذا الإجراء ، يمكن تغيير مجموعة من المعلمات البيئية مثل درجة حرارة المحلول أو العوامل الكيميائية لاختبار تأثيرها على النشاط الكهربائي الناجم عن الليزر.

لا تنس أن العمل بالليزر يمكن أن يكون خطيرا ويجب وضع احتياطات السلامة القياسية. وتشمل هذه استخدام نظارات السلامة بالليزر ، وعلامات التحذير ، والتأكد من أن الشعاع لا يتقاطع عن غير قصد مع أي أسطح عالية الانعكاس.